檢測(cè)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒real-time RT-PCR特異引物及探針和檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子檢測(cè)引物、檢測(cè)探針及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 馬鈴薯是無性繁殖作物，由于病毒和類病毒侵染并通過塊莖無性繁殖逐代增殖， 從而造成馬鈴薯的退化，嚴(yán)重影響了馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)。多數(shù)病原病害可以通過莖尖剝 離、組織培養(yǎng)來汰除。但是，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒?。≒otatospindletuberviroid， PSTVd)是唯一不能/很難通過莖尖剝離、組織培養(yǎng)來汰除的，而到目前為止，還沒有特效藥 來防治，只能通過嚴(yán)格檢測(cè)生產(chǎn)健康的種薯來汰除。因此，高效、快速、靈敏、易于推廣的檢 測(cè)技術(shù)對(duì)于防治PSTVd來講尤為重要。
[0003] 目前，檢測(cè)馬鈴薯類病毒主要有生物學(xué)檢測(cè)、電子顯微鏡、往返電泳（R-PAGE)、 RT-PCR、NASH(核酸斑點(diǎn)雜交）和real-timeRT-PCR等方法，這些方法中，real-time RT-PCR是靈敏度最高的方法，該方法將PCR與熒光檢測(cè)方法結(jié)合，以其特異性高和靈敏度 高（是普通RT-PCR的1000倍左右）、可定量及自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、微生物和 動(dòng)植物疾病檢疫方面得到廣泛應(yīng)用。但是，目前并沒有采用該技術(shù)應(yīng)用到PSTVd中，用以檢 測(cè)PSTVd的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明首次將real-timeRT-PCR技術(shù)應(yīng)用到檢測(cè)PSTVd中，通過該方法建立的 PSTVdreal-timeRT-PCR檢測(cè)體系大大提高了PSTVd檢測(cè)的靈敏度，為PSTVd的防控工作 提供了技術(shù)保障。
[0005] 本發(fā)明的檢測(cè)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒real-timeRT-PCR特異引物及探針，所述的 引物序列如序列表SeqIDNo:l所不和SeqIDNo:2所不，所述的探針序列如序列表Seq IDNo: 3 所示。
[0006] 本發(fā)明的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒real-timeRT-PCR檢測(cè)方法，它是按照以下步驟 進(jìn)行的：
[0007] 一、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：
[0008] (1)提取待檢測(cè)的馬鈴薯塊莖和試管苗RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為模板；
[0009] (2)采用步驟（1)的模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增后的目的片段進(jìn)行回收，連接 至PMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，提取質(zhì)粒DNA，獲得馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè) 用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；
[0010] (3)以獲得的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，利用權(quán)利要求1的real-timeRT-PCR特異引物及 探針，進(jìn)行熒光定量PCR，采集熒光信號(hào)，采用BioEdit軟件繪制出實(shí)時(shí)熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0011] 二、判定陽性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)
[0012] 當(dāng)擴(kuò)增效率達(dá)到90%~110%，斜率為-3. 3,陰性對(duì)照不起峰時(shí)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及 Cp值計(jì)算馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的含量，通過real-timeRT-PCR進(jìn)行分析直接進(jìn)行結(jié)果 判斷。
[0013] 本發(fā)明的判定陽性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)中根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及Cp值準(zhǔn)確計(jì)算PSTVd的含量， 該結(jié)果在儀器輸出的檢驗(yàn)報(bào)告中給出，可直接判讀具體的拷貝數(shù)。每次檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線均需 重新擴(kuò)增。
[0014] 本發(fā)明包含以下有益效果：
[0015] 本發(fā)明通過設(shè)計(jì)的引物和探針，成功建立了PSTVd的real-time RT-PCR檢測(cè)體 系，該體系的建立豐富了我國(guó)PSTVd的檢測(cè)技術(shù)，與靈敏度相對(duì)較高的RT-PCR技術(shù)相比，檢 測(cè)靈敏度又提升了 100~1000倍。
[0016] 本發(fā)明根據(jù)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVd)基因序列，設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物和1 條探針，探針5'端采用FAM標(biāo)記，3'端采用TAMRA標(biāo)記。利用NY/T1962- 2010--《馬 鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)》中規(guī)定的RT-PCR方法擴(kuò)增目的片段，回收，轉(zhuǎn)化，鑒定，并測(cè)序， 利用該目的片段與PMD18-T連接，制備了PSTVd與pMD18-T的重組質(zhì)粒。利用該質(zhì)粒采用 連續(xù)稀釋法制備real-timeRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)品。經(jīng)篩選，從3對(duì)引物中篩選出1對(duì)最佳引物， 并據(jù)此建立了PSTVd的real-timeRT-PCR檢測(cè)體系。該體系經(jīng)穩(wěn)定性測(cè)試，Cp值的變異系 數(shù)（CV)分別為 1. 64%、0. 61%、1. 80%、0. 47%、0. 92%、1. 11%、1. 45%和 0? 98%，表明檢 測(cè)方法具有非常好的穩(wěn)定性。該體系檢測(cè)靈敏度達(dá)31c〇pieS/yL，用已知的22試管苗和休 眠塊莖作為樣品進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果全部吻合。本發(fā)明建立的PSTVdreal-timeRT-PCR 檢測(cè)體系大大提高了PSTVd檢測(cè)的靈敏度，為PSTVd的防控工作提供了技術(shù)保障。
[0017] 本發(fā)明首次將real-time RT-PCR技術(shù)應(yīng)用于PSTVd中，可以檢測(cè)到PSTVd含量極 低的材料，對(duì)于珍貴的核心種苗等重要資源PSTVd的鑒定非常重要，可以把損失降低到最 小，極早發(fā)現(xiàn)問題，解決問題，確保脫毒種薯/苗的生產(chǎn)進(jìn)程，保障種薯/苗的質(zhì)量。另外， 該技術(shù)體系的建立對(duì)于PSTVd在寄主體內(nèi)的復(fù)制及致病力研究等領(lǐng)域也有重要意義。
【附圖說明】
[0018]圖1為轉(zhuǎn)化的菌落圖；
[0019] 圖2為未經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞直接涂布對(duì)照?qǐng)D；
[0020] 圖3為陽性菌落PCR鑒定結(jié)果電泳圖，其中，M為Marker，大小為100bp，1-18泳道 分別為轉(zhuǎn)化的各菌落，大小為359bp;
[0021] 圖4為以 PSTV231F，PSTV296R為引物的real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0022] 圖5為以 PSTV234F，PSTV350R為引物的real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0023]圖6為以 PSTV234F，PSTV356R為引物的real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0024] 圖7為靈敏度測(cè)試圖；
[0025] 圖8為利用建立的real-time RT-PCR體系檢測(cè)PSTVd的擴(kuò)增曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 本
【發(fā)明內(nèi)容】
不僅限于上述各實(shí)施方式的內(nèi)容，其中一個(gè)或幾個(gè)【具體實(shí)施方式】的組 合同樣也可以實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的。
[0027]
【具體實(shí)施方式】一：本實(shí)施方式的檢測(cè)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒real-time RT-PCR 特異引物及探針，所述的引物序列如序列表SeqIDNo:1所不和SeqIDNo:2所不，所述的 探針序列如序列表SeqIDNo:3所不。
【具體實(shí)施方式】 [0028] 二：本實(shí)施方式的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒real-timeRT-PCR檢測(cè) 方法，它是按照以下步驟進(jìn)行的：
[0029] 一、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：
[0030](1)提取待檢測(cè)的馬鈴薯塊莖和試管苗RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為模板；
[0031] (2)采用步驟⑴的模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增后的目的片段進(jìn)行回收，連接 至PMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，提取質(zhì)粒DNA，獲得馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè) 用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；
[0032] (3)以獲得的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，利用權(quán)利要求1的real-timeRT-PCR特異引物及 探針，進(jìn)行熒光定量PCR，采集熒光信號(hào)，采用BioEdit軟件繪制出實(shí)時(shí)熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0033] 二、判定陽性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)
[0034] 當(dāng)擴(kuò)增效率達(dá)到90%~110%，斜率為-3. 3,陰性對(duì)照不起峰時(shí)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及 Cp值計(jì)算馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的含量，通過real-timeRT-PCR進(jìn)行分析直接進(jìn)行結(jié)果 判斷。
【具體實(shí)施方式】 [0035] 三：本實(shí)施方式與二不同的是：所述的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè) 儀為L(zhǎng)ightCycler480IIreal-timePCR儀。其它與二相同。
[0036]
【具體實(shí)施方式】四：本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】二不同的是：所述的PCR反應(yīng)體系 如下：
[0037]
[0038]PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5。(： 10min，l個(gè)循環(huán)，95。(： 10sec，55°C50sec，72°Clsec，45 個(gè) 循環(huán)。其它與【具體實(shí)施方式】二相同。
【具體實(shí)施方式】 [0039] 五：本實(shí)施方式與二不同的是：步驟一中所述的待檢 測(cè)的馬鈴薯塊莖和試管苗為PSTVd陽性馬鈴薯塊莖和試管苗。其它與二相 同。
【具體實(shí)施方式】 [0040] 六：本實(shí)施方式與二不同的是：步驟一中進(jìn)行PCR擴(kuò) 增的引物為PSTVd0054R和PSTVd0055-3F;序列為：
[0041]PSTVd0054R:5, -GGATCCCTGAAGCGCTCCTCCGAGCCG-3,；
[0042]PSTVd0055-3F:5' -CCGGGGAAACCTGGAGCGAACTGG-3'。其它與【具體實(shí)施方式】二相 同。
【具體實(shí)施方式】 [0043] 七：本實(shí)施方式與二不同的是：步驟一中對(duì)PCR擴(kuò)增 后的目的片段進(jìn)行回收是通過Tiangen公司的離心柱型瓊脂糖凝膠回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn) 物進(jìn)行回收、純化的。其它與二相同。
【具體實(shí)施方式】 [0044] 八：本實(shí)施方式與二不同的是：步驟一中連接反應(yīng)體 系為 10yL，其中，pMD18-TVector為 0.8yL，PCR純化產(chǎn)物為 4yL，ddH20為 1.2yL; SolutionI為5yL;反應(yīng)條件為4°C條件下連接過夜。其它與二相同。
【具體實(shí)施方式】 [0045] 九：本實(shí)施方式與二不同的是：對(duì)馬鈴薯紡錘塊莖類 病毒的real-timeRT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行靈敏度測(cè)試。其它與二相同。
[0046] 本實(shí)施方式對(duì)選出的Real-time RT-PCR體系進(jìn)行靈敏度測(cè)試，方法為：利用濃 度較低的標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)計(jì)算，