(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及利用一種病毒載體高效、快速地在大型煙草mm中促進(jìn)植物開花來研究單子葉和雙子葉植物開花基因功能的方法，特別涉及利用一種馬鈴薯x病毒在大型煙草mm中表達(dá)單子葉和雙子葉植物ft蛋白促進(jìn)植物開花、研究開花基因的功能，以及應(yīng)用此方法高效、快速篩選ft蛋白功能突變體。

(二)

背景技術(shù)：

通過遺傳工程和dna重組技術(shù)改良植物病毒，構(gòu)建的基于病毒的表達(dá)載體，是研究植物基因功能的有力工具。這種以植物病毒為基礎(chǔ)的基因技術(shù)可以應(yīng)用于促進(jìn)或抑制基因的表達(dá)，導(dǎo)致相關(guān)基因功能獲得或缺失(gainoffunction或lossoffunction)的表型。雖然這種以病毒為基礎(chǔ)的技術(shù)最初主要用在植物中表達(dá)重組亞單位疫苗和藥用蛋白等外源蛋白，但是近年來，以植物rna和dna病毒為基礎(chǔ)的病毒技術(shù)，如病毒誘導(dǎo)的基因沉默(vigs)、microrna-介導(dǎo)的vigs及病毒誘導(dǎo)的基因編輯，已廣泛應(yīng)用于雙子葉和單子葉植物包括一些重要農(nóng)作物的功能基因組研究。除此以外，病毒表達(dá)載體已成為研究植物細(xì)胞rna的移動(dòng)性、以及研究移動(dòng)rna信號(hào)在開花、馬鈴薯塊莖形成和rna沉默中的作用一個(gè)有價(jià)值的工具?；诓《镜幕蚣夹g(shù)也是研究?jī)?nèi)源或外源基因?qū)χ参锷L(zhǎng)發(fā)育、植物對(duì)生物脅迫和病毒dna復(fù)制的有效手段。例如，通過馬鈴薯x病毒(pvx)表達(dá)番茄lehb1，可以把花器官轉(zhuǎn)換成果實(shí)樣結(jié)構(gòu)，揭示了lehb1除了控制果實(shí)成熟外，在花器官發(fā)育中也起重要的作用。

利用病毒技術(shù)也可以研究開花過程中有關(guān)蛋白質(zhì)和rna的功能。開花素在植物開花誘導(dǎo)過程中起重要作用，開花素受環(huán)境因素，如日長(zhǎng)等的調(diào)控。在擬南芥中，開花素是由floweringlocust編碼的蛋白(ft)。許多ft的同源基因已在其他物種中鑒定，如水稻hd3a、番茄sft、煙草ntft4和甜菜bvft2。不同于轉(zhuǎn)基因技術(shù)，以病毒為基礎(chǔ)的技術(shù)也被用來證明ft蛋白具有開花素活性，并且更加快速。例如用小西葫蘆黃花葉病毒(zymv)表達(dá)ft蛋白能誘導(dǎo)葫蘆開花，pvx表達(dá)ft蛋白能促進(jìn)短光照煙草植物nicotinanatabacummarylandmammoth(mm)在非誘導(dǎo)(即不開花)的長(zhǎng)光照條件下開花。這些發(fā)現(xiàn)為我們進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用病毒誘導(dǎo)開花提供了可能性。此后，一些rna和dna病毒，包括蘋果球形潛病毒(applelatentsphericalvirus，alsv)，棉花皺葉病毒(cottonleafcrumplevirus，clcrv)，柑橘葉斑病病毒(citrusleafblotchvirus，clbv)都已用于表達(dá)ft蛋白，并誘導(dǎo)大豆、蘋果、梨、龍膽、桔梗植物、棉花提前開花。這些最新的研究進(jìn)展顯示了病毒誘導(dǎo)開花技術(shù)在農(nóng)作物育種中的應(yīng)用前景。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種馬鈴薯x病毒在篩選植物開花基因以及促開花ft蛋白突變體中的應(yīng)用，能夠高效、快速研究單子葉和雙子葉植物開花基因功能以及篩選促開花ft蛋白突變體。本發(fā)明方法與采用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法相比，不需要繁瑣的轉(zhuǎn)基因及篩選流程，將原本需要7-9個(gè)月的研究植物開花基因的功能的流程縮短為2個(gè)月左右。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種馬鈴薯x病毒在篩選植物開花基因中的應(yīng)用，利用馬鈴薯x病毒在大型煙草mm中表達(dá)ft蛋白促進(jìn)植物開花來研究單子葉和雙子葉植物開花基因功能；以及應(yīng)用此方法高效、快速篩選ft蛋白功能突變體。

進(jìn)一步，所述植物為雙子葉或單子葉植物，優(yōu)選為擬南芥、煙草、水稻或番茄，更優(yōu)選短光照下不開花的大型煙草mm植物。

進(jìn)一步，所述應(yīng)用方法為：將待測(cè)基因克隆到馬鈴薯x病毒載體，經(jīng)過線性化及體外轉(zhuǎn)錄獲得含待測(cè)基因的馬鈴薯x病毒rna并制成病毒溶液；選取2片植物葉片，撒上一層石英砂，滴加病毒溶液，磨擦葉片表面使病毒溶液滲透到葉片表皮中，噴水霧，在23℃、光照16h/d的溫室環(huán)境下生長(zhǎng)，篩選獲得促使植物開花的基因。

進(jìn)一步，所述待測(cè)基因?yàn)閒t蛋白編碼基因或其它控制開花的相關(guān)基因，優(yōu)選ft蛋白來自擬南芥(atft)、番茄(sft)、水稻(hd3a)或煙草(ntft4)。

進(jìn)一步，所述ft蛋白氨基酸序列為seqidno.1、seqidno.7、seqidno.9或seqidno.11所示。

本發(fā)明還提供一種馬鈴薯x病毒在篩選促開花ft蛋白突變體中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用是將ft蛋白突變體克隆到馬鈴薯x病毒載體，然后感染植物葉片，篩選獲得促開花ft蛋白突變體；所述ft蛋白突變體是將ft蛋白進(jìn)行定點(diǎn)或隨機(jī)突變獲得的。優(yōu)選所述ft蛋白突變體是將ft蛋白第27位蘇氨酸(t，seqidno.2)、第85位酪氨酸(y，seqidno.3)、第119位(seqidno.4)或第173位精氨酸(r，seqidno.5)分別突變?yōu)楸彼?a)。

更進(jìn)一步，所述的應(yīng)用為：將ft蛋白突變體克隆到馬鈴薯x病毒，經(jīng)過線性化及體外轉(zhuǎn)錄獲得含ft突變體蛋白編碼基因的馬鈴薯x病毒rna并制成病毒溶液；選取2片植物葉片，撒上一層石英砂，滴加病毒溶液，磨擦葉片表面使病毒溶液滲透到葉片表皮中，噴水霧，在23℃、光照16h/d的溫室環(huán)境下生長(zhǎng)，分析植物開花表型，篩選獲得促開花ft蛋白突變體。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：

本發(fā)明方法與采用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法相比，不需要繁瑣的轉(zhuǎn)基因及篩選流程，將原本需要7-9個(gè)月的研究植物開花基因的功能的流程縮短為大約2個(gè)月。因此，研究植物開花基因功能更為高效、快速，適合對(duì)各種單子葉和雙子葉植物開花基因，以及ft基因各個(gè)氨基酸突變體的功能進(jìn)行研究。

(四)附圖說明

圖1，為本發(fā)明載體構(gòu)建模式圖。

圖2，pvx-atft接種大型煙草mm在長(zhǎng)光照條件下的開花表型。

圖3，pvx-ftr173a，pvx-ftt27a，pvx-fty85a和pvx-ftr119a接種大型煙草mm后5周在長(zhǎng)光照條件下的開花表型(a)及野生型和突變體基因dna序列的確證(b)。

圖4，pvx-hd3a接種大型煙草mm5周在長(zhǎng)光照條件下的開花表型(a)及野生型和突變體基因rt-pcr檢測(cè)和dna序列確證(b)。

圖5，pvx-sft接種大型煙草mm后5周在長(zhǎng)光照條件下的開花表型(a)及野生型和突變體基因rt-pcr檢測(cè)和dna序列確證(b)。

圖6，pvx-ntft4接種大型煙草mm后5周在長(zhǎng)光照條件下的開花表型(a)及野生型和突變體基因rt-pcr檢測(cè)和dna序列確證(b)。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1：利用pvx病毒載體高效、快速研究雙子葉植物開花基因的功能

1、利用trizol(購(gòu)自invitrogen公司)，根據(jù)制造商提供的方法，從擬南芥(arabidopsisthaliana)的葉片中提取總rna，此為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cdna。

2、根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)上登錄的擬南芥ft基因(nm_001334207.1，編碼蛋白氨基酸序列為seqidno.1所示)1-528位區(qū)域的序列設(shè)計(jì)引物，并委托上海英俊公司合成，引物序列信息見表1：

表1引物序列

3、在pcr反應(yīng)中，以第一鏈cdna為模板，rc0061和rc0062為引物。取一個(gè)0.5ml的pcr薄壁管，逐一加入下列試劑：模板dna2μl，10mmol/ldntp混合物0.5μl，20μmol/l上下游引物各0.5μl，5×反應(yīng)緩沖液4μl，2.5u/μlprimerstarhsdna聚合酶0.1μl，加雙蒸水至最終體積20μl；pcr擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：94℃預(yù)變性5min后開始以下循環(huán)反應(yīng)：94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延40s，進(jìn)行25次循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃繼續(xù)延伸10min，再16℃將反應(yīng)液溫度下降；反應(yīng)完畢后，將pcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢查，并對(duì)正確的片段切膠保留。

4、利用pcr產(chǎn)物純化回收試劑盒(購(gòu)自qiagen)，根據(jù)制造商提供的方法，回收得到擬南芥atft的pcr產(chǎn)物。并使用bspei與sali進(jìn)行雙酶切，然后連接到同樣使用bspei與sali雙酶切的馬鈴薯x病毒(potatovirusx，pvx)載體中，隨后通過轉(zhuǎn)化，陽性克隆鑒定以及測(cè)序，得到pvx-atft載體，如圖1所示。

5、制備線性化dna

1)取一個(gè)1.5ml的離心管，逐一加入下列試劑：10×緩沖液10μl，1mg/ml的10×bsa10μl，10unit/μlspei3μl，pvx-atft載體10.5μg，然后加雙蒸水至最終體積100μl；

2)放置37℃培養(yǎng)箱孵育3h；

3)加入同等體積的苯酚/氯仿(phenol/chloroform，v/v25:24)，渦旋30s，最大轉(zhuǎn)速(14000rpm)離心3min；

4)轉(zhuǎn)移上清液至新的0.5ml離心管，加入同等體積的苯酚/氯仿(v/v25:24)，渦旋30s，最大轉(zhuǎn)速(14000rpm)離心3min；

5)轉(zhuǎn)移上清液至新的0.5ml離心管，加入同等體積的氯仿，渦旋30s，最大轉(zhuǎn)速(14000rpm)離心3min；

6)轉(zhuǎn)移上清液至新的1.5ml離心管，加入3mnaac(ph5.2)10μl，100％etoh250μl，混合均勻，放置-70℃冰箱至少1h；

7)最大轉(zhuǎn)速(14000rpm)離心18min，小心去除上清；

8)加70％etoh水溶液100μl清洗小塊，最大轉(zhuǎn)速(14000rpm)離心5min，小心去除上清，晾干；

9)用40μl的無菌雙蒸水溶解小塊，獲得線性化pvx-ft片段。

6、體外轉(zhuǎn)錄

1)取一個(gè)1.5ml的離心管，逐一加入下列試劑：10×緩沖液5μl，40units/μlpnasin1μl，10×ntp4(20mmeachofatp、ctp、utp、2mmgtp)5μl，5mmcap(m7gpppg)5μl，線性化pvx-ft片段2.5μg，然后加rnase-freewater至最終體積46μl；

2)放置37℃孵育5min；

3)加50units/μlt7rnapol，放置37℃孵育25min；

4)加20mmgtp5μl，放置37℃孵育35min；

5)加eb(10mmtris，ph8.5)45μl，酚氯仿提純(同dna線性化時(shí)酚氯仿提純的操作步驟)；

6)用30μl的無菌雙蒸水溶解小塊，獲得pvx-atft病毒rna。

7、本氏煙的病毒接種

1)本氏煙(nicotianabenthamiana)在23℃、長(zhǎng)日照(光照16h/d)的溫室環(huán)境下生長(zhǎng)，選取4-6葉期的健康本氏煙，對(duì)其2片舒展的嫩葉進(jìn)行病毒接種：

2)在幼嫩葉片上均勻撒上薄薄的一層滅菌處理過的石英砂；

3)將步驟6獲取的體外轉(zhuǎn)錄的pvx-atft病毒rna，用槍頭點(diǎn)到葉片上；

4)用戴橡膠手套的雙手食指，一個(gè)食指托著接種葉，另一個(gè)食指在葉面上輕輕磨擦約5下，使病汁液滲透到煙草表皮中；

5)完成接種后，向整個(gè)植株噴水霧讓其自我修復(fù)。

8、大型煙草(nicotinanatabacummarylandmammoth)的病毒接種

1)大型煙草在23℃、長(zhǎng)日照(光照16h/d)的溫室環(huán)境下生長(zhǎng)，同樣選取4-6葉期的健康大型煙草，一般選擇2片正在擴(kuò)大生長(zhǎng)的新生葉進(jìn)行接種；

2)在選好的葉片上均勻撒上薄薄的一層石英砂；

3)取一片步驟7成功接種pvx-atft病毒rna的本氏煙葉片，加入適量eb研磨，研磨均勻汁液。

4)用戴橡膠手套的雙手食指接種步驟3)的汁液，一個(gè)托著接種葉，一個(gè)在葉面上輕輕磨擦約5下，使病汁液滲透到煙草表皮中；

5)最后向整個(gè)植株上噴水霧讓其自我修復(fù)。

9、接種后的大型煙草在長(zhǎng)光照條件下的開花表型觀察

在接種7-14天，大型煙草接種葉及部分新生葉出現(xiàn)褪綠病斑。在接種20天時(shí)，所有接種pvx/ft病毒rna的植株開始抽薹，28天時(shí)開始出現(xiàn)花苞，35天時(shí)有些開始開花?；窘臃N后每7天詳細(xì)觀測(cè)記錄1次植株病毒侵染癥狀，觀察植株生長(zhǎng)狀況等。同樣條件下，以pvx/matft(無義ft突變體，氨基酸序列為seqidno.2所示；圖1)接種為對(duì)照，開花表型參見圖2。只有表達(dá)野生型atft，才可促進(jìn)大型煙草(mm)在長(zhǎng)日照下開花。

實(shí)施例2：利用pvx病毒載體高效、快速研究ft基因各個(gè)氨基酸突變體的功能

1、按照實(shí)施例1方法合成擬南芥第一鏈cdna。

2、根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)上登錄的擬南芥ft基因1-528位區(qū)域的序列設(shè)計(jì)引物，并委托上海英俊公司合成，引物序列信息見表2：

表2引物序列

、按照實(shí)施例1步驟3方法構(gòu)建pvx-ftr173a載體(ftr173a突變體氨基酸序列為seqidno.6所示)，所用引物為rc0061和rc0701；利用重疊pcr方法構(gòu)建pvx-ftt27a(ftt27a氨基酸序列為seqidno.3所示)，pvx-fty85a(fty85a氨基酸序列為seqidno.4所示)和pvx-ftr119a(ftr119a氨基酸序列為seqidno.5所示)載體，具體方法如下：

(1)第一輪pcr擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，取兩個(gè)0.5ml的pcr薄壁管，逐一分別加入下列試劑：5×反應(yīng)緩沖液4μl，10mmol/ldntp混合物0.5μl，模板dna2μl，2.5u/μlprimerstarhsdna聚合酶0.1μl，然后在其中一個(gè)pcr薄壁管中加入20μmol/l的一對(duì)上下游引物rc0061/rc0694或rc0696或rc0700各0.5μl，在另一個(gè)pcr薄壁管中加入20μmol/l的其他一對(duì)上下游引物rc0693或rc0695或rc0699/rc0062各0.5μl，分別再相應(yīng)加雙蒸水至最終體積20μl；

(2)第一輪pcr擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：94℃預(yù)變性5min后開始以下循環(huán)反應(yīng)：94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延40s，循環(huán)25次；循環(huán)結(jié)束后72℃繼續(xù)延伸10min，再16℃將反應(yīng)液溫度下降；

(3)反應(yīng)完畢后，將pcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢查，并對(duì)正確的片段進(jìn)行切膠回收以便進(jìn)行下一輪pcr；

(4)第二輪pcr擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，取一個(gè)0.5ml的pcr薄壁管，逐一再分別加入下列試劑：5×反應(yīng)緩沖液4μl，10mmol/ldntp混合物0.5μl，2.5u/μlprimerstarhsdna聚合酶0.1μl，上一輪pcr的2段產(chǎn)物作為模板dna分別加2μl，20μmol/l上下游引物rc0061和rc0062各0.5μl，再加雙蒸水至最終體積20μl；

(5)第二輪pcr擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：94℃預(yù)變性5min后開始以下循環(huán)反應(yīng)：94℃變性30s，50℃退火4min，72℃延伸10min，循環(huán)3次；然后進(jìn)入另一組循環(huán)反應(yīng)如下：94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，循環(huán)25次；循環(huán)結(jié)束后72℃繼續(xù)延伸5min，再16℃將反應(yīng)液溫度下降；

(6)反應(yīng)完畢后，將pcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢查，并對(duì)正確的片段進(jìn)行切膠回收。

4、按照實(shí)施例1步驟4方法構(gòu)建pvx-ftr173a，pvx-ftt27a，pvx-fty85a和pvx-ftr119a載體，如圖1所示。

5、按照實(shí)施例1步驟5方法制備線性化dna。

6、按照實(shí)施例1步驟6方法進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

7、按照實(shí)施例1步驟7方法進(jìn)行本氏煙的病毒接種。

8、按照實(shí)施例1步驟8方法大型煙草(mm)的病毒接種。

9、按照實(shí)施例1步驟9方法觀察接種后的大型煙草(mm)在長(zhǎng)光照條件下的開花表型。以pvx/matft(無義ft突變體，氨基酸序列為seqidno.2所示；圖1)和eb(mock)接種為對(duì)照，開花表型參見圖3。ftt27a具有正常開花功能，但ftr173a、fty85a和ftr119a都喪失了ft誘導(dǎo)開花功能。

實(shí)施例3：利用pvx病毒載體高效、快速研究單子葉植物開花基因的功能

1、按照實(shí)施例1所述方法分別合成水稻和番茄第一鏈cdna。

2、根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)上登錄的水稻(hd3a)、番茄(sft)和煙草mm(ntft4)ft基因的序列設(shè)計(jì)引物，并委托上海英俊公司合成，引物序列信息見表3：

表3引物序列

3、按照實(shí)施例1步驟3方法獲得hd3a的pcr產(chǎn)物，所用引物為rc0536和rc0537，模板為水稻第一鏈cdna；按照實(shí)施例1方法步驟3獲得sft的pcr產(chǎn)物，所用引物為rc0541和rc0542，模板為番茄第一鏈cdna；按照實(shí)施例1方法步驟3獲得ntft4的pcr產(chǎn)物，所用引物為rc0779和rc0780，模板為煙草mm第一鏈cdna。

4、按照實(shí)施例1步驟4方法構(gòu)建pvx-hd3a(水稻野生型hd3a(ft)蛋白氨基酸序列為seqidno.7所示)，pvx-sft(番茄野生型sft(ft)蛋白氨基酸序列seqidno.9)和pvx/ntft4(煙草野生型ntft4蛋白氨基酸序列seqidno.11)載體，如圖1所示。

5、按照實(shí)施例1步驟5方法制備線性化dna。

6、按照實(shí)施例1步驟6方法進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

7、按照實(shí)施例1步驟7方法進(jìn)行本氏煙的病毒接種。

8、按照實(shí)施例1步驟8方法大型煙草mm的病毒接種。

9、按照實(shí)施例1步驟9方法觀察接種后的mm在長(zhǎng)光照條件下的開花表型。分別以pvx/mhd3a(水稻無意突變體mhd3a(mft)蛋白氨基酸序列seqidno.8)、pvx/msft(番茄無意突變體msft(mft)蛋白氨基酸序列seqidno.10)、pvx/mntft4(煙草無意突變體mntft4(mft)蛋白氨基酸序列seqidno.12)和eb(mock)接種為對(duì)照，開花表型參見圖4-6。只有表達(dá)野生型hd3a、sft或ntft4，才可促進(jìn)大型煙草(mm)在長(zhǎng)日照下開花。

sequencelisting

<110>杭州師范大學(xué)

<120>馬鈴薯x病毒在篩選植物開花基因及促開花ft蛋白突變體中的應(yīng)用

<130>

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>175

<212>prt

<213>unknown

<220>

<223>人工序列

<400>1

metserileasnileargaspproleuilevalserargvalvalgly

151015

aspvalleuasppropheasnargserilethrleulysvalthrtyr

202530

glyglnarggluvalthrasnglyleuaspleuargproserglnval

354045

glnasnlysproargvalgluileglyglygluaspleuargasnphe

505560

tyrthrleuvalmetvalaspproaspvalproserproserasnpro

65707580

hisleuargglutyrleuhistrpleuvalthraspileproalathr

859095

thrglythrthrpheglyasngluilevalcystyrgluasnproser

100105110

prothralaglyilehisargvalvalpheileleupheargglnleu

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