專利名稱：具有降低的α葡聚糖L－或H－型塊莖磷酸化酶活性水平的低冷甜化轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是關于通過降低馬鈴薯植株中α葡聚糖L-型塊莖磷酸化酶或α葡聚糖H-型塊莖磷酸化酶水平而抑制馬鈴薯中糖的積累。
背景技術：
由廣泛多種因素如疾病，環(huán)境和馬鈴薯塊莖(Solanum tuberosum)貯藏引起的植物脅迫，是塊莖品質(zhì)的主要決定因素。收獲至出芽之間的休眠期間對保持馬鈴薯的品質(zhì)是關鍵性的。對馬鈴薯的處理通常是貯藏在7-12℃。與在7-12℃貯藏相比較，在2-6℃冷貯藏通過降低呼吸，減少水分喪失，減少微生物感染，減少發(fā)熱損耗，以及給予化學出芽抑制劑，可提供最長的耐久保存(Burton，1989)。但是，低溫會導致冷誘發(fā)性甜化，并且形成的高糖水平會促使其油炸產(chǎn)品出現(xiàn)不可接受的褐色或黑色(Coffin et al.，1987，Weaver et al.，1978)。所積累的糖主要是葡萄糖，果糖和蔗糖。首先是葡萄糖和果糖(還原糖)，當在各種烹調(diào)處理如油炸過程中受熱時，經(jīng)由Maillard反應過程與游離的氨基發(fā)生反應，導致生成褐色色素(Burton，1989，Shallenberger et al.，1959)。蔗糖在油炸時由于焦糖化作用和炭化產(chǎn)生黑色。理想的還原糖含量一般認為是塊莖濕重的0.1％，上限為0.33％，更高的還原糖含量就足以引起形成褐色和黑色色素，導致不可接受的油炸產(chǎn)品(Daviesand Viola，1992)。雖然在較高的溫度(7-12℃)下貯藏可減慢還原糖的積累，但是這樣會增加微生物感染，并需要使用生芽抑制劑。考慮到與化學劑使用相關的環(huán)境危害和對健康的威脅，殺滅劑抗性病原體的形成，以及現(xiàn)行使用的出芽抑制劑可能即將被禁止的事實，需要有一種的馬鈴薯品種，它能經(jīng)受脅迫和長時間冷貯存不必使用化學藥劑，沒有還原糖的積累，并且對淀粉有較好的保存。
植物細胞中碳水化合物的代謝是一個復雜的過程?？刂贫喾N不同的酶促反應過程都有可能影響冷貯藏過程中還原糖的積累，例如，抑制淀粉分解可減少游離糖的形成。通過降低糖含量的其它一些方法也可用于提高馬鈴薯的冷貯藏性能，包括用還原糖再合成淀粉，通過酵解和呼吸除去糖類，或者將糖轉(zhuǎn)化成不能參與Maillard反應的其它形式。但是，許多酶促反應過程都是可逆的，并且對涉及碳水化合物代謝的絕大多數(shù)酶的作用尚缺乏了解。困難所在仍然是要找到一種酶，它能給予所希望的結(jié)果，能在低溫下發(fā)揮功能，仍然使產(chǎn)品保持生產(chǎn)者，加工者和消費者所要求的品質(zhì)。
已有人提出，磷酸果糖激酶(PFK)在冷誘發(fā)的甜化過程中起重要作用(Kruger and Hammond，1988，ap Rees et al.，1988，Dixon et al.，1981，Claassen et al.，1991)。ap Reese et al.(1988)指出，冷處理對碳水化合物代謝中的不同途徑具有不均衡的作用，其中由于PFK的冷敏感性，酵解過程比較強烈地被降低了。然后，PFK活性降低將導致用于蔗糖生成的可利用的己糖-磷酸增加。歐洲專利0438904(Burrell et al.1991，7，31)中公布的內(nèi)容是，在貯藏過程中增加PFK活性，通過酵解和進一步代謝除去己糖可減少糖的積累。源于E.Coli的PFK可在馬鈴薯塊莖中表達，并且此專利報告聲稱，在收獲季節(jié)測定出PFK活性增加了，蔗糖含量降低了。但是已表明，在低溫下焦磷酸果糖6磷酸轉(zhuǎn)移酶(PFP)仍有活性(Claassen et al.，1991)。象PFK一樣，PFP也能為酵解提供果糖6磷酸，因為這二個酶催化相同的反應。因此，這種改善冷貯存塊莖品質(zhì)的策略，其效果仍值得懷疑。而且，通過酵解和進一步代謝除去糖，并不是提高馬鈴薯塊莖貯存性質(zhì)的優(yōu)選方法，因為通過呼吸作用會導致有用干物質(zhì)的喪失。
還表明ADP葡萄糖焦磷酸化酶(ADPGPP)在冷誘發(fā)的甜化過程中有重要的作用。在國際專利申請WO 94/28149中(Barry，et al.，1994，5，18提交)曾公布，在貯存中增加ADPGPP活性，通過用還原性糖再合成淀粉可減少糖的積累。源于E.Coli的ADPGPP可在冷誘導性啟動子的控制下在馬鈴薯塊莖中表達，此專利報告聲稱，在收獲時和在低溫貯存后測定時表明塊莖中ADPGPP活性增加了，還原性糖的含量較低。但是，此方案不是消除淀粉的分解代謝，而是代之增加淀粉再合成的速度。因此，通過酵解和呼吸進行糖分解代謝，再摻入淀粉的過程受到限制。上調(diào)ADPGPP不是提高馬鈴薯塊莖貯存性質(zhì)的優(yōu)選方法，因為通過呼吸作用會導致有用干物質(zhì)的喪失。再次表明，涉及降低淀粉分解代謝的方法是優(yōu)選的，因為干物質(zhì)可被保存。
據(jù)認為淀粉降解涉及到幾個酶，包括α淀粉酶(內(nèi)淀粉酶)，β-淀粉酶(外淀粉酶)，淀粉葡糖苷酶和α-葡聚糖磷酸化酶(淀粉磷酸化酶)。通過減緩淀粉分解代謝，可防止還原性糖的積累，并且可使通過酵解和進一步代謝對糖的清除作用減到最小。
已經(jīng)描述了三種不同的α葡聚糖磷酸化酶的同功酶。塊莖L-型α1，4葡聚糖磷酸化酶(EC2.4.1.1)同功酶(GLTP)(Nakano andFukui，1986)對高度分支葡聚糖如糖原具有低親和性，存在于肌漿中。其單體由916個氨基酸組成，與源于兔肌肉和E.Coli的磷酸化酶進行序列比較表明具有高水平的同源性，分別有51％和40％的氨基酸同源性。此GLTP基因的核苷酸序列和GLTP酶的氨基酸序列分別顯示在SEQID NO1和SEQ ID NO2中。H-型塊莖α葡聚糖磷酸化酶的同功酶H(GHTP)(Mori et al.，1991)對糖原具有高親和性，定位于細胞質(zhì)中。該基因編碼838氨基酸，顯示與塊莖L-型磷酸化酶有63％的序列同源性，但發(fā)現(xiàn)在L-型多肽中缺少插入的78-殘基和50-殘基氨基端的延伸。此GHTP基因的核苷酸序列和GHTP酶的氨基酸序列分別顯示在SEQ ID NO3和SEQ ID NO4中。已有報導(Sonnewald et al.，1995)第三個同功酶由974個氨基酸組成，與塊莖L-型磷酸化酶高度同源，對絕大多數(shù)多肽有81％的相同性。但是，含有過渡肽和插入序列的區(qū)域高度可變。此同功酶被稱為葉L-型磷酸化酶，因為其mRNA在葉和塊莖中同樣地積累，而塊莖L-型磷酸化酶的mRNA在馬鈴薯塊莖中大量積累，在葉組織中只有微弱的積累。塊莖L-型磷酸化酶主要存在于塊莖中，葉L-型磷酸化酶在葉中較豐富(Sonnewald et al.，1995)。葉L-型磷酸化酶基因的核苷酸序列和葉L-型磷酸化酶的氨基酸序列分別顯示在SEQ ID NO5和SEQ IDNO6中。
對各種淀粉降解酶的作用尚不了解，但是對相矛盾的結(jié)果已有相當多的爭論。例如，降低葉L-型磷酸化酶的表達(Sannewald et al.，1995)對淀粉積累沒有顯著的影響。Sonnewald等(1995)曾報導，葉L-型基因特異性的反義RNA的組成型表達，導致葉組織中α葡聚糖L-型磷酸化酶活性大大降低了，但是對馬鈴薯塊莖組織中的酶沒有影響。因為α葡聚糖磷酸化酶活性的反義抑制，對轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株葉中的淀粉積累沒有顯著的影響，所以該作者得出結(jié)論，淀粉降解不是由磷酸化酶催化的。鑒于已確定的α葡聚糖磷酸酶的同功酶具有高水平的序列同源性，預料對于H-型(GHTP)和L-型塊莖(GLTP)同功酶也含有類似的陰性反應。
根據(jù)上面所述，仍然需要這樣一種馬鈴薯植株，它能產(chǎn)生在以下條件下顯示出低的淀粉向糖轉(zhuǎn)化作用的塊莖在繁殖過程中，以及在室溫和低溫特別是在低于7℃的溫度下貯存過程中。
發(fā)明概述本發(fā)明者驚奇地發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯塊莖內(nèi)α葡聚糖L-型塊莖磷酸化酶(GLTP)或α葡聚糖H-型塊莖磷酸化酶(GHTP)活性水平降低，可導致在繁殖和貯存過程中，相對于野生型馬鈴薯，特別是在10℃以下，在4℃貯存時，塊莖內(nèi)糖的積累顯著地降低。值得注意的是，在塊莖中復雜的碳水化合物代謝之下，單個酶活性降低對減少塊莖中糖的積累有效。就Sonnewald等(1995)以前所述的工作而論，本發(fā)明者的發(fā)現(xiàn)更加令人吃驚，他們報導，降低對葉L-型磷酸化酶的表達對馬鈴薯植株葉中淀粉的積累沒有顯著的影響。
本發(fā)明可提供巨大的商業(yè)利益。其冷誘發(fā)的甜化被抑制或降低的塊莖，可貯存在較低的溫度下，而塊莖中不會產(chǎn)生高水平的還原糖，這種還原糖引起馬鈴薯油炸產(chǎn)品出現(xiàn)令人難以接受的黑色。塊莖冷貯存可延長貯存時間，通過限制呼吸和延遲出芽而延長休眠期，還可降低發(fā)病率。
可通過多種已知方法中的任何一種，實現(xiàn)降低馬鈴薯植株和塊莖中GLTP或GHTP活性的目的，包括但不局限于GLTP或GHTP mRNA的反義抑制法，共抑制法，野生型GLTP或GHTP基因的位點定向誘變，化學的或蛋白質(zhì)抑制法，或者通過植物育種程序。
因此，概括地說，本發(fā)明提供了一種經(jīng)修飾的馬鈴薯植株，與未修飾的馬鈴薯植株產(chǎn)生的塊莖相比較，此植株產(chǎn)生的塊莖中具有較低水平的α葡聚糖L-型塊莖磷酸化酶(GLTP)或α葡聚糖H-型塊莖磷酸化酶(GHTP)活性。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了以一種表達盒轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植株，此表達盒具有有效地連接了一個DNA序列的植物啟動子序列，此DNA序列當在植株中轉(zhuǎn)錄時，將抑制內(nèi)源性GLTP基因或GHTP基因的表達。如在后面詳述中還要論述的，上述DNA序列可按有義或反義取向插入此表達盒?？墒贡景l(fā)明的馬鈴薯植株其GLTP或GHTP之一單獨降低活性水平，或者也可使其GLTP和GHTP都降低活性水平。
如上面所述，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯植株中GLTP或GHTP酶活性水平降低，可導致馬鈴薯塊莖中，特別是在低于10℃的溫度長期貯存時糖的積累降低。因此，本發(fā)明進一步擴展，提供一種方法，用于降低馬鈴薯植株所產(chǎn)生的塊莖中糖的生成，包括降低此馬鈴薯植株中GLTP或GHTP的活性水平。在優(yōu)選的實施方案中，這種方法包括將一個表達盒導入馬鈴薯植株，此表達盒具有有效地連接于一個DNA序列的植物啟動子序列，此DNA序列在植株中轉(zhuǎn)錄時將抑制內(nèi)源性GLTP基因或GHTP基因的表達。如上所述，此DNA序列可以按有義或反義取向插入此表達盒中。
如在本文實施例中所詳述的，在通過本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化的馬鈴薯品種Desiree中，已經(jīng)看到了冷貯存特征的改善。冷貯存特征改善的直接測定指標，是在收獲后的冷貯存后所檢測的GLTP或GHTP酶活性水平的降低。與未轉(zhuǎn)化植株塊莖中在同樣條件下貯存后的總α葡聚糖磷酸化酶活性相比較，已形成的轉(zhuǎn)化馬鈴薯品種，其植株塊莖中表示為所產(chǎn)生μmolNADPH/mg蛋白質(zhì)/小時的總α葡聚糖磷酸化酶活性，在4℃貯存189天后降低達70％。
冷貯存特征改善的另一個比較直接的測定指標是，冷貯存一段時間之后所觀察到的馬鈴薯甜化降低。與未轉(zhuǎn)化植株塊莖中在同樣條件下貯存后的葡萄糖和果糖總濃度相比較，已形成的轉(zhuǎn)化馬鈴薯品種其塊莖中葡萄糖和果糖總濃度，在4℃貯存91天后降低了39％。
還有一個證明本發(fā)明實際好處的冷貯存特征改善的鑒定指標是，在加工(烹調(diào))過程中馬鈴薯片變黑程度降低。如前面所述，冷貯存過程中馬鈴薯中糖的積累會促使其油炸產(chǎn)品令人難以接受地變黑。以油炸馬鈴薯片的反射率為測定指標或薯片記分，可對油炸變黑程度降低作定量測定。在此將對測定薯片記分的技術進行論述。與未轉(zhuǎn)化植株塊莖在同樣條件下的薯片記分相比較，本發(fā)明形成的轉(zhuǎn)化馬鈴薯品種，其植株塊莖的薯片記分在4℃貯存124天后升高達89％。
通過降低馬鈴薯植株的塊莖中GLTP和/或GHTP活性，因此而抑制在低溫貯存過程中的糖積累，本發(fā)明允許在比相同栽培種的野生型馬鈴薯更低的溫度下貯存馬鈴薯。如上所述，在此傳統(tǒng)所用的較低的溫度下貯存馬鈴薯，可導致通過降低呼吸和生芽而增加貯存時間，延長休眠期，以及降低發(fā)病率。顯然，對于本領域的技術人員，這樣一些附加的好處也構(gòu)成了改善的冷貯存特征，并可通過已知的技術量度和定量測定。
附圖簡述將用如下附圖對本發(fā)明的實施方案進行說明


圖1是插入pBI121轉(zhuǎn)化載體的塊莖L-型α葡聚糖磷酸化酶反義序列的示意圖；圖2是插入pBI121轉(zhuǎn)化載體的塊莖H-型α葡聚糖磷酸化酶反義序列的示意圖；圖3顯示三個分離的葡聚糖磷酸化酶同功酶的基本結(jié)構(gòu)。過渡肽(TS)和插入序列(IS)是L-型磷酸化酶的特征，在H-型磷酸化酶中未發(fā)現(xiàn)。百分數(shù)指示各同工型之間核酸序列的同源性；圖4是馬鈴薯中碳水化合物相互轉(zhuǎn)化的圖解(Sowokinos 1990)；圖5是馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)的三個磷酸化酶同工型-區(qū)域氨基酸序列的比較，此區(qū)域是在此用于實施例中的反義GLTP結(jié)構(gòu)所針對的區(qū)域。標明的氨基酸都相同。上面是葉L-型α葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO6的氨基酸21-238)，中間是塊莖L-型α葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO2的氨基酸49-266)，下面是塊莖H-型α葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO4的氨基酸46-264)；圖6A和6B是馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)的三個磷酸化酶同工型某區(qū)域核苷酸序列的比較，此區(qū)域是在此用于實施例中的反義GLTP結(jié)構(gòu)所針對的區(qū)域。標明的核苷酸都相同。上面是葉L-型α葡聚糖磷酸化酶的核苷酸序列(SEQ ID NO5的核苷酸389-1045)，中間是塊莖L-型α葡聚糖磷酸化酶的核苷酸序列(SEQ ID NO1的核苷酸338-993)，下面是塊莖H-型α葡聚糖磷酸化酶的核苷酸序列(SEQ ID NO3的核苷酸147-805)；圖7是聚腺苷酸化RNA的northern印跡，此種RNA是從野生型，以及用塊莖L-型α葡聚糖磷酸化酶轉(zhuǎn)化的品系3，4，5和9的馬鈴薯塊莖中分離出的。是用放射性標記的塊莖L-型α葡聚糖磷酸化酶特異性探針進行印跡探測；圖8是總RNA的norther印跡，此種RNA是從野生型，以及用H-型α葡聚糖磷酸酶轉(zhuǎn)化的品系1和2的馬鈴薯塊莖中分離出的。是用放射性標記的H-型α葡聚糖磷酸化酶特異性探針進行印跡探測；圖9顯示從如下品系的大田生長塊莖，在4℃貯存86天后得到的油炸產(chǎn)品(A)野生型和塊莖L-型α葡聚糖磷酸化酶轉(zhuǎn)化體，(B)ATL1，(C)ATL3，(D)ATL4，(E)ATL5，(F)ATL9，(“ATL”＝反義塊莖L-型轉(zhuǎn)化體)；
圖10顯示α1，4葡聚糖磷酸化酶L-型和H-型同功酶的活性凝膠電泳和免疫印跡，這種酶是從野生型塊莖和用L-型同工型反義構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的塊莖中提取的；
圖11顯示α1，4葡聚糖磷酸化酶L-型和H-型同功酶的活性凝膠電泳和免疫印跡，這種酶是從野生型塊莖和用H-型同工型反義構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的塊莖中提取的。
優(yōu)選實施方案的詳述提供了一種馬鈴薯植株，由此植株產(chǎn)生的塊莖，與未修飾的馬鈴薯植株產(chǎn)生的塊莖相比較，具有降低水平的α葡聚糖L-型塊莖磷酸化酶(GLTP)或α葡聚糖H-型塊莖磷酸化酶(GHTP)活性。在此例證性情況下，是通過以一個表達盒轉(zhuǎn)化馬鈴薯植株來實現(xiàn)降低α葡聚糖磷酸化酶活性的目的，此表達盒具有有效地連接于一個DNA序列的植物啟動子序列，此DNA序列在植株中轉(zhuǎn)錄時將抑制內(nèi)源性GLTP基因或GHTP基因的表達。雖然在此例證性情況下，此DNA序列是按反義取向插入表達盒，但是，此DNA序列按有義或反義取向插入表達盒都能達到降低α葡聚糖磷酸化酶活性的目的。1.同源依賴性沉默用有義或反義基因片段控制基因表達是標準的實驗室措施，在文獻中已被大量資料確證。反義和有義抑制是二個基因序列的同源-依賴性現(xiàn)象，可被描述為“同源-依賴性沉默”現(xiàn)象。
1996年發(fā)表的一篇科學研究論文的述評，提及幾百篇有關轉(zhuǎn)基因植物中同源-依賴性沉默的報告。雖然對奠定同源-依賴性沉默基礎的機理尚未完全理解，但是已在許多植物基因中研究了此現(xiàn)象的特征，并且對這些工作的主要部分已作了廣泛的評述(Meyer and Saedler 1996，Matzke and Matzke 1995，Weintraub 1990，Van der Krol et al 1988)。同源-依賴性沉默看來是可用于控制許多內(nèi)源性基因活性的普遍現(xiàn)象。在導入同源序列后表現(xiàn)出降低表達的基因?qū)嵗ǘ潼S烷醇還原酶(Van der Krol 1990)，多聚半乳糖醛酸酶(Smith et al 1990)，八氫蕃茄紅素合成酶(Fray and Grierson 1993)，果膠酯酶(Seymour etal 1993)，苯丙氨酸氨裂解酶(De Carvalho et al.1992)，β-1，3-葡聚糖酶(Hart et al.1992)，幾丁質(zhì)酶(Dorlhac et al.1994)，硝酸還原酶(Napoli et al.1990)，以及苯基苯乙烯酮合成酶(14)。已有報告表明，以馬鈴薯卷葉病病毒的包被蛋白基因的有義或反義構(gòu)建體轉(zhuǎn)化Russet Burbank馬鈴薯植株，可賦予植株對馬鈴薯卷葉病病毒感染的抗性(Kawchuk et al.1991)。同源有義或反義序列的轉(zhuǎn)移通?？僧a(chǎn)生具有降低內(nèi)源性基因表達的轉(zhuǎn)化體，如在此實施例中所詳述的，表現(xiàn)出指示降低GLTP或GHTP表達的轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植株易被鑒定。
在反義抑制技術中，裝配了一種基因構(gòu)建體或表達盒，當它包括入植物細胞時，將導致與由靶基因產(chǎn)生的mRNA互補的RNA序列的表達。推理認為，由于此互補的RNA序列形成了雙螺旋，因此抑制了蛋白質(zhì)翻譯過程。在文獻中，包括“反義研究及其應用”(CRC出版，1993)pp.125-148，已對決定有義和反義抑制基礎的理論進行了論述。此互補序列的長度可以是與靶基因的全部序列相同，但是一個片段通常是足夠的，而且操作更方便。例如，Cannon等(1990)揭示，短至41個堿基對的反義序列就足以達到基因抑制的目的。美國專利號5,585,545(Bennett et al.，December 1996)描述了借助于只有21個堿基對的反義序列的基因抑制作用。在專利文獻中，有很多對用于通常將反義序列導入機體而抑制劑基因表達的方法進行描述和申請專利保護的例子包括例如，美國專利號5,545,815(Fischer et al.，1996年8月13日)和美國專利號5,387,757(Bridges et al.，1995年2月7日)。
有義序列的同源-依賴性沉默可按照與反義抑制相類似的方式進行，不同的是將核苷酸序列按正常有義取向插入表達盒。包括美國專利5,034,323，5,231,020和5,283,184在內(nèi)的許多專利公開了導入有義序列而導致基因表達抑制的方法。
同源-依賴性沉默的二種形式，有義和反義抑制都可用于實現(xiàn)本發(fā)明下調(diào)GLTP或GHTP的目的。本領域的人員知道，這二種技術對基因抑制是同等有效的策略。例如，美國專利號5,585,545(Bennett et al.，1996，12，17)和美國專利號5,451,514(Boudet et al.，1995，9，15)，都對類似于有義和反義抑制技術的用于抑制基因表達的方法，或?qū)υ谝种苹虮磉_方法中有用的重組DNA序列申請了專利保護。2.用于降低塊莖中GHTP和/或GLTP活性的替代技術雖然同源-依賴性沉默是本發(fā)明用于下調(diào)馬鈴薯植株中GLTP或GHTP的優(yōu)選技術，但是，另外幾種通常采用的策略也可用于降低特異性基因產(chǎn)物的活性，本領域的專業(yè)人員將意識到它們也適合于本發(fā)明。將相關的基因或啟動子插入植物，可誘發(fā)同源的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄物的快速周轉(zhuǎn)，是一種被稱為共抑制作用的過程，并據(jù)信與負責反義RNA抑制的機制有許多相似之處(Jorgensen，1995，Brusslan and Tobin，1995)。DNA的各種調(diào)節(jié)序列都可以改變(啟動子，聚腺苷酸化信號，轉(zhuǎn)錄后加工部位)，或者可用于改變特異性mRNA的表達水平(增強和抑制)。另一種降低基因表達和減少其編碼蛋白的策略是用核酶消化，特異性地斷開靶標mRNA，使它不能產(chǎn)生功能完整的蛋白質(zhì)(Hasseloff and Gerlech1988)。對一種已鑒定是決定某特異性品質(zhì)的重要酶，可通過鑒別其天然存在的等位基因，或形成基因工程等位基因，改變其活性水平，并用于經(jīng)典的育種程序(Oritz and Huaman，1994)。位點定向誘變法也常用于改變某一被鑒定的基因產(chǎn)物的活性?？稍贓.Coli或其它適合的宿主內(nèi)，使磷酸化酶的結(jié)構(gòu)編碼序列發(fā)生誘變，并對降低的淀粉磷酸酶解作用進行篩選。另一方面，還可鑒別具有降低親和性和/或具有特異親和性的磷酸化酶天然存在的等位基因。此外，特定酶的活性還可用各種抑制劑來改。這些方法都是常規(guī)使用的，可在如Sambrook et al(1989)的教科書中找到。3.GLTP和GHTP酶的變異體和用于同源依賴性沉默的序列如在發(fā)明背景中所述，以及Nakano et al.(1986)，Mori et al.(1991)，和Sonnewald et al.(1990)的詳述，在馬鈴薯植株中存在三種已知的α葡聚糖磷酸化酶的同功酶。本發(fā)明關系到下調(diào)GLTP和/或GHTP的同功酶。盡管據(jù)認為所有已知的商業(yè)用馬鈴薯品種的GLTP和GHTP基因都基本上相同，但是預期本發(fā)明的原理和技術對某些馬鈴薯植株是有作用的，這些植株具有某些不同的全長聚苷酸序列或亞序列，這些序列能編碼具有所述GLTP和GHTP酶的淀粉分解代謝催化活性的多肽。如在此和權(quán)利要求中所用的術語“GLTP”和“GHTP”，意在包括上述的變異體。上述的變異體可包括由于密碼子的簡并性而與作為例子的序列不同，但仍然編碼相同多肽的GLTP和GHTP核苷酸序列變異體，以及編碼能被特定抗體識別的蛋白質(zhì)的變異體，這種抗體是針對在SEQ ID NO2和4中所列出的GLTP和GHTP氨基酸序列而產(chǎn)生的。
類似地，本領域的技術人員將意識到，用不同于作為例證的有義或反義序列，也可能實現(xiàn)使馬鈴薯中的GLTP和/或GHTP同源-依賴性沉默的目的。首先，從中衍生反義序列的GLTP或GHTP cDNA序列區(qū)不是必不可少的。其次，如上所述，所用反義序列的長度可能有相當大的差別。另外，有義或反義序列不必與將被抑制的靶標GLTP或GHTP基因的序列相同。如在此實施例中所述，本發(fā)明者已觀察到，以來源于GHTP基因的反義DNA序列轉(zhuǎn)化馬鈴薯植株，不僅能充分地抑制GHTP基因的活性，而且可引起GLTP基因活性的一定程度抑制。GHTP和GLTP基因的反義序列有56.8％的序列相同。Sonnewald et al(1990)描述的GLTP反義序列和相應的葉型α葡聚糖磷酸化酶序列之間的同一性是71.3％。根據(jù)本發(fā)明者的研究資料，當用來源于GLTP基因的反義DNA序列轉(zhuǎn)化馬鈴薯植株時，沒有觀察到同樣的交叉下調(diào)現(xiàn)象。然而，這些結(jié)果清楚地表明，在GLTP活性被具有約57％的序列與靶標GLTP序列相同的反義序列抑制的條件下，靶標內(nèi)源性α葡聚糖磷酸化酶基因和重組DNA之間序列完全相同是不必要的。
因此，本領域的專業(yè)人員將能理解到，將與在此作例證的序列不同的有義或反義序列，以及不同于與靶標內(nèi)源性GLTP或GHTP基因具有完全序列同一性的有義或反義序列導入馬鈴薯植株細胞時，都能有效地引起內(nèi)源性GLTP或GHTP基因抑制劑。借助于在為比較的目的而排列的部分序列上保守氨基酸的取代，或者相匹配核苷酸或氨基酸的百分數(shù)差異，有用的有義或反義序列可能不同于作為例證的反義序列，或者不同于來源于內(nèi)源性GHTP或GLTP基因序列的其它序列。
美國專利5,585,545(Bennett等，1996，12，17)提供了有關如下技術的有益論述比較多核苷酸和多肽序列的同一性，保守氨基酸的取代，以及指示序列同一性程度的雜交條件。在此將概述此論述的有關部分。
通過在一個比較窗口比較二個最佳匹配的序列，可確定多核苷酸和多肽序列同一性百分數(shù)，當為了最佳匹配這二個序列而與參照序列(它不包含增補或缺失)相比較時，其中在比較窗口內(nèi)的部分多核苷酸或多肽序列可能包含有增補或缺失(即缺口)。此百分數(shù)的計算步驟如下(a)確定二個序列內(nèi)存在相同核酸堿基或氨基酸殘基位置的數(shù)目，得到匹配位置的數(shù)目；(b)以此匹配位置數(shù)目除以比較窗口內(nèi)位置的總數(shù)；以及(c)將此結(jié)果乘以100，得到序列同一性百分數(shù)。最佳的序列匹配比較可借助于已知算法的計算機執(zhí)行程序來進行(例如Wisconsin遺傳軟件包中的GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA和TFASTA，遺傳計算機組(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI，或從國家生物技術信息中心可獲得的BlastN和BlastX)，或者通過檢測法進行。
可通過保守氨基酸的更換來區(qū)別特定的多肽，這種多肽除了不同的殘基位置之外，具有基本上類似于上述的共有序列。保守氨基酸的取代是指具有類似側(cè)鏈的殘基的可互換性。例如，具有α側(cè)鏈的氨基酸組有甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸；具有α-羥基側(cè)鏈的氨基酸組有絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側(cè)鏈的氨基酸組有天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳基側(cè)鏈的氨基酸組有苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的氨基酸組有賴氨酸，精氨酸和組氨酸；具有含硫側(cè)鏈的氨基酸組有半胱氨酸和甲硫氨酸。
如果二個核酸分子能在嚴格條件下相互特異性地雜交，是其核苷酸序列基本相同的另一個指示。嚴格條件是與序列有關的，并且隨不同的環(huán)境條件而不同。一般而言，對于特定的序列，在確定的離子強度和pH下，嚴格條件選擇為比熱熔點(Tm)低大約10℃。Tm是50％靶標序列能與準確匹配的探針雜交的溫度(在確定的離子強度和pH7)。雜交的Tm是探針的長度和堿基組成的函數(shù)，可按Sanbrook et al(1989)的描述計算。一般來說，用于DNA印跡試驗方案的嚴格條件包括用0.2×SSC在65℃下漂洗。對于優(yōu)選的寡核苷酸探針，漂洗條件通常是在6×SSC中大約42℃。4.一般方法可用各種方法對植物細胞導入和表達外來的DNA序列。簡略地說，制備反義α葡聚糖磷酸化酶cDNA，并將它導入植物細胞的步驟包括(1)從馬鈴薯植株分離出mRNA，并從此mRNA制備cDNA；(2)從此cDNA中篩選出所需序列；(3)按磷酸化酶基因表達的相反取向?qū)⒁粋€啟動子連接于此所需的cDNA；(4)轉(zhuǎn)化適合的宿主植物細胞；以及(5)選擇和再生轉(zhuǎn)錄此反義序列的細胞。
在此例證性情況下，是將來源于馬鈴薯GLTP和GHTP基因的DNA用于構(gòu)成表達盒，此表達盒具有有效地連接于一個反義DNA序列的植物啟動子序列，此反義DNA序列在植株中轉(zhuǎn)錄時將抑制內(nèi)源性GLTP基因或GHTP基因的表達。根瘤土壤桿菌可用作將此DNA傳遞給馬鈴薯苗莖外植體的載體。從轉(zhuǎn)化的外植株再生的植株轉(zhuǎn)錄抑制此酶活性的反義DNA。
在此所述的重組DNA技術，包括本領域技術人員熟知的標準的實驗室技術，在權(quán)威性參考文獻如Sambrook et al(1989)中已有描述。一般來說，包括DNA連接酶，DNA聚合酶，限制性內(nèi)切核酸酶等的酶促反應，可根據(jù)制造商的說明書進行。5.制備GHTP和GLTP cDNA通過逆轉(zhuǎn)錄從分離出的馬鈴薯塊莖mRNA制備cDNA。使引物對此mRNA退火，形成可借助于逆轉(zhuǎn)錄酶用于延伸的游離的3′末端。當被與mRNA模板配對的互補堿基定向時，此酶可參與通常的5′-3′延伸，形成雜交分子，此雜交分子是由模板RNA鏈與互補的cDNA鏈堿基配對組成。在原來的mRNA降解之后，DNA聚合酶被用于合成互補的DNA鏈，以便將此單鏈cDNA轉(zhuǎn)化成為雙鏈DNA。
在DNA擴增之后，可將此雙鏈cDNA插入一個載體，用于在E.Coli中進行增殖。一般來說，如果使用了表達載體，可通過核酸雜交，或?qū)λ幋a蛋白的免疫檢測，對帶有所需cDNA的克隆進行鑒定。在此例證性情況下，問題被簡化了，其中，如適合的引物序列一樣，GLTP和GHTP基因的DNA序列是已知的(Brisson et al.，1990；Fukui et al.，1991)。所用的引物在GLTP和GHTP基因內(nèi)雜交了。因此，不需要進一步分析就可以預計，所制備的擴增cDNA是GLTP和GHTP基因的一部分?？赏ㄟ^顏色選擇對以攜帶磷酸化酶DNA插入片段的PUC 19質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.Coli進行鑒別。以不攜帶插入片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的適當E.Coli菌株，生長呈蘭色菌落。以攜帶插入片段的pBluescript質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的菌株生長呈白色菌落。對從轉(zhuǎn)化的E.Coli分離出的質(zhì)粒進行測序，以便證實此磷酸化酶插入片段的序列。6.載體構(gòu)建可將所制備的cDNA按反義或有義取向插入表達載體中的表達盒，用于轉(zhuǎn)化馬鈴薯植株，抑制馬鈴薯塊莖中GLTP和/或GHTP基因的表達。
在涉及反義抑制的本例證性情況下，所需的重組載體將包含為啟動植株中反義cDNA轉(zhuǎn)錄而設計的表達盒。包括一些額外序列以使載體能在細菌或噬菌體宿主中被克隆。
載體可優(yōu)選地包含具有廣泛宿主范圍的原核生物復制起點。還應該包含一個可選擇性標記，以便能選擇具有所需構(gòu)建物的細菌細胞。適合的原核生物選擇性標記包括對抗菌素如氨芐青霉素的抗性。
如本領域?qū)I(yè)人員所知，在載體內(nèi)還可能存在編碼輔助功能的其它DNA序列。例如，在土壤桿菌轉(zhuǎn)化的情況之下，還應包含為隨后轉(zhuǎn)移至植物染色體的T-DNA序列。
為了在植物中表達，除了所需的序列之外，此重組表達盒還應包含植物啟動子區(qū)，轉(zhuǎn)錄起始位點(如果待轉(zhuǎn)錄的序列缺少它)，以及轉(zhuǎn)錄終止序列。在此盒的5′和3′末端，通常還包括獨特的限制性酶切位點，使之易插入預先存在的載體?？刂普婧松锘虮磉_的序列對本領域?qū)I(yè)人員也是熟知的。
將DNA轉(zhuǎn)錄成為mRNA是由被稱為啟動子的DNA區(qū)調(diào)控。啟動子區(qū)含有提供RNA聚合酶與DNA關聯(lián)的信號的堿基序列，并啟動mRNA轉(zhuǎn)錄，用一條DNA鏈作模板，形成相應的互補RNA鏈。啟動子序列成分包括TATA盒共有序列(TATAAT)，它通常是轉(zhuǎn)錄起始位點上游(按照常規(guī)是相對轉(zhuǎn)錄起始位點的-30--20bp)的20-30個堿基對(bp)。在絕大多數(shù)情況下，為了精確的轉(zhuǎn)錄啟動需要TATA盒。TATA盒是相對于起始位點具有較固定定位的唯一的上游啟動子成分。
CAAT盒共有序列集中在-75，但是可在顯著不同于起始點的距離內(nèi)發(fā)揮功能，并可在二個方向發(fā)揮功能。
另一種通用啟動子成分是在-90包含共有序列GGGCGG的GC盒，它可能以多拷貝和雙取向的形式存在。
在啟動子區(qū)還可能發(fā)現(xiàn)賦予組織特異性，對環(huán)境信號起反應的、或使轉(zhuǎn)錄最大有效的其它序列。這些序列常常發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的400bp內(nèi)，但是可能延伸遠至2000bp或更多。在異源性啟動子/結(jié)構(gòu)基因組合中，啟動子優(yōu)選地定位在距異源性轉(zhuǎn)錄起始位點大約相同的距離，與它在天然的定位中距轉(zhuǎn)錄起始位點一樣的位置。但是，此距離可以有某些改變而不喪失啟動子的功能。
用于此表達盒的特定啟動子對本發(fā)明不是關鍵性的。在植物細胞中指導轉(zhuǎn)錄的許多啟動子中的任何一種都適合的。此啟動子可以是組成型的或者是誘導型的。
在文獻中已描述了多種在植物細胞中有活性的啟動子。它們包括胭脂堿合成酶(NOS)和章魚堿合成酶(OCS)啟動子(它們被攜帶在根瘤土壤桿菌的誘導腫瘤的質(zhì)粒中)，花椰菜花葉病毒屬啟動子如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S，及玄參花葉病毒35S啟動子，來源于核酮糖-1，5-二-磷酸羧化酶小亞單位(ssRUBISCO，一種含量非常豐富的植物多肽)的光誘導性啟動子，以及葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因啟動子等。所有這些啟動子都已用于構(gòu)成各種類型的DNA構(gòu)建體，并在植物中進行了表達，參見例如PCT WO 8402913。
在此用于實施例中的CaMV 35S啟動子，已在絕大多數(shù)組織中顯示出高度活性，并進行了組成型表達(Bevan et al.，1986)。已知存在其它許多具有塊莖特異性或加強表達的基因，包括馬鈴薯塊莖ADPGPP基因的大和小亞單位(Muller et al.，1990)。預期在本發(fā)明中有用的其它一些啟動子包括，那些在馬鈴薯塊莖中顯示增強或特異性表達的啟動子，通常情況下與淀粉生物合成或修飾酶基因的表達有關的啟動子，或者是那些顯示出不同表達模式的啟動子，例如在塊莖發(fā)育過程中的不同時間表達的啟動子。這些啟動子的例子包括那些用于如下蛋白質(zhì)基因的啟動子顆粒連接的和其它淀粉合成酶，分支酶(Blennow et al.，1991；WO 9214827；WO 9211375)，岐化酶(Takaha et al.，1993)，脫支酶，糖化酶，淀粉磷酸化酶(Nakano et al.，1989；Mori et al.，1991)，果膠酯酶(Ebbelaar et al.，1993)，40kD糖蛋白；遍在蛋白質(zhì)，天冬氨酸蛋白酶抑制劑(Stukerlj et al.，1990)，羧肽酶抑制劑，塊莖多酚氧化酶(Shahar et al.，1992，GenBank保存號M 95196和M 95197)，公認的胰蛋白酶抑制劑和其它的塊莖cDNA(Stiekeme et al.，1988)，以及糖化酶和Sporemins基因的啟動子(Yoshida et al.，1992；Ohta et al.，1991)。
除了啟動子序列之外，此表達盒還應包含位于結(jié)構(gòu)基因下游的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，以便提供有效的終止作用。此終止區(qū)可從與啟動子序列相同的基因獲得，或者也可以從不同的基因獲得。在本例證性情況下，使用了胭脂堿合成酶NOS 3′終止子序列(Bevan et al.1983)。
如果由結(jié)構(gòu)基因編碼的mRNA將被有效地翻譯，通常還要對載體構(gòu)建體加入聚腺苷酸化序列(Alber and Kawasaki，1982)。據(jù)認為聚腺苷酸化對mRNA具有穩(wěn)定化作用。聚腺苷酸化序列包括但不局限于土壤桿菌章魚堿合成酶信號(Gielen et al.，1984)或胭脂堿合成酶信號(Depicker et al.，1982)。
此載體一般還應包含一個可選擇性標記基因，通過此基因可對培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化植物細胞進行鑒別。一般情況下，標記基因編碼抗菌素抗性。這些標記包括對G 418，潮霉素，爭光霉素，卡那霉素，和慶大霉素的抗性。在本例證性情況下，標記基因賦予對卡那霉素的抗性。在轉(zhuǎn)化植物細胞之后，通過它們在含有特定抗菌素的培養(yǎng)基中生長的能力，可鑒別那些含有此載體的細胞。7.轉(zhuǎn)化植物細胞雖然在本例證性情況下，馬鈴薯植株的苗莖外植體是通過以一種根瘤土壤桿菌接種而轉(zhuǎn)化的，此根瘤土壤桿菌攜帶有連接于二元載體的反義序列，但是也可以采用本領域已知的直接轉(zhuǎn)化技術來轉(zhuǎn)移此重組DNA。此載體可被直接微注射進入植物細胞。另一種方法是，可借助于帶有包埋在微?；|(zhì)內(nèi)或在其表面的所需核酸的微小顆粒，通過高速發(fā)射穿透作用，將核酸導入植物細胞，還可應用原生質(zhì)體同脂質(zhì)包被體如攜帶有所需DNA的小型細胞，細胞或溶酶體的融合作用。還可以通過電穿孔法將DNA導入植物細胞，其中是在攜帶有此表達盒的質(zhì)粒存在下使植物原生質(zhì)體電穿孔。
不同于直接轉(zhuǎn)化的方法，本例證性情況采取了使用根瘤土壤桿菌的載體轉(zhuǎn)化法。根瘤土壤桿菌是一種革蘭氏陰性土壤細菌，它對雙子葉植物引起被稱為冠瘺的贅生物疾病。瘤的誘導作用是由被稱為Ti質(zhì)粒的瘤誘導性質(zhì)粒引起的。Ti質(zhì)粒在感染的植物中定向合成冠癭堿。冠癭堿被土壤桿菌用作碳源和/或氮源。
此細菌并不進入植物細胞，但只轉(zhuǎn)移部分被稱為T-DNA部分的Ti質(zhì)粒，此T-DNA可穩(wěn)定地整合進入植物基因組，在此它表達合成冠癭堿所需的功能，并轉(zhuǎn)化植物細胞。Ti質(zhì)粒上T-DNA區(qū)外部的Vir(毒力)基因，對轉(zhuǎn)移T-DNA是必須的。但是，Vir區(qū)不被轉(zhuǎn)移。實際上，雖然Vir區(qū)是T-DNA轉(zhuǎn)移所需要的，但Vir區(qū)不需要真的連接于T-DNA，而可能是在單獨的質(zhì)粒上被提供。
T-DNA的瘤誘導性部分可以被斷開或被刪除，而不喪失其轉(zhuǎn)移和整合功能，以致可產(chǎn)生正常的和健康的轉(zhuǎn)化植物細胞，這種細胞已喪失了腫瘤細胞的所有特性，但仍然保有并能表達T-DNA的某些部分，特別是T-DNA邊緣區(qū)的某些部分。因此，可用其中已刪除了疾病引發(fā)性基因的被修飾Ti質(zhì)粒作載體，用于將本發(fā)明的有義和反義基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)移進入馬鈴薯植株(一般性地可參見Winnecker，1987)。
用土壤桿菌轉(zhuǎn)化植物細胞和再生完整的植株，通常包括與分離的培養(yǎng)原生質(zhì)體一起共培養(yǎng)土壤桿菌，或者用土壤桿菌轉(zhuǎn)化完整的細胞或組織。在本例證性情況下，是用土壤桿菌轉(zhuǎn)化來源于馬鈴薯幼苗培植物的莖外植體。
另一種選擇是，可用花椰菜花葉病毒(CaMV)作載體將有義或反義DNA導入茄科植物。例如，美國專利號No.4,407,956(Howell，1983，10，4)闡述了以花椰菜花葉病毒DNA作植物載體的用處。8.轉(zhuǎn)化植株細胞的選擇和再生轉(zhuǎn)化之后，必須對攜帶有反義或有義DNA的轉(zhuǎn)化細胞或植株進行鑒別。一般是應用可選擇性標記如抗菌素抗性。在本例證性情況下，是通過使細胞在含有卡那霉素的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)而對轉(zhuǎn)化的植株細胞進行選擇。其它的可選擇性標記對本領域技術人員也是熟知的。例如，當用土壤桿菌轉(zhuǎn)化植株時，冠癭堿的存在可用于鑒別轉(zhuǎn)化體。
應用熟知的方法如RNA印跡雜交法，通過檢測由插入的DNA所編碼的RNA，可確證對此外來DNA的表達。同樣，借助于DNA印跡雜交或聚合酶鏈反應，可對插入的DNA序列本身進行鑒別(一般可參閱Sambrook et al.(1989))。
一般地說，在確定此轉(zhuǎn)化的植物細胞攜帶有重組DNA之后，可將全部植株再生。在本例證性情況下，是用攜帶有所需反義DNA和卡那霉素標記基因的根瘤土壤桿菌培養(yǎng)物，接種馬鈴薯幼苗培養(yǎng)物的莖和葉外植體。在含有卡那霉素的生長培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)移至適當?shù)呐囵B(yǎng)基作幼苗誘導之后，將幼苗轉(zhuǎn)移至適合生根的培養(yǎng)基。然后將植株轉(zhuǎn)移至土壤使之強化。將此培養(yǎng)再生的植株移植后，使之在暖房條件下生長至成熟。9.分析轉(zhuǎn)化的塊莖中GHTP和GLTP的活性水平使以來源于GHTP和GLTP基因的反義DNA序列轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植株再生之后，用幾種方法對轉(zhuǎn)化的塊莖組織進行生化分析。按照Steup(1990)的方法測定了在體外磷酸化反應中α葡聚糖磷酸化酶的活性(表1)。在含糖原的聚丙烯酰胺凝膠上對酶同工型作電泳分離之后，對在合成反應中的酶活性，以及酶蛋白的含量進行了比較(圖7)。在與葡萄糖-1-磷酸和淀粉引物共溫育之后，借助于對凝膠的碘染色測定了塊莖L-型和H-型酶同工型的淀粉合成作用(Steup，1990)。通過將來自相同的未溫育原凝膠中的蛋白質(zhì)印跡在硝酸纖維素膜上，并用對塊莖L型和H型葡聚糖磷酸化酶的同工型特異的多克隆抗體作探針，進行了蛋白質(zhì)印跡分析。借助于HPLC對塊莖組織中還原糖(葡萄糖和果糖)的水平作定量分析(表2，3和4)。通過油炸后確定薄片的得分檢定了Maillard反應的程度，此反應與塊莖中還原糖的濃度成正比(表5和圖6)。10.定義在此和權(quán)利要求中使用的術語規(guī)定如下“大約3個月”，“大約4個月”和“大約6個月”分別意指3個月±2周，4個月±2周，和6個月±2周的一段時間；“反義取向”意指相對于其天然存在時的取向，被插入表達盒中來源于結(jié)構(gòu)基因的核酸序列，是按倒轉(zhuǎn)的方式取向。當此序列是雙鏈時，按天然存在取向的作為模板的鏈成為編碼鏈，反之亦然；塊莖“薯片記分”意指對中心切片的馬鈴薯薄片，在豆油中205°F油炸大約3分鐘至起泡為止，然后以Agtron E-15-FP型直讀式簡易分光光度計(Agtron Inc.1095 Spice Island Drive#100，Sparks Nevada89431)測定的反射讀數(shù)；“冷貯存”或“低溫貯存”，或者其變化形式，都將意指保持在低于10℃的溫度，可通過致冷作用或環(huán)境溫度達到；“內(nèi)源性”當它用于馬鈴薯植株的α葡聚糖磷酸化酶基因時，將意指在導入攜帶有來自α葡聚糖磷酸化酶基因DNA序列的表達盒之前，已存在于馬鈴薯植株基因組中的天然存在的基因；“表達”是指結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，以致蛋白質(zhì)被合成；“異源性序列”或“異源性表達盒”是來源于外來種的序列，或者，如其是來源于相同種，已被修飾基本上不同于其原來的形式；“改善的冷貯存特征”包括而不局限于薯片記分的改善和在收獲時或10℃以下貯存一段時間之后測定的塊莖中糖積累降低，以及進一步包括由于在比傳統(tǒng)采用的較低溫度貯存馬鈴薯而獲得的改善、優(yōu)點和好處，包括但不局限于，增加馬鈴薯的貯存時間，通過降低馬鈴薯呼吸和發(fā)芽而增加休眠時間，以及降低發(fā)病率。除非通過特殊的測定或試驗另有限制，冷貯存特征的改善指的是相對于對照，野生型或未修飾的馬鈴薯植株的所描述特征差異。
“修飾”或其改變形式，當用于描述馬鈴薯植株或塊莖時，是用于區(qū)分已通過如下方法使之不同于其天然存在狀態(tài)的馬鈴薯植株或塊莖導入來源于相同或不同種的核苷酸序列，無論按有義或反義取向，也無論是通過重組DNA技術或借助于傳統(tǒng)的雜交育種法，包括導入修飾的結(jié)構(gòu)性序列或調(diào)控序列；通過位點定向誘變作用修飾天然的核酸序列或相反情況；或者用化學劑或蛋白質(zhì)抑制劑處理馬鈴薯植株?！拔葱揎椀摹瘪R鈴薯植株或塊莖意指未經(jīng)上述修飾的對照，野生型或天然存在的馬鈴薯植株或塊莖；“核酸序列”或“核酸區(qū)段”指的是從5′末端至3′末端解讀的單鏈或雙鏈脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的多聚體。它包括自我復制的質(zhì)粒，感染性DNA或RNA多聚體，以及非功能性DNA或RNA；“有效地連接”是指啟動子和第二個序列之間的功能性連接，其中，啟動子序列可啟動相應于第二序列的RNA轉(zhuǎn)錄；“植株”包括整株植物，植物器官(例如葉，莖，根等)，幼苗和植物細胞；“啟動子”是指結(jié)構(gòu)基因上游的DNA區(qū)，此區(qū)與對啟動轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶和其它蛋白質(zhì)的識別和連接有關?！爸参飭幼印笔悄軌蛟谥参锛毎袉愚D(zhuǎn)錄的啟動子；“降低的活性”或其改變形式，當用于馬鈴薯塊莖中GLTP或GHTP酶活性時，包括如下情況引起的GLTP或GHTP酶活性降低GLTP或GHTP基因產(chǎn)物的表達降低，GLTP或GHTP酶的底物親和性降低，以及GLTP或GHTP酶的催化活性降低；“降低”或其改變形式，在此可用于，而不局限于馬鈴薯塊莖中GLTP或GHTP酶的活性水平，馬鈴薯塊莖中糖的積累，以及油炸時馬鈴薯薄片的變黑。除非通過特殊的測定或試驗另有限制，降低的水平或降低的活性指的是所描述的特征相對于對照，野生型或未修飾的馬鈴薯植株的特征有可證明的統(tǒng)計學顯著性差異；“脅迫”或其改變形式，當用于關系到馬鈴薯植株和塊莖經(jīng)歷的脅迫時，包括影響植株或塊莖品質(zhì)的環(huán)境，肥料，濕度，溫度，處理，疾病，大氣和老化的作用，并且在馬鈴薯植株生命循環(huán)的所有階段，在馬鈴薯塊莖生長發(fā)育循環(huán)的所有階段，以及在隨后的收獲，運輸，貯存和加工過程中都可能經(jīng)歷的作用；“脅迫抗性”或其改變形式將意指溫度，老化，疾病，大氣，物理處理，濕度，化學殘留，環(huán)境，蟲害和其它脅迫的影響降低了；“適合的宿主”指的是可與重組的質(zhì)粒，DNA序列或重組的表達盒共存的微生物或細胞，并且將允許此質(zhì)粒復制，摻入其基因組，或進行表達；“未斷裂的”指的是包含缺少間插，未翻譯序列的開放讀框的DNA序列(例如cDNA)。
實施例1此實施例描述，通過以包含特定DNA序列的表達盒轉(zhuǎn)化馬鈴薯植株來降低馬鈴薯植株塊莖中GHTP和/或GLTP的活性，此DNA序列是來自以反義取向連接于啟動子的GLTP和GHTP基因序列。A分離馬鈴薯塊莖mRNA在液氮下用研缽和研杵將1克塊莖組織研磨成細粉，然后用高壓滅菌的試劑在4℃下從其中精制馬鈴薯總RNA。將此細粉轉(zhuǎn)移至30ml的Corex管內(nèi)，加入3倍體積的100mM Tris-Cl，pH8.0，100mMNaCl，和10mM EDTA(10×TNE)，其中含有0.2％(w/v)SDS和0.5％(v/v)2-巰基乙醇。加入等體積苯酚-氯仿(1∶1)，緩慢旋轉(zhuǎn)攪拌樣品，然后在4℃用SS34轉(zhuǎn)子以8000rpm轉(zhuǎn)速離心5分鐘。有機相用0.5體積含0.2％(w/v)SDS和0.5％(v/v)2-巰基乙醇的10×TNE再提取，合并水相，用氯仿提取。用乙酸鈉和無水乙醇從水相中沉淀出核酸，離心收集沉淀并再懸浮于3ml 1×TNE中。加入等體積5M LiCl，將樣品在-20℃放置4小時，然后在SS 34轉(zhuǎn)子內(nèi)，以8000rpm的轉(zhuǎn)速在4℃離心10分鐘。用70％乙醇洗此RNA沉淀、干燥后再懸浮于DEPC處理的水中。
應用寡脫氧胸苷酸纖維素(Boehringer Mannheim)柱層析分離出聚(A+)RNA(Poly(A+)RNA)。從再懸浮于無RNAse水中的總RNA分離出了Poly(A+)RNA。柱制備法是用高壓滅菌的10ml Bio-Rad Poly-Prep柱，加入50mg懸浮于1ml加樣緩沖液B中的寡脫氧胸苷酸(oligo(dT))纖維素，此加樣緩沖液B含有20mM Tris-Cl，pH7.4，0.1M NaCl，1mM EDTA和0.1％(w/v)SDS。先用3倍體積含有5mM EDTA的0.1M NaOH洗柱，然后用DEPC處理的水洗柱，直至用pH試紙檢測時流出液的pH小于8為止。然后用5倍體積含有40mM Tric-Cl，pH7.4，1M NaCl，1mM EDTA和0.1％(w/v)SDS的加樣緩沖液A洗柱。
將RNA樣品加熱至65℃持續(xù)5分鐘，在此時間內(nèi)，加入預熱至65℃的加樣緩沖液A 400μl?；靹驑悠?，在室溫下冷卻2分鐘。然后對柱加樣。收集洗脫液，加熱至65℃持續(xù)5分鐘，冷卻至室溫2分鐘，再對柱加樣。隨后用5倍體積的加樣緩沖液A洗脫，再用4倍體積加樣緩沖液B洗脫。用3倍體積的10mM Tris-Cl，pH7.4，1mM EDTA，和0.05％(w/v)SDS洗脫出Poly(A+)RNA。收集各組分，對含有RNA的組分用溴化乙啶試驗板鑒定，這是一種用含有EtBr的TAE制成的有1％瓊脂糖的培養(yǎng)皿。使RNA沉淀，再懸浮成10μl，取1μl用分光光度計作定量分析。B分離GLTP和GHTP DNA序列用于形成反義構(gòu)建體的核苷酸序列隨機地選自GLTP(SEQ IDNO1)和GHTP(SEQ ID NO3)的5′序列。應用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應獲得了用于形成反義構(gòu)建體的DNA序列。根據(jù)已發(fā)表的序列(Brisson et al.，1990，F(xiàn)ukui et al.1991)進行較小的修飾以便于酶限制性內(nèi)切，設計了GLTP(SPL1和SPL2)-和GHTP(SPH1和SPH2)特異性引物SPL1引物5′ATTCGAAAAGCTCGAGATTTGCATAGA 3′(SEQID NO7)(補充的CG構(gòu)成XhoI位點)；SPL2引物5′GTGTGCTCTCGAGCATTGAAAGC 3′(SEQ IDNO8)(將C改變?yōu)镚構(gòu)成XhoI位點)；SPH1引物5′GTTTATTTTCCATCGATGGAAGGTGGTG 3′(SEQID NO9)(加入CGAT構(gòu)成ClaI位點)；SPH2引物5′ATAATATCCTGAATCGATGCACTGC 3′(SEQ IDNO10)(將G改變?yōu)門構(gòu)成ClaI位點)。
在15μl的體積內(nèi)進行逆轉(zhuǎn)錄，其中含有1×PCR緩沖液(10mMTris-Cl pH8.2，50mM KCl，0.001％明膠，1.5mM MgCl2)，670μl各種dNTP，6μg馬鈴薯塊莖cv.Russet Burbank RNA，1mM每種引物(SPH1和SPL2，或SPH1和SPH2)，以及200 U Maloney鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(BRL)。此反應在37℃進行30分鐘，然后在94℃熱滅活5分鐘，再在冰上快速冷卻。對此逆轉(zhuǎn)錄反應物加入在35μl1×PCR緩沖液中的2.5 U Taq DNA聚合酶(BRL)。在PerkinElmer 480中進行DNA擴增，編程30個循環(huán)，1分鐘的94℃變性步驟，1分鐘的56℃(SPL1和SPL2)或58℃(SPH1和SPH2)退火步驟，以及2分鐘的72℃延伸步驟。以最后10分鐘72℃延伸完成PCR。C構(gòu)建用于磷酸化酶抑制作用的SP載體為了在植物細胞中表達反義構(gòu)建體，有必要使此基因與適合的植物調(diào)節(jié)區(qū)融合?？赏ㄟ^將此反義DNA克隆進入含有所需序列的質(zhì)粒載體來實現(xiàn)這種融合。
使擴增的DNA形成平端，并被克隆進入pUC19載體的SmaI位點。將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入有效亞克隆的E.Coli DH 5α細胞(BRL)。將此轉(zhuǎn)化的細胞接種在含氨芐青霉素100μg/ml的LB(15g/LBactotptone，5g/L酵母浸膏，10g/L NaCl，pH7.3，以1.5％瓊脂固化)平板上。應用顏色選擇法，對包含帶有插入植物磷酸化酶序列的質(zhì)粒的細菌進行了選擇。在LacZ基因片段的N-端部分存在多接頭及T3和T7 RNA聚合酶啟動子序列。在多接頭沒有插入片段的pUC19質(zhì)粒，在適當?shù)木耆鏒H 5α內(nèi)生長呈蘭色菌落。通過在接種轉(zhuǎn)化體之前30分鐘，將100μl 2％X-gal(在二甲基甲酰胺中配制的)分散在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB平板上制備顏色選擇平板。在37℃培育12-18小時之后，包含沒有插入片段質(zhì)粒的菌落呈蘭色，而帶有會插入片段質(zhì)粒的菌落仍然呈白色。對分離的質(zhì)粒測序證實了磷酸化酶插入片段的序列。用ABI Prism染色終止了循環(huán)測序核心試劑盒(AppliedBiosystems，foster City，CA)，M13通用和反引物，以及ABI自動DNA測序儀，進行序列測定。通過從5ml過夜的培養(yǎng)物進行快速堿提取程序，對此工程質(zhì)粒進行了純化(Bimboim and Doly，1979)。通過限制性酶切消化確定了pUC19中SPL和SPH片段的取向。對重組pUC19載體和二元載體pBI121(Clonetech)作限制性酶切，進行瓊脂糖凝膠電泳，并通過凝膠分離純化各片段，如Thuring et al(1975)所描述。
通過連接反應將此反義序列融合于二元載體pBI121。此連接體含有已被BamHI和SacI消化的pBI121載體，以及已用BamHI和SacI從pUC19亞克隆切開的SPL或SPH磷酸化酶DNA產(chǎn)物。使連接的DNA轉(zhuǎn)化進入SCE E.Coli DH 5α細胞，并將此轉(zhuǎn)化細胞接種在含氨芐青霉素的LB平板上。反義DNA SPL和SPH的核苷酸序列分別是SEQ IDNO1的核苷酸338-993，以及SEQ ID NO3的核苷酸147-799。以CAMV和NOS特異性引物對帶有磷酸化酶插入片段的pBI 121進行選擇。
培養(yǎng)過夜之后，從平板上挑選出了代表塊莖L-型和塊莖H-型磷酸化酶DNA片段的樣品1和樣品2。將這些樣品接種進入5ml LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。通過快速堿提取程序分離出質(zhì)粒，其DNA被電穿孔轉(zhuǎn)化進入根瘤土壤桿菌。
通過基因工程，使含有CaMV 35S啟動子(Kay et al.1987)和NOS3′終止子(Bevan et al.1983)序列的構(gòu)建體構(gòu)建進入pBI121載體。此pBI121質(zhì)粒是由如下明確鑒定的DNA區(qū)段組成。從轉(zhuǎn)座子Tn7中從離出的0.93kb片段，它編碼細菌的壯觀霉素/鏈霉素(Spc/Str)抗性，并且是在E.Coli和根瘤土壤桿菌中進行選擇的決定因子(Fling et al.1985)。將此片段連接于為植物表達構(gòu)建的嵌合的卡那霉素抗性基因，使之能夠?qū)D(zhuǎn)化的組織進行選擇。此嵌合基因是由0.35kb的花椰菜花葉病毒35S啟動子(P-35S)(Odell et al.，1985)，0.83kb的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II型基因(NPTH)，以及0.26kb的胭脂堿合成酶基因的3′非翻譯區(qū)(NOS 3′)(Fraley et al.，1983)組成。另一個區(qū)段是來自RK2質(zhì)粒的0.75kb的復制起點(ori-V)(Stalker et al.，1981)。此區(qū)段連接于pBR 322的3.1kb的SalI-PvuI區(qū)段，它提供保持在E.Coli中的復制起點(ori-322)以及用于在根瘤土壤桿菌細胞中接合轉(zhuǎn)移的bom位點。再一個區(qū)段是來自pTiT37質(zhì)粒的0.36kbPvuI片段，它包含胭脂堿型T-DNA的右邊緣區(qū)(Fraley et al.，1985)。通過使其基因置于組成型組織非特異性啟動子的控制之下，此反義序列被構(gòu)建在塊莖中進行表達。D植株的轉(zhuǎn)化/再生按照Block(1988)的方法，使SPL和SPH載體轉(zhuǎn)化進入Desiree馬鈴薯栽培種。為了轉(zhuǎn)化“Desiree”馬鈴薯，將“Desiree”的無菌幼苗培養(yǎng)物保存在試管內(nèi)，其中含有8ml S1(以2％蔗糖和0.5g/L MESpH5.7補充的，以6g/L Phytagar固化的Murashige和Skoog(MS)培養(yǎng)基)。當小植株達到大約5cm長度時，用單面刀片沿基部切下葉片，并以1∶10稀釋的培養(yǎng)過夜的根瘤土壤桿菌接種葉片。在S1培養(yǎng)基上，20℃共培養(yǎng)外植體2天(De Block，1988)。共培養(yǎng)之后，將此外植體轉(zhuǎn)移至S4培養(yǎng)基培養(yǎng)1周，然后再培養(yǎng)2周誘發(fā)愈傷組織形成(S4培養(yǎng)基是沒有蔗糖，以0.5g/L MFS pH5.7，200mg/L谷氨酰胺，0.5g/L PVP，20g/L甘露糖醇，20g/L葡萄糖，40mg/L腺嘌呤，1mg/L反式玉米素，0.1mg/L NAA，1g/L羧芐青霉素，50mg/L卡那霉素補充的，以6g/L phytagar固化的MS培養(yǎng)基)。
3周之后，將外植體轉(zhuǎn)移至S6培養(yǎng)基(沒有NAA和具有一半羧芐青霉素濃度(500mg/L)的S4培養(yǎng)基)。再過2周之后，將此外植體轉(zhuǎn)移至S8培養(yǎng)基(只含有250mg/L羧芐青霉素和0.01mg/L赤霉酸，GA3的S6培養(yǎng)基)，促進幼苗形成。轉(zhuǎn)移至S8苗誘導培養(yǎng)基后約2周幼苗開始形成。切取這些幼苗，轉(zhuǎn)移至S1培養(yǎng)基的小瓶內(nèi)生根。在生根培養(yǎng)基上繁殖約6周之后，將此植株轉(zhuǎn)移至土壤，使之逐漸變強壯。
將在培養(yǎng)中再生的Desiree植株移植至1加侖容量的花盆中，在溫室條件下生長至成熟。收獲塊莖，使其在室溫下栓化二天。收集長度大于2cm的所有塊莖，在4℃高濕度下貯存。E田間試驗將未轉(zhuǎn)化的對照，表達SPL構(gòu)建體的植株，以及表達SPH構(gòu)建體的植株，按單重復隨機化設計在田間試驗中繁殖。使所有的植株在同一田間并排生長，接受相似的農(nóng)藥，肥料和灌溉安排。收獲塊莖，先在10℃貯存2周，然后從每個品系隨機選擇部分塊莖置于4℃貯存。F糖分析將塊莖貯存于4℃，不允許其在室溫下恢復就立即進行糖分析測定。從每個塊莖的中心部分切取完整的縱向切片(1cm厚，寬度可變，相當于塊莖的外徑)，這代表所有的塊莖組織，每次收獲時，將來自每個克隆(3個重復樣品)的4個塊莖的中心塊共同切成1cm的小立方體，從此合并的組織隨機選擇15g用于分析。用polytron勻漿器，在4℃下以含有2mM硫酸氫鈉，2mM EDTA，0.5mM PMSF和10％(w/w)甘油的15ml Tris緩沖液(50mM，pH7.0)提取葡聚糖磷酸化酶(見下面)和糖類。將提取液在4℃離心(30000g，30分鐘)，然后將上清液稀釋10倍，用裝有折光指數(shù)檢測器的Spectra Physics高效液相層析儀測定還原糖(葡萄糖和蔗糖)。在80℃下，在30×0.78cm的Aminex HPX 87C柱(Biorad)上，用0.6ml/分鐘流速的水作流動相進行分離。借助于標準d-葡萄糖和d-蔗糖對儀器進行校準。Gα葡聚糖磷酸化酶活性分析對貯存于4℃的塊莖，不使其溫暖就立即進行提取和α葡聚糖磷酸化酶活性和同功酶分析。按Steup(1990)所述的方法，測定葡聚糖磷酸化酶在體外磷酸化反應中的活性。簡單地說，是將所獲得用于糖分析的提取物樣品加到一種反應基質(zhì)中，這種反應基質(zhì)通過葡糖磷酸變位酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的連續(xù)反應，使淀粉的磷酸化作用與NADP的還原作用相偶聯(lián)。此反應過程中NADP的還原速率與從淀粉基質(zhì)葡萄糖-1-磷酸產(chǎn)生的速率具有理想的化學計量配比。用Varian Cary雙光束分光光度計在340nm對NADP的還原作用進行了監(jiān)測。按照Bredford(1976)的方法測定了提取物中的蛋白質(zhì)的水平。
基本上按照Steup(1990)的方法，進行了葡聚糖磷酸化酶活性的凝膠展開。在含有1.5％糖原的天然聚丙烯酰胺凝膠(8.5％)上蛋白質(zhì)被分開了。在80V電泳15小時(4℃)之后，將凝膠在37℃在含有20mM葡萄糖-1-磷酸和0.05％(w/v)水解馬鈴薯淀粉的0.1M檸檬酸-NaOH緩沖液(pH6.0)中溫育(1-2小時)。然后漂洗凝膠，以碘溶液染色。為了蛋白質(zhì)印跡分析，如上所述使蛋白質(zhì)在含糖原的聚丙烯酰胺凝膠上電泳。將蛋白質(zhì)電印跡至硝酸纖維素膜，以針對GHTP和GLTP產(chǎn)生的多克隆抗體對印跡進行探測。與偶聯(lián)于抗兔第二抗體的堿性磷酸酶(Sigma)形成免疫印跡。H薯片顏色測定將5個表達GLTP反義序列的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系，2個表達GHTP反義序列的轉(zhuǎn)基因品系，非轉(zhuǎn)基因Desiree對照品系，以及2個以pBI121載體T-DNA轉(zhuǎn)化的對照品系，在加拿大Alberta的田間條件下培植生長。塊莖收獲后貯存在10℃和4℃。通過對每個品質(zhì)的樣品作中心切片，在豆油中205°F油炸約3分鐘直至起泡為止，對所有馬鈴薯品系的薯片顏色進行了測定。I結(jié)果從相同的栽培種(Desiree)，相同的年齡，以及在同樣生長條件下并排生長的植株收獲了所有的塊莖。塊莖的RNA印跡分析顯示出在表達同源反義轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)基因植株中，內(nèi)源性GLTP轉(zhuǎn)錄有相當大的降低(圖5)。葡聚糖磷酸化酶測定顯示，對于表達GLTp反義DNA的轉(zhuǎn)基因植株，在收獲時，以及在收獲后至少6個月，其活性(μmol NADPH/mg蛋白質(zhì)/小時)降低了(表1)。制成表1的結(jié)果表明，相對于野生型對照株，對于各種轉(zhuǎn)化的馬鈴薯品種，在4℃貯存了189天的塊莖中，α葡聚糖磷酸化酶的活性降低了大約16％-70％?；钚阅z電泳和蛋白質(zhì)印跡分析顯示出同源性酶特別低的表達，以及異源性酶降低較少的表達(圖8)。對于同源性產(chǎn)物的這種特異性，可能是由于磷酸化酶間的差異引起的(圖3和4)。
對收獲時(0天)的塊莖分析表明，與對照塊莖相比較，那些表達反義GLTP轉(zhuǎn)錄物的塊莖具有低達1/5的還原糖(表2)。而且，4℃貯存91天后，與野生型對照株相比較，轉(zhuǎn)化的塊莖降低了28-39％的還原糖濃度。在表達反義GLTP轉(zhuǎn)錄物的塊莖中，葡萄糖和果糖的濃度都顯著降低了(表3和4)。這些結(jié)果暗示，降低的GLTP活性減慢了塊莖中淀粉變成還原性糖的分解代謝過程，而對照塊莖中糖在持續(xù)地積累。總磷酸化酶活性和還原性糖之間的這種相互關系不是直接的，這表明在淀粉的分解代謝過程中某些磷酸化酶的同功酶可能起較重要的作用；與其它方式相比，降低表達特定磷酸化酶同功酶的特異性水平可能是比較最有利的方式；以及/或者可能還存在未發(fā)現(xiàn)的與還原糖水平降低有關的相互作用。
表達反義GLTP或GHTP轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株已在田間條件下種植，并且它們的塊莖貯存在4℃。在冷貯存之前以及冷貯存86和124天之后，測定了與糖含量相關的薯片顏色。相對于在同樣條件下貯存的對照塊莖薯片顏色(較暗)，來自表達反義GLTP轉(zhuǎn)染物的所有轉(zhuǎn)基因植株塊莖的薯片顏色有顯著的改善(較淺)(表5和圖7)。在分別在10℃和4℃貯存86天后，當用Agtron E-15-FP型直讀式簡易分光光度計(Agtron Inc.1095 Spice Island Drive #100，Sparks Nevada89431)測定時，來自表達GLTP轉(zhuǎn)錄物的“Desiree”馬鈴薯植株塊莖的薯片記分改善了至少4.3個點和8.9個點。相對于野生型，4℃貯存124天后測定的GLTP轉(zhuǎn)化體薯片記分改善了44％-89％(表5)。
Desiree栽培種不是用于薯片的商業(yè)上所希望的馬鈴薯，由它具有高含量天然糖類，并且在冷貯存中傾向于迅速變甜。然而，使用轉(zhuǎn)化的“Desiree”馬鈴薯，發(fā)現(xiàn)油炸薯片顏色有顯著的改善。可以預料，如果將本發(fā)明的方法用于商業(yè)加工的馬鈴薯品種，將可獲得優(yōu)等淺色的薯片。
對貯存于10℃和4℃的塊莖分析表明，那些表達反義GHTP轉(zhuǎn)錄物的塊莖，有時可提供比對照塊莖顏色淺的油炸薯片，指示有較低的還原糖積累(表5)。顯示異源性和同源性磷酸化酶活性降低的結(jié)果(圖8)指示，這種改善可能是一種或二種磷酸化酶活性降低的結(jié)果。但是，這些結(jié)果暗示，在淀粉變成還原糖的分解代謝中，L-型磷酸化酶起重要的作用。
進而這些結(jié)果還表明，在野生型植株塊莖和表達塊莖磷酸化酶反義RNA的塊莖之間，還原糖水平(表2)和薯片記分(表5)的差異，在長時間貯存過程中是持久的。如在表5中所示，在86天和124天薯片記分大致相同。在4℃貯存49天和91天之后，還原糖濃度也未見進一步明顯增加(表2)。糖濃度的這種平均狀態(tài)可能與塊莖磷酸化酶的動力學有關。這種保持較低糖水平的能力，有可能使貯存期延長至少幾個月。目前，待加工的馬鈴薯在10℃-12℃通常最多只能貯存3-6個月，其后糖積累將達到降低品質(zhì)的水平。必須進口新鮮的產(chǎn)品，直至可得到馬鈴薯的季節(jié)。延長馬鈴薯貯存期數(shù)月，可減少進口費用。
表6給出了一個改善百分數(shù)的概括結(jié)果，顯示相對于未轉(zhuǎn)化的對照植株，以來自GLTP基因序列(ATL3-ATL9)，和GHTP基因序列(ATH1，和TH2)的反義DNA轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植株的塊莖，其各種改善的塊莖冷貯存特征的改善百分數(shù)。從概括于表6中的結(jié)果表明，通過本發(fā)明的方法，可恒定地獲得塊莖冷貯存特征的重大改善。特別值得注意的是，貯存于4℃大約4個月(124天)之后觀察到的優(yōu)于野生型的薯片記分百分數(shù)改善。觀察到相對于野生型的薯片記分相對改善達到89％。改善的薯片記分反映出本發(fā)明的商業(yè)利用價值。也就是說，通過降低冷誘發(fā)的甜化，塊莖可貯存于較冷的溫度下，不會引起馬鈴薯油炸產(chǎn)品令人難以接受的變黑。
在收獲時和貯存91天之后，相對于野生型轉(zhuǎn)化的馬鈴薯品系糖積累減少，也證明本發(fā)明有顯著的優(yōu)點。糖積累降低與觀察到的薯片記分改善有關，并且還反映塊莖比重的改善，這是塊莖品質(zhì)的另一個重要的測定指標。
相對于野生型，轉(zhuǎn)化的品系即使在收獲時也觀察到薯片記分和糖積累降低的重大改善。因此，本發(fā)明的好處不局限于僅僅延長冷貯存時間之后產(chǎn)生的改善，并且包括收獲時出現(xiàn)的改善。在此意義上，本發(fā)明不僅僅局限于冷貯存特征的改善，并且包括塊莖品質(zhì)特征的改善，在收獲時的薯片記分或糖積累，造成成熟較早。
再回到表6中概括的特定改善，可以看到，相對于野生型，在收獲時，以及貯存91天和189天之后，GLTP型轉(zhuǎn)化體(ATL3-ATL9)的α葡聚糖磷酸化酶活性分別顯示出達66％，70％和69％的降低。相對于野生型在收獲時以及貯存91天和189天之后，絕大多數(shù)也顯示出超過10％和30％的改善。在貯存91天和189天之后，相對于野生型，GHTP-型轉(zhuǎn)化體(ATH1和ATH2)分別顯示出達28％和39％的相對改善，一般表現(xiàn)出至少10％的改善。
在收獲時和91天后，相對于野生型，GLTP-型轉(zhuǎn)化體分別顯示出達80％和39％的糖積累降低。在收獲時，所有的GLTP-型轉(zhuǎn)化體顯示出至少10％和至少30％的相對改善。在91天，所有的GLTP型轉(zhuǎn)化體顯示出至少10％的相對改善，絕大多數(shù)顯示出至少30％的相對改善。
在收獲時以及貯存86天和124天之后，相對于野生型，GLTP-型轉(zhuǎn)化體分別顯出達46％，89％，和89％的薯片記分改善。在收獲時以有貯存86天和124天之后，幾乎全都顯示出至少10％和30％的相對改善。在收獲時以及貯存86天和124天之后，相對于野生型，至少一個GHTP-型轉(zhuǎn)化體顯示出至少5％和至少10％的改善。貯存124天之后，至少一個GHTP-型轉(zhuǎn)化體顯示出達25％的薯片記分相對改善。
這些結(jié)果清楚地證明，通過本發(fā)明的方法，可容易地獲得塊莖冷貯存特征的重大改善。結(jié)果會有變，這是由于特別是重組的反義或有義DNA在植物基因組中插入的位置和存在的插入片段數(shù)目不同。重要的是，盡管在不同的轉(zhuǎn)化品系中間，其結(jié)果存在易變性，但是在單一馬鈴薯轉(zhuǎn)化品系中樣品間的結(jié)果幾乎沒有改變(見表1-5的附注)。對于所有用GHTP或GLTP反義DNA成功地轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植株品系，其結(jié)果顯示在表6中。因此，所有的轉(zhuǎn)化體都顯示出一個或幾個冷貯存特征的至少某些改善，如薯片記分增加(烹調(diào)后顏色較淡)和糖積累降低，并且大多數(shù)顯示出非常顯著的改善。根據(jù)在此實施例中所見到的大部分陽性轉(zhuǎn)化體，可以預料，應用本實施例中所述冷貯存特征測定程序，可容易地篩選出通過本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植株，以便鑒別表現(xiàn)有冷貯存特征顯著改善的轉(zhuǎn)化品系。通過將在此公開的技術用于商業(yè)重要性的馬鈴薯品種，將可能容易地產(chǎn)生和選擇出具有冷貯存特征顯著改善的轉(zhuǎn)化體。那些顯示出優(yōu)于野生型對照的最大相對改善的轉(zhuǎn)化體，可用于發(fā)展新的商用馬鈴薯品種。
表1反義轉(zhuǎn)錄物對葡聚糖磷酸化酶活性的影響，對從田間生長的“Desiree”塊莖的酶提取物測定結(jié)果。
葡聚糖磷酸酶活性在4℃貯存的時間(天)克隆 04991 140189μmol NADPH/mg蛋白質(zhì)/小時Wta10.5011.83 9.9411.90 13.04ATL3 4.90 4.86 4.49 4.73 4.88ATL411.45 7.17 8.0911.32 10.99ATL5 3.58 3.56 2.97 4.59 4.79ATL9 3.59 3.88 3.84 4.72 3.98LSD0.05b1.97 2.94 1.59 2.34 2.58LSD0.012.87 4.28 2.31 3.41 3.75克隆c0.01dWT vs.ATL′s 0.01天數(shù)NS克隆×天數(shù)0.05WT 11.49 8.9012.66 13.66ATH-110.40 9.6910.79 10.10ATH-2 6.46 6.40 6.56 8.38LSD0.05b2.02 0.41 3.00 NSLSD0.014.78 0.95 NS NS克隆c0.01WT vs.ATL′s 0.01天數(shù) 0.05克隆×天數(shù) NSaWT，未轉(zhuǎn)化的野生型塊莖。bLSD，對每種貯存時間在0.05或0.01水平的最小顯著性差異。c因子分析中變異的來源。d指示變異來源的顯著性水平。
表2反義GLTP轉(zhuǎn)錄物對田間生長的Desiree塊莖低溫誘導的甜化的影響還原性糖(葡萄糖+蔗糖)在4℃貯存的時間(天)克隆 0 49 91mg/g濕重Wta5.63 31.8 28.0ATL3 1.88 17.3 17.3ATL4 1.11 14.3 20.1ATL5 1.51 18.3 17.0ATL9 1.36 17.3 18.5WT vs.ATL′sb0.01 0.01 0.05克隆c0.01d天數(shù)0.01克隆×天數(shù)NSaWT，未轉(zhuǎn)化的野生型塊莖。bLSD，對每種貯存時間在0.05或0.01水平的最小顯著性差異。c因子分析中變異的來源。d指示變異來源的顯著性水平。
表3反義GLTP轉(zhuǎn)錄物對田間生長的Desiree塊莖低溫誘導的果糖積累的影響果糖在4℃貯存時間(天)克隆 0 49 91mg/g濕重Wta5.5315.10 12.20ATL3 1.21 8.408.79ATL4 0.79 7.228.56ATL5 0.6110.008.09ATL9 0.54 8.388.72WT vs.ATL′sb0.01 0.01 NS克隆c0.01d天數(shù)0.01克隆×天數(shù)NSaWT，未轉(zhuǎn)化的野生型塊莖。b在每個貯存期間對ANOVA的垂直比較。c因子分析中變異的來源。d指示變異來源的顯著性水平。
表4反義GLTP轉(zhuǎn)錄物對田間生長的“Desiree”塊莖低溫誘導的葡萄糖積累的影響葡萄糖在4℃貯存的時間(天)克隆 0 49 91mg/g濕重Wta2.1016.60 15.90ATL30.68 8.948.49ATL40.32 7.07 11.06ATL51.05 8.338.91ATL90.83 8.879.78WT vs.ATL′sb0.01 0.010.05克隆c0.01d天數(shù) 0.01克隆×天數(shù) NSaWT，未轉(zhuǎn)化的野生型塊莖。b在每個貯存期間對ANOVA的垂直比較。c因子分析中變異的來源。d指示變異來源的顯著性水平。
表5田間生長的“Desiree”塊莖薯片平均顏色。為了測定油炸馬鈴薯片的顏色，使用類似于工業(yè)用的Agtron計進行薯片顏色分級測定。在此讀數(shù)中，數(shù)值越大薯片產(chǎn)品顏色越淺，但顏色與讀數(shù)不呈直線關系。
收獲 86天 86天 124天10C 4C 4CWta26 25.3 15.417.1ATL3c25 37.4 26.730.8ATL4 35 43.7 29.132.3ATL5 36 29.6 24.724.6ATL9 38 38.7 24.326.6ATH1d26 49.7 17.521.4ATH2 29 31.2 15.615.9GMP1e3115.715.7GMP2 3516.716.6aAgtron Inc.1095 Spice Island Drive#100，Sparks Nevada 89431。Agtron model E-15-EP型(直讀式簡易分光光度計)。以雙光譜模式在紅外和綠光附近測定反射率。結(jié)果是6-8個薯片的測定值。薯片來自3個直徑約3-4cm的隨機選擇的塊莖。
bWT，陰性對照，野生型未轉(zhuǎn)化的塊莖。
cATL，用塊莖L-型α葡聚糖磷酸化酶轉(zhuǎn)化的塊莖。
dATH，用塊莖H-型α葡聚糖磷酸化酶轉(zhuǎn)化的塊莖。
eGMP，陰性對照，用pBI121 T-DNA轉(zhuǎn)化的塊莖。
表6結(jié)果摘要
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在此詳述中所提到的所有文獻都顯示出本發(fā)明涉及的本領域技術水平。正如每篇單獨的文獻被特別地單獨指明作為參考一樣，在此將所有的文獻引入作為參考。
雖然上述發(fā)明通過以明確理解為目的的說明和實施例，在某種程度上已被詳述，但是顯然，在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)還可以實施某些變化和修改。
序列表(1)一般信息(i)申請人Her Majesty the Queen in Right of Canada asRepresented by the Department of Agricultureand Agri-Food Canada(ii)發(fā)明名稱具有改善品質(zhì)特征的馬鈴薯及其生產(chǎn)方法(iii)序列數(shù)10(iv)通訊地址(A)地址Mckay-Carey & Company(B)街道2125 Commerce Place，10155-102nd Street(C)城市Edmonton(D)州Alberta(E)國家Canada(F)郵編T5J 4G8(v)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)目前申請資料(A)申請?zhí)朩O(B)申請日期10-FEB-1998(C)分類(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S 60/036,946(B)申請日期10-FEB-1997(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S 08/868,786(B)申請日期04-JUN-1997(viii)代理人/事務所信息(A)姓名Mckay-Carey，Mary Jane
(B)注冊號3790(C)參考/文檔號24002WO0(ix)電訊信息(A)電話(403)424-0222(B)電傳(403)421-0834(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度3101堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假設無(iv)反義無(vi)原始來源(A)生物體Solanum tuberosum(ix)特征(A)名稱/要點CDS(B)定位44..2944(D)其它信息/產(chǎn)物＝“馬鈴薯α葡聚糖L-型塊莖磷酸化酶”(ix)特征(A)名稱/要點成熟_肽(B)定位194..2941(ix)特征(A)名稱/要點信號_肽(B)定位44..193(xi)序列描述SEQ ID NO1ATCACTCTCA TTCGAAAAGC TAGATTTGCA TAGAGAGCAC AAA ATG GCG ACT GCA55Met Ala Thr Ala-50AAT GGA GCA CAC TTG TTC AAC CAT TAC AGC TCC AAT TCC AGA TTC ATC 103Asn Gly Ala His Leu Phe Asn His Tyr Ser Ser Asn Ser Arg Phe Ile-45 -40 -35CAT TTC ACT TCT AGA AAC ACA AGC TCC AAA TTG TTC CTT ACC AAA ACC 151His Phe Thr Ser Arg Asn Thr Ser Ser Lys Leu Phe Leu Thr Lys Thr-30 -25 -20 -15TCC CAT TTT CGG AGA CCC AAA CGC TGT TTC CAT GTC AAC AAT ACC TTG 199Ser His Phe Arg Arg Pro Lys Arg Cys Phe His Val Asn Asn Thr Leu-10 -5 1AGT GAG AAA ATT CAC CAT CCC ATT ACT GAA CAA GGT GGT GAG AGC GAC 247Ser Glu Lys Ile His His Pro Ile Thr Glu Gln Gly Gly Glu Ser Asp5 l0 15CTG AGT TCT TTT GCT CCT GAT GCC GCA TCT ATT ACC TCA AGT ATC AAA 295Leu Ser Ser Phe Ala Pro Asp Ala Ala Ser Ile Thr Ser Ser Ile Lys20 25 30TAC CAT GCA GAA TTC ACA CCT GTA TTC TCT CCT GAA AGG TTT GAG CTC 343Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Val Phe Ser Pro Glu Arg Phe Glu Leu35 40 45 50CCT AAG GCA TTC TTT GCA ACA GCT CAA AGT GTT CGT GAT TCG CTC CTT 391Pro Lys Ala Phe Phe Ala Thr Ala Gln Ser Val Arg Asp Ser Leu Leu55 60 65ATT AAT TGG AAT GCT ACG TAT GAT ATT TAT GAA AAG CTG AAC ATG AAG 439Ile Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys Leu Asn Met Lys70 75 80CAA GCG TAC TAT CTA TCC ATG GAA TTT GTG CAG GGT AGA GCA TTG TTA 487Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln Gly Arg Ala Leu Leu85 90 95AAT GCA ATT GGT AAT CTG GAG CTT ACT GGT GCA TTT GCG GAA GCT TTG 535Asn Ala Ile Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Ala Phe Ala Glu Ala Leu100 105 110AAA AAC CTT GGC CAC AAT CTA GAA AAT GTG GCT TCT CAG GAA CCA GAT 583Lys Asn Leu Gly His Asn Leu Glu Asn Val Ala Ser Gln Glu Pro Asp115 120 125 130GCT GCT CTT GGA AAT GGG GGT 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CCA TCA GCG GAT TTT GAT TTA 967Ser Leu Arg Leu Trp Ser Thr Gln Val Pro Ser Ala Asp Phe Asp Leu245 250 255TCT GCT TTC AAT GCT GGA GAG CAC ACC AAA GCA TGT GAA GCC CAA GCA 1015Ser Ala Phe Asn Ala Gly Glu His Thr Lys Ala Cys Glu Ala Gln Ala260 265 270AAC GCT GAG AAG ATA TGT TAC ATA CTC TAC CCT GGG GAT GAA TCA GAG 1063Asn Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Ile Leu Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Glu275 280 285 290GAG GGA AAG ATC CTT CGG TTG AAG CAA CAA TAT ACC TTA TGC TCG GCT 1111Glu Gly Lys Ile Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr Thr Leu Cys Ser Ala295 300 305TCT CTC CAA GAT ATT ATT TCT CGA TTT GAG AGG AGA TCA GGT GAT CGT 1159Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ser Arg Phe Glu Arg Arg Ser Gly Asp Arg310 315 320ATT AAG TGG GAA GAG TTT CCT GAA AAA GTT GCT GTG CAG ATG AAT GAC 1207Ile Lys Trp Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala Val Gln Met Asn Asp325 330 335ACT CAC CCT ACA CTT TGT ATC CCT GAG CTG ATG AGA ATA TTG ATA GAT 1255Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile Leu Ile Asp340 345 350CTG AAG GGC TTG AAT TGG AAT GAA GCT TGG 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ACT AAT GAT GAA GAT GAC ACT 1639Lys Val Glu Ala Ser Asp Lys Val Val Thr Asn Asp Glu Asp Asp Thr470 475 480GGT AAG AAA ACT AGT GTG AAG ATA GAA GCA GCT GCA GAA AAA GAC ATT 1687Gly Lys Lys Thr Ser Val Lys Ile Glu Ala Ala Ala Glu Lys Asp Ile485 490 495GAC AAG AAA ACT CCC GTG AGT CCG GAA CCA GCT GTT ATA CCA CCT AAG 1735Asp Lys Lys Thr Pro Val Ser Pro Glu Pro Ala Val Ile Pro Pro Lys500 505 510AAG GTA CGC ATG GCC AAC TTG TGT GTT GTG GGC GGC CAT GCT GTT AAT 1783Lys Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly His Ala Val Asn515 520 525 530GGA GTT GCT GAG ATC CAT AGT GAA ATT GTG AAG GAG GAG GTT TTC AAT 1831Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Glu Glu Val Phe Asn535 540 545GAC TTC TAT GAG CTC TGG CCG GAA AAG TTC CAA AAC AAA ACA AAT GGA 1879Asp Phe Tyr Glu Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly550 555 560GTG ACT CCA AGA AGA TGG ATT CGT TTC TGC AAT CCT CCT CTT AGT GCC 1927Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro Pro Leu Ser Ala565 570 575ATC ATA ACT AAG TGG ACT GGT ACA GAG GAT TGG GTC CTG AAA ACT GAA 1975Ile Ile Thr Lys Trp Thr Gly Thr Glu Asp Trp Val Leu Lys Thr Glu580 585 590AAG TTG GCA GAA TTG CAG AAG TTT GCT GAT AAT GAA GAT CTT CAA AAT 2023Lys Leu Ala Glu Leu Gln Lys Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu Gln Asn595 600 605 610GAG TGG AGG GAA GCA AAA AGG AGC AAC AAG ATT AAA GTT GTC TCC TTT 2071Glu Trp Arg Glu Ala Lys Arg Ser Asn Lys Ile Lys Val Val Ser Phe615 620 625CTC AAA GAA AAG ACA GGG TAT TCT GTT GTC CCA GAT GCA ATG TTT GAT 2119Leu Lys Glu Lys Thr Gly Tyr Ser Val Val Pro Asp Ala Met Phe Asp630 635 640ATT CAG GTA AAA CGC ATT CAT GAG TAC AAG CGA CAA CTG TTA AAT ATC 2167Ile Gln Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile645 650 655TTC GGC ATC GTT TAT CGG TAT AAG AAG ATG AAA GAA ATG ACA GCT GCA 2215Phe Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met Thr Ala Ala660 665 670GAA AGA AAG ACT AAC TTC GTT CCT CGA GTA TGC ATA TTT GGG GGA AAA 2263Glu Arg Lys Thr Asn Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys675 680 685 690GCT TTT GCC ACA TAT GTG CAA GCC 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tuberosum(ix)特征(A)名稱/要點CDS(B)定位12..2528(D)其它信息/產(chǎn)物＝“馬鈴薯α葡聚糖H-型塊莖磷酸化酶”(ix)特征(A)名稱/要點成熟_肽(B)定位12..2525(xi)序列描述SEQ ID NO3GTTTATTTTC C ATG GAA GGT GGT GCA AAA TCG AAT GAT GTA TCA GCA GCA 50Met Glu Gly Gly Ala Lys Ser Asn Asp Val Ser Ala Ala1 5 10CCT ATT GCT CAA CCA CTT TCT GAA GAC CCT ACT GAC ATT GCA TCT AAT98Pro Ile Ala Gln Pro Leu Ser Glu Asp Pro Thr Asp Ile Ala Ser Asn15 20 25ATC AAG TAT CAT GCT CAA TAT ACT CCT CAT TTT TCT CCT TTC AAG TTT 146Ile Lys Tyr His Ala Gln Tyr Thr Pro His Phe Ser Pro Phe Lys Phe30 35 40 45GAG CCA CTA CAA GCA TAC TAT GCT GCT ACT GCT GAC AGT GTT CGT GAT 194Glu Pro Leu Gln Ala Tyr Tyr A la Ala Thr Ala Asp Ser Val Arg Asp50 55 60CGC TTG ATC AAA CAA TGG AAT GAC ACC TAT CTT CAT TAT GAC AAA GTT 242Arg Leu Ile Lys Gln Trp Asn Asp Thr Tyr Leu His Tyr Asp Lys Val65 70 75AAT CCA AAG CAA ACA TAC TAC TTA TCA ATG GAG TAT CTC CAG GGG CGA 290Asn Pro Lys Gln Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Tyr Leu Gln Gly Arg80 85 90GCT TTG ACA AAT GCA GTT GGA AAC TTA GAC ATC CAC AAT GCA TAT 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Ala Asp Tyr Val Ser Val Trp Pro Thr Lys Phe Gln465 470 475 480Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Ser485 490 495Pro Glu Leu Ser His Ile Ile Thr Lys Trp Leu Lys Thr Asp Gln Trp500 505 510Val Thr Asn Leu Glu Leu Leu Ala Asn Leu Arg Glu Phe Ala Asp Asn515 520 525Ser Glu Leu His Ala Glu Trp Glu Ser Ala Lys Met Ala Asn Lys Gln530 535 540Arg Leu Ala Gln Tyr Ile Leu His Val Thr Gly Val Ser Ile Asp Pro545 550 555 560Asn Ser Leu Phe Asp Ile Gln Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg565 570 575Gln Leu Leu Asn Ile Leu Gly Val Ile Tyr Arg Tyr Lys Lys Leu Lys580 585 590Gly Met Ser Pro Glu Glu Arg Lys Asn Thr Thr Pro Arg Thr Val Met595 600 605Ile Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys Arg Ile Val610 615 620Lys Leu Val Thr Asp Val Gly Asp Val Val Asn Ser Asp Pro Asp Val625 630 635 640Asn Asp Tyr Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asn Tyr Asn Val Ser Val645 650 655Ala Glu Met Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gln His Ile Ser Thr660 665 670Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Leu Asn675 680 685Gly Cys Leu Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg690 695 700Glu Glu Ile Gly Glu Asp Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Thr Ala Asp705 710 715 720Glu Val Pro Gln Leu Arg Lys Asp Arg Glu Asn Gly Leu Phe Lys Pro725 730 735Asp Pro Arg Phe Glu Glu Ala Lys Gln Phe Ile Arg Ser Gly Ala Phe740 745 750Gly Thr Tyr Asp Tyr Asn Pro Leu Leu Glu Ser Leu Glu Gly Asn Ser755 760 765Gly Tyr Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly His Asp Phe Pro Ser770 775 780Tyr Met Asp Ala Gln Ala Arg Val Asp Glu Ala Tyr Lys Asp Arg Lys785 790 795 800Arg Trp Ile Lys Met Ser Ile Leu Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Phe805 810 815Ser Ser Asp Arg Thr Ile Ser Gln Tyr Ala Lys Glu Ile Trp Asn Ile820 825 830Ala Glu Cys Arg Val Pro *835(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)長度3171堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假設無(iv)反義無(vi)原始來源(A)生物體Solanum tuberosum(ix)特征(A)名稱/要點CDS(B)定位87..3011(D)其它信息/產(chǎn)物＝“馬鈴薯α葡聚糖L-型葉磷酸化酶”(ix)特征(A)名稱/要點成熟_肽(B)定位330..3008(ix)特征(A)名稱/要點信號_肽(B)定位87..329(xi)序列描述SEQ ID NO5TTTTTTTTTT CAACATGCAC AACAATTATT TTGATTAAAT TTTGTATCTA AAAATTTAGC 60ATTTTGAAAT TCAGTTCAGA GACATC ATG GCA ACT TTT GCT GTC TCT GGA TTG 113Met Ala Thr Phe Ala Val Ser Gly Leu-81 -80 -75AAC TCA ATT TCA AGT ATT TCT AGT TTT AAT AAC AAT TTC AGA AGC AAA 161Asn Ser Ile Ser Ser Ile Ser Ser Phe Asn Asn Asn Phe Arg Ser Lys-70 -65 -60AAC TCA AAC ATT TTG TTG AGT AGA AGG AGG ATT TTA TTG TTC AGT TTT 209Asn Ser Asn Ile Leu Leu Ser Arg Arg Arg Ile Leu Leu Phe Ser Phe-55 -50 -45AGA AGA AGA AGA AGA AGT TTC TCT GTT AGC AGT GTT GCT AGT GAT CAA 257Arg Arg Arg Arg Arg Ser Phe Ser Val Ser Ser Val Ala Ser Asp Gln-40 -35 -30 -25AAG CAG AAG ACA AAG GAT TCT TCC TCT GAT GAA GGA TTT ACA TTA GAT 305Lys Gln Lys Thr Lys Asp Ser Ser Ser Asp Glu Gly Phe Thr Leu Asp-20 -15 -10GTT TTT CAG CCG GAC TCC ACG TCT GTT TTA TCA AGT ATA AAG TAT CAC 353Val Phe Gln Pro Asp Ser Thr Ser Val Leu Ser Ser Ile Lys Tyr His-5 1 5GCT GAG TTC ACA CCA TCA TTT TCT CCT GAG AAG TTT GAA CTT CCC AAG 401Ala Glu Phe Thr Pro Ser Phe Ser Pro Glu Lys Phe Glu Leu Pro Lys10 15 20GCA TAC TAT GCA ACT GCA GAG AGT GTT CGA GAT ACG CTC ATT ATA AAT 449Ala Tyr Tyr Ala Thr Ala Glu Ser Val Arg Asp Thr Leu Ile Ile Asn25 30 35 40TGG AAT GCC ACA TAC GAA TTC TAT GAA AAG ATG AAT GTA AAG CAG GCA 497Trp Asn Ala Thr Tyr Glu Phe Tyr Glu Lys Met Asn Val Lys Gln Ala45 50 55TAT TAC TTG TCT ATG GAA TTT CTT CAG GGA AGA GCT TTA CTC AAT GCT 545Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln Gly Arg Ala Leu Leu Asn Ala60 65 70ATT GGT AAC TTG GGG CTA ACC GGA CCT TAT GCA GAT GCT TTA ACT AAG 593Ile Gly Asn Leu Gly Leu Thr Gly Pro Tyr Ala Asp Ala Leu Thr Lys75 80 85CTC GGA TAC AGT TTA GAG GAT GTA GCC AGG CAG GAA CCG GAT GCA GCT 641Leu Gly Tyr Ser Leu Glu Asp Val Ala Arg Gln Glu Pro Asp Ala Ala90 95 100TTA GGT AAT GGA GGT TTA GGA AGA CTT GCT TCT TGC TTT CTG GAC TCA 689Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser105 110 115 120ATG GCG ACA CTA AAC TAC CCT GCA TGG GGC TAT GGA CTT AGA TAC CAA 737Met Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Gln125 130 135TAT GGC CTT TTC AAA CAG CTT ATT ACA AAA GAT GGA CAG GAG GAA GTT 785Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Leu Ile Thr Lys Asp Gly Gln Glu Glu Val140 145 150GCT GAA AAT TGG CTC GAG ATG GGA AAT CCA TGG GAA ATT GTG AGG AAT 833Ala Glu Asn Trp Leu Glu Met Gly Asn Pro Trp Glu Ile Val Arg Asn155 160 165GAT ATT TCG TAT CCC GTA AAA TTC TAT GGG AAG GTC ATT GAA GGA GCT 881Asp Ile Ser Tyr Pro Val Lys Phe Tyr Gly Lys Val Ile Glu Gly Ala170 175 180GAT GGG AGG AAG GAA TGG GCT GGC GGA GAA GAT ATA ACT GCT GTT GCC 929Asp Gly Arg Lys Glu Trp Ala Gly Gly Glu Asp Ile Thr Ala Val Ala185 190 195 200TAT GAT GTC CCA ATA CCA GGA TAT AAA ACA AAA ACA ACG ATT AAC CTT 977Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Lys Thr Thr Ile Asn Leu205 210 215CGA TTG TGG ACA ACA AAG CTA GCT GCA GAA GCT TTT GAT TTA TAT GCT 1025Arg Leu Trp Thr Thr Lys Leu Ala Ala Glu Ala Phe Asp Leu Tyr Ala220 225 230TTT AAC AAT GGA GAC CAT GCC AAA GCA TAT GAG GCC CAG AAA AAG GCT 1073Phe Asn Asn Gly Asp His Ala Lys Ala Tyr Glu Ala Gln Lys Lys Ala235 240 245GAA AAG ATT TGC TAT GTC TTA TAT CCA GGT GAC GAA TCG CTT GAA GGA 1121Glu Lys Ile Cys Tyr Val Leu Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Leu Glu Gly250 255 260AAG ACG CTT AGG TTA AAG CAG CAA TAC ACA CTA TGT TCT GCT TCT CTT 1169Lys Thr Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu265 270 275 280CAG GAC ATT ATT GCA CGG TTC GAG AAG AGA TCA GGG AAT GCA GTA AAC 1217Gln Asp Ile Ile Ala Arg Phe Glu Lys Arg Ser Gly Asn Ala Val Asn285 290 295TGG GAT CAG TTC CCC GAA AAG GTT GCA GTA CAG ATG AAT GAC ACT CAT 1265Trp Asp Gln Phe Pro Glu Lys Val Ala Val Gln Met Asn Asp Thr His300 305 310CCA ACA CTT TGT ATA CCA GAA CTT TTA AGG ATA TTG ATG GAT GTT AAA 1313Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Leu Arg Ile Leu Met Asp Val Lys315 320 325GGT TTG AGC TGG AAG CAG GCA TGG GAA ATT ACT CAA AGA ACG GTC GCA 1361Gly Leu Ser Trp Lys Gln Ala Trp Glu Ile Thr Gln Arg Thr Val Ala330 335 340TAC ACT AAC CAC ACT GTT CTA CCT GAG GCT CTT GAG AAA TGG AGC TTC 1409Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Phe345 350 355 360ACA CTT CTT GGT GAA CTG CTT CCT CGG CAC GTG GAG ATC ATA GCA ATG 1457Thr Leu Leu Gly Glu Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile Ile Ala Met365 370 375ATA GAT GAG GAG CTC TTG CAT ACT ATA CTT GCT GAA TAT GGT ACT GAA 1505Ile Asp Glu Glu Leu Leu His Thr Ile Leu Ala Glu Tyr Gly Thr Glu380 385 390GAT CTT GAC TTG TTG CAA GAA AAG CTA AAC CAA ATG AGG ATT CTG GAT 1553Asp Leu Asp Leu Leu Gln Glu Lys Leu Asn Gln Met Arg Ile Leu Asp395 400 405AAT GTT GAA ATA CCA AGT TCT GTT TTG GAG TTG CTT ATA AAA GCC GAA 1601Asn Val Glu Ile Pro Ser Ser Val Leu Glu Leu Leu Ile Lys Ala Glu410 415 420GAA AGT GCT GCT GAT GTC GAA AAG GCA GCA GAT GAA GAA CAA GAA GAA 1649Glu Ser Ala Ala Asp Val Glu Lys Ala Ala Asp Glu Glu Gln Glu Glu425 430 435 440GAA GGT AAG GAT GAC AGT AAA GAT GAG GAA ACT GAG GCT GTA AAG GCA 1697Glu Gly Lys Asp Asp Ser Lys Asp Glu Glu Thr Glu Ala Val Lys Ala445 450 455GAA ACT ACG AAC GAA GAG GAG GAA ACT GAG GTT AAG AAG GTT GAG GTG 1745Glu Thr Thr Asn Glu Glu Glu Glu Thr Glu Val Lys Lys Val Glu Val460 465 470GAG GAT AGT CAA GCA AAA ATA AAA CGT ATA TTC GGG CCA CAT CCA AAT 1793Glu Asp Ser Gln Ala Lys Ile Lys Arg Ile Phe Gly Pro His Pro Asn475 480 485AAA CCA CAG GTG GTT CAC ATG GCA AAT CTA TGT GTA GTT AGC GGG CAT 1841Lys Pro Gln Val Val His Met Ala Asn Leu Cys Val Val Ser Gly His490 495 500GCA GTT AAC GGT GTT GCT GAG ATT CAT AGT GAA ATA GTT AAG GAT GAA 1889Ala Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Asp Glu505 510 515 520GTT TTC AAT GAA TTT TAC AAG TTA TGG CCA GAG AAA TTC CAA AAC AAG 1937Val Phe Asn Glu Phe Tyr Lys Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gln Asn Lys525 530 535ACA AAT GGT GTG ACA CCA AGA AGA TGG CTA AGT TTC TGT AAT CCA GAG 1985Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Leu Ser Phe Cys Asn Pro Glu540 545 550TTG AGT GAA ATT ATA ACC AAG TGG ACA GGA TCT GAT GAT TGG TTA GTA 2033Leu Ser Glu Ile Ile Thr Lys Trp Thr Gly Ser Asp Asp Trp Leu Val555 560 565AAC ACT GAA AAA TTG GCA GAG CTT CGA AAG TTT GCT GAT AAC GAA GAA 2081Asn Thr Glu Lys Leu Ala Glu Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asn Glu Glu570 575 580CTC CAG TCT GAG TGG AGG AAG GCA AAA GGA AAT AAC AAA ATG AAG ATT 2129Leu Gln Ser Glu Trp Arg Lys Ala Lys Gly Asn Asn Lys Met Lys Ile585 590 595 600GTC TCT CTC ATT AAA GAA AAA ACA GGA TAC GTG GTC AGT CCC GAT GCA 2177Val Ser Leu Ile Lys Glu Lys Thr Gly Tyr Val Val Ser Pro Asp Ala605 610 615ATG TTT GAT GTT CAG ATC AAG CGC ATC CAT GAG TAT AAA AGG CAG CTA 2225Met Phe Asp Val Gln Ile Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu620 625 630TTA AAT ATA TTT GGA ATC GTT TAT CGC TAT AAG AAG ATG AAA GAA ATG 2273Leu Asn Ile Phe Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met635 640 645AGC CCT GAA GAA CGA AAA GAA AAG TTT GTC CCT CGA GTT TGC ATA TTT 2321Ser Pro Glu Glu Arg Lys Glu Lys Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe650 655 660GGA GGA AAA GCA TTT GCT ACA TAT GTT CAG GCC AAG AGA ATT GTA AAA 2369Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile Val Lys665 670 675 680TTT ATC ACT GAT GTA GGG GAA ACA GTC AAC CAT GAT CCC GAG ATT GGT 2417Phe Ile Thr Asp Val Gly Glu Thr Val Asn His Asp Pro Glu Ile Gly685 690 695GAT CTT TTG AAG GTT GTA TTT GTT CCT GAT TAC AAT GTC AGT GTA GCA 2465Asp Leu Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala700 705 710GAA GTG CTA ATT CCT GGT AGT GAG TTG TCC CAG CAT ATT AGT ACT GCT 2513Glu Val Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gln His Ile Ser Thr Ala715 720 725GGT ATG GAG GCT AGT GGA ACC AGC AAC ATG AAA TTT TCA ATG AAT GGC 2561Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ser Met Asn Gly730 735 740TGC CTC CTC ATC GGG ACA TTA GAT GGT GCC AAT GTT GAG ATA AGA GAG 2609Cys Leu Leu Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu745 750 755 760GAA GTT GGA GAG GAC AAT TTC TTT CTT TTC GGA GCT CAG GCT CAT GAA 2657Glu Val Gly Glu Asp Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Gln Ala His Glu765 770 775ATT GCT GGC CTA CGA AAG GAA AGA GCC GAG GGA AAG TTT GTC CCG GAC 2705Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Glu Gly Lys Phe Val Pro Asp780 785 790CCA AGA TTT GAA GAA GTA AAG GCG TTC ATT AGG ACA GGC GTC TTT GGC 2753Pro Arg Phe Glu Glu Val Lys Ala Phe Ile Arg Thr Gly Val Phe Gly795 800 805ACC TAC AAC TAT GAA GAA CTC ATG GGA TCC TTG GAA GGA AAC GAA GGC 2801Thr Tyr Asn Tyr Glu Glu Leu Met Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly810 815 820TAT GGT CGT GCT GAC TAT TTT CTT GTA GGA AAG GAT TTC CCC GAT TAT 2849Tyr Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Asp Tyr825 830 835 840ATA GAG TGC CAA GAT AAA GTT GAT GAA GCA TAT CGA GAC CAG AAG AAA 2897Ile Glu Cys Gln Asp Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gln Lys Lys845 850 855TGG ACC AAA ATG TCG ATC TTA AAC ACA GCT GGA TCG TTC AAA TTT AGC 2945Trp Thr Lys Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Phe Lys Phe Ser860 865 870AGT GAT CGA ACA ATT CAT CAA TAT GCA AGA GAT ATA TGG AGA ATT GAA 2993Ser Asp Arg Thr Ile His Gln Tyr Ala Arg Asp Ile Trp Arg Ile Glu875 880 885CCT GTT GAA TTA CCT TAA AAGTTAGCCA GTTAAAGGAT GAAAGCCAAT 3041Pro Val Glu Leu Pro *890TTTTTCCCCC TGAGGTTCTC CCATACTGTT TATTAGTACA TATATTGTCA ATTGTTGCTA3101CTGAAATGAT AGAAGTTTTG AATATTTACT GTCAATAAAA TACAGTTGAT TCCATTTGAA3161AAAAAAAAA3171(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)長度975個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Ala Thr Phe Ala Val Ser Gly Leu Asn Ser Ile Ser Ser Ile Ser-81 -80 -75 -70Ser Phe Asn Asn Asn Phe Arg Ser Lys Asn Ser Asn Ile Leu Leu Ser-65 -60 -55 -50Arg Arg Arg Ile Leu Leu Phe Ser Phe Arg Arg Arg Arg Arg Ser Phe-45 -40 -35Ser Val Ser Ser Val Ala Ser Asp Gln Lys Gln Lys Thr Lys Asp Ser-30 -25 -20Ser Ser Asp Glu Gly Phe Thr Leu Asp Val Phe Gln Pro Asp Ser Thr-15 -10 -5Ser Val Leu Ser Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Ser Phe1 5 10 15Ser Pro Glu Lys Phe Glu Leu Pro Lys Ala Tyr Tyr Ala Thr Ala Glu20 25 30Ser Val Arg Asp Thr Leu Ile Ile Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Glu Phe35 40 45Tyr Glu Lys Met Asn Val Lys Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe50 55 60Leu Gln Gly Arg Ala Leu Leu Asn Ala Ile Gly Asn Leu Gly Leu Thr65 70 75Gly Pro Tyr Ala Asp Ala Leu Thr Lys Leu Gly Tyr Ser Leu Glu Asp80 85 90 95Val Ala Arg Gln Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly100 105 110Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Tyr Pro115 120 125Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Gln Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Leu130 135 140Ile Thr Lys Asp Gly Gln Glu Glu Val Ala Glu Asn Trp Leu Glu Met145 150 155Gly Asn Pro Trp Glu Ile Val Arg Asn Asp Ile Ser Tyr Pro Val Lys160 165 170 175Phe Tyr Gly Lys Val Ile Glu Gly Ala Asp Gly Arg Lys Glu Trp Ala180 185 190Gly Gly Glu Asp Ile Thr Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly195 200 205Tyr Lys Thr Lys Thr Thr Ile Asn Leu Arg Leu Trp Thr Thr Lys Leu210 215 220Ala Ala Glu Ala Phe Asp Leu Tyr Ala Phe Asn Asn Gly Asp His Ala225 230 235Lys Ala Tyr Glu Ala Gln Lys Lys Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Val Leu240 245 250 255Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Leu Glu Gly Lys Thr Leu Arg Leu Lys Gln260 265 270Gln Tyr Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ala Arg Phe275 280 285Glu Lys Arg Ser Gly Asn Ala Val Asn Trp Asp Gln Phe Pro Glu Lys290 295 300Val Ala Val Gln Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu305 310 315Leu Leu Arg Ile Leu Met Asp Val Lys Gly Leu Ser Trp Lys Gln Ala320 325 330 335Trp Glu Ile Thr Gln Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu340 345 350Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Phe Thr Leu Leu Gly Glu Leu Leu355 360 365Pro Arg His Val Glu Ile Ile Ala Met Ile Asp Glu Glu Leu Leu His370 375 380Thr Ile Leu Ala Glu Tyr Gly Thr Glu Asp Leu Asp Leu Leu Gln Glu385 390 395Lys Leu Asn Gln Met Arg Ile Leu Asp Asn Val Glu Ile Pro Ser Ser400 405 410 415Val Leu Glu Leu Leu Ile Lys Ala Glu Glu Ser Ala Ala Asp Val Glu420 425 430Lys Ala Ala Asp Glu Glu Gln Glu Glu Glu Gly Lys Asp Asp Ser Lys435 440 445Asp Glu Glu Thr Glu Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Asn Glu Glu Glu450 455 460Glu Thr Glu Val Lys Lys Val Glu Val Glu Asp Ser Gln Ala Lys Ile465 470 475Lys Arg Ile Phe Gly Pro His Pro Asn Lys Pro Gln Val Val His Met480 485 490 495Ala Asn Leu Cys Val Val Ser Gly His Ala Val Asn Gly Val Ala Glu500 505 510Ile His Ser Glu Ile Val Lys Asp Glu Val Phe Asn Glu Phe Tyr Lys515 520 525Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg530 535 540Arg Trp Leu Ser Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Glu Ile Ile Thr Lys545 550 555Trp Thr Gly Ser Asp Asp Trp Leu Val Asn Thr Glu Lys Leu Ala Glu560 565 570 575Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asn Glu Glu Leu Gln Ser Glu Trp Arg Lys580 585 590Ala Lys Gly Asn Asn Lys Met Lys Ile Val Ser Leu Ile Lys Glu Lys595 600 605Thr Gly Tyr Val Val Ser Pro Asp Ala Met Phe Asp Val Gln Ile Lys610 615 620Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile Phe Gly Ile Val625 630 635Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met Ser Pro Glu Glu Arg Lys Glu640 645 650 655Lys Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr660 665 670Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr Asp Val Gly Glu675 680 685Thr Val Asn His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val Val Phe690 695 700Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Val Leu Ile Pro Gly Ser705 710 715Glu Leu Ser Gln His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr720 725 730 735Ser Asn Met Lys Phe Ser Met Asn Gly Cys Leu Leu Ile Gly Thr Leu740 745 750Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Glu Asp Asn Phe755 760 765Phe Leu Phe Gly Ala Gln Ala His Glu Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu770 775 780Arg Ala Glu Gly Lys Phe Val Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Val Lys785 790 795Ala Phe Ile Arg Thr Gly Val Phe Gly Thr Tyr Asn Tyr Glu Glu Leu800 805 810 815Met Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly Tyr Gly Arg Ala Asp Tyr Phe820 825 830Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Asp Tyr Ile Glu Cys Gln Asp Lys Val835 840 845Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gln Lys Lys Trp Thr Lys Met Ser Ile Leu850 855 860Asn Thr Ala Gly Ser Phe Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile His Gln865 870 875Tyr Ala Arg Asp Ile Trp Arg Ile Glu Pro Val Glu Leu Pro *880 885 890(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)長度27堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假設無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部(vi)原始來源(A)生物體Solanum tuberosum(ix)特征(A)名稱/要點misc_特征(B)定位1..27(D)其它信息/功能＝“引物”/標記＝SPL1(xi)序列描述SEQ ID NO7ATTCGAAAAG CTCGAGATTT GCATAGA27(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)長度27堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假設無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部(vi)原始來源(A)生物體Solanum tuberosum(ix)特征(A)名稱/要點misc_特征(B)定位1..27(D)其它信息/功能＝“引物”/標記＝SPL2(xi)序列描述SEQ ID NO8GTTTATTTTC CATCGATGGA AGGTGGT 27(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)長度23堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假設無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部(vi)原始來源(A)生物體Solanum tuberosum(ix)特征(A)名稱/要點misc_特征(B)定位1..23(D)其它信息/功能＝“引物”/標記＝SPH1(xi)序列描述SEQ ID NO9GTGTGCTCTC GAGCATTGAA AGC23(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征(A)長度25堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假設無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部(vi)原始來源(A)生物體Solanum tuberosum(ix)特征(A)名稱/要點misc_特征(B)定位1..25(D)其它信息/功能＝“引物”/標記＝SPH2(xi)序列描述SEQ ID NO10ATAATATCCT GAATCGATGC ACTGC 2權(quán)利要求
1.一種具有改善的塊莖冷貯存特征的馬鈴薯植株，包括一種經(jīng)修飾的馬鈴薯植株，相對于由未經(jīng)修飾的馬鈴薯植株產(chǎn)生的塊莖，此修飾植株產(chǎn)生的塊莖中，具有降低的選自α葡聚糖L-型塊莖磷酸化酶(GLTP)和α葡聚糖H-型塊莖磷酸化酶(GHTP)的α葡聚糖磷酸化酶活性水平。
2.權(quán)利要求1的馬鈴薯植株，是以具有有效地連接于一個DNA序列的植物啟動子序列的表達盒轉(zhuǎn)化的，此DNA序列當在此植株中轉(zhuǎn)錄時，將抑制選自GLTP基因和GHTP基因的內(nèi)源性α葡聚糖磷酸化酶基因的表達。
3.一種具有改善的冷貯存特征的馬鈴薯植株，包括一種以具有有效地連接于一個DNA序列的植物啟動子序列的表達盒轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植株，此DNA序列包括編碼選自α葡聚糖L-型塊莖磷酸化酶(GLTP)和α葡聚糖H-型塊莖磷酸化酶(GHTP)的α葡聚糖磷酸化酶基因的至少20個核苷酸。
4.權(quán)利要求3的馬鈴薯植株，其中編碼的α葡聚糖磷酸化酶是GLTP。
5.權(quán)利要求3的馬鈴薯植株，其中編碼的α葡聚糖磷酸化酶是GHTP。
6.權(quán)利要求3的馬鈴薯植株，其中的DNA序列包含SEQ ID NO1的核苷酸338-993。
7.權(quán)利要求3的馬鈴薯植株，其中的DNA序列包含SEQ ID NO3的核苷酸147-799。
8.權(quán)利要求2，3，4，5，6或7中任何之一的馬鈴薯植株，其中的DNA序列按反義取向連接于啟動子序列。
9.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在收獲時測定的葡萄糖和果糖總濃度，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在收獲時測定的葡萄糖和果糖總濃度，低至少10％。
10.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在收獲時測定的葡萄糖和果糖總濃度，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在收獲時測定的葡萄糖和果糖總濃度，低至少30％。
11.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在收獲時測定的葡萄糖和果糖總濃度，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在收獲時測定的葡萄糖和果糖總濃度，低至少80％。
12.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在4℃貯存約3個月后的葡萄糖和果糖總濃度，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在相同條件下貯存后的葡萄糖和果糖總濃度，低至少10％。
13.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在4℃貯存約3個月后的葡萄糖和果糖總濃度，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在相同條件下貯存后的葡萄糖和果糖總濃度，低至少30％。
14.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在4℃貯存約3個月后的葡萄糖和果糖總濃度，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在相同條件下貯存后的葡萄糖和果糖總濃度，低至少39％。
15.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在收獲時測定的表示為所產(chǎn)生μmol NADPH/mg蛋白質(zhì)/小時的總α葡聚糖磷酸化酶活性，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在收獲時測定的總α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少10％。
16.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在收獲時測定的表示為所產(chǎn)生μmol NADPH/mg蛋白質(zhì)/小時的總α葡聚糖磷酸化酶活性，比未轉(zhuǎn)化的植物塊莖在收獲時測定的總α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少30％。
17.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在收獲時測定的表示為所產(chǎn)生μmol NADPH/mg蛋白質(zhì)/小時的總α葡聚糖磷酸化酶活性，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在收獲時測定的總α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少66％。
18.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在4℃貯存約3個月后測定的表示為所產(chǎn)生μmol NADPH/mg蛋白質(zhì)/小時的總α葡聚糖磷酸化酶活性，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在相同條件下貯存后的總α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少10％。
19.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在4℃貯存約3個月后測定的表示為所產(chǎn)生μmol NADPH/mg蛋白質(zhì)/小時的總α葡聚糖磷酸化酶活性，比未轉(zhuǎn)化的植物塊莖在相同條件下貯存后的總α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少30％。
20.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植物塊莖在4℃貯存約3個月后測定的表示為所產(chǎn)生μmol NADPH/mg蛋白質(zhì)/小時的總α葡聚糖磷酸化酶活性，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在相同條件下貯存后的總α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少70％。
21.權(quán)利要求5的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在4℃貯存約3個月后測定的表示為所產(chǎn)生μmol NADPH/mg蛋白質(zhì)/小時的總α葡聚糖磷酸化酶活性，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在相同條件下貯存后的總α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少10％。
22.權(quán)利要求5的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在4℃貯存約3個月后測定的表示為所產(chǎn)生μmol NADPH/mg蛋白質(zhì)/小時的總α葡聚糖磷酸化酶活性，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在相同條件下貯存后的總α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少28％。
23.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在4℃貯存約6個月后測定的表示為所產(chǎn)生μmol NADPH/mg蛋白質(zhì)/小時的總α葡聚糖磷酸化酶活性，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在相同條件下貯存后的總α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少10％。
24.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在4℃貯存約6個月后測定的表示為所產(chǎn)生μmol NADPH/mg蛋白質(zhì)/小時的總α葡聚糖磷酸化酶活性，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在相同條件下貯存后的總α葡聚糖磷酸酶活性，低至少30％。
25.權(quán)利要求4的馬鈴薯塊莖，其中該植株塊莖在4℃貯存約6個月后測定的表示為所產(chǎn)生μmol NADPH/mg蛋白質(zhì)/小時的總α葡聚糖磷酸化酶活性，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在相同條件下貯存后的總α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少69％。
26.權(quán)利要求5的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在4℃貯存約6個月后測定的表示為所產(chǎn)生μmol NADPH/mg蛋白質(zhì)/小時的總α葡聚糖磷酸化酶活性，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在相同條件下貯存后的總α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少10％。
27.權(quán)利要求5的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在4℃貯存約6個月后測定的表示為所產(chǎn)生μmol NADPH/mg蛋白質(zhì)/小時的總α葡聚糖磷酸化酶活性，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在相同條件下貯存后的總α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少39％。
28.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在收獲時測定的薯片記分，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在收獲時測定的薯片記分，高至少5％。
29.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在收獲時測定的薯片記分，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在收獲時測定的薯片記分，高至少30％。
30.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在收獲時測定的薯片記分，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在收獲時測定的薯片記分，高至少46％。
31.權(quán)利要求5的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在收獲時測定的薯片記分，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在收獲時測定的薯片記分，高至少5％。
32.權(quán)利要求5的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在收獲時測定的薯片記分，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在收獲時測定的薯片記分，高至少10％。
33.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在4℃貯存約3個月后的薯片記分，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在相同條件下貯存后的薯片記分，高至少5％。
34.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在4℃貯存約3個月后的薯片記分，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在相同條件下貯存后的薯片記分，高至少30％。
35.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在4℃貯存約3個月后的薯片記分，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在相同條件下貯存后的薯片記分，高至少89％。
36.權(quán)利要求5的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在4℃貯存約3個月后的薯片記分，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在相同條件下貯存后的薯片記分，高至少5％。
37.權(quán)利要求5的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在4℃貯存約3個月后的薯片記分，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在相同條件下貯存后的薯片記分，高至少10％。
38.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在4℃貯存約4個月后的薯片記分，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在相同條件下貯存后的薯片記分，高至少5％。
39.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在4℃貯存約4個月后的薯片記分，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在相同條件下貯存后的薯片記分，高至少30％。
40.權(quán)利要求4的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在4℃貯存約4個月后的薯片記分，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在相同條件下貯存后的薯片記分，高至少89％。
41.權(quán)利要求5的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在4℃貯存約4個月后的薯片記分，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在相同條件下貯存后的薯片記分，高至少5％。
42.權(quán)利要求5的馬鈴薯植株，其中該植株塊莖在4℃貯存約4個月后的薯片記分，比未轉(zhuǎn)化的植株塊莖在相同條件下貯存后的薯片記分，高至少25％。
43.一種改善馬鈴薯塊莖冷貯存特征的方法，包括提供一種馬鈴薯植株，此植株已被修飾降低了塊莖中選自α葡聚糖L-型塊莖磷酸化酶(GLTP)和α葡聚糖H-型塊莖磷酸化酶(GHTP)的α葡聚糖磷酸化酶活性水平。
44.權(quán)利要求43的方法，包括將具有有效地連接于一個DNA序列的植物啟動子序列的表達盒導入馬鈴薯植株，此DNA序列當在此植株中轉(zhuǎn)錄時，將抑制選自GLTP基因和GHTP基因的內(nèi)源性α葡聚糖磷酸化酶基因的表達。
45.一種改善馬鈴薯塊莖冷貯存特征的方法，包括將具有有效地連接于一個DNA序列的植物啟動子序列的表達盒導入馬鈴薯植株，此DNA序列包含編碼選自GLTP和GHTP的α葡聚糖磷酸化酶基因的至少20個核苷酸。
46.權(quán)利要求45的方法，其中編碼的α葡聚糖磷酸化酶是GLTP。
47.權(quán)利要求45的方法，其中編碼的α葡聚糖磷酸化酶是GHTP。
48.權(quán)利要求45的方法，其中的DNA序列包含SEQ ID NO1的核苷酸338-993。
49.權(quán)利要求45的方法，其中的DNA序列包含SEQ ID NO3的核苷酸147-799。
50.權(quán)利要求44，45，46，47，48，或49中任何之一的方法，其中的DNA序列按反義取向連接于啟動子序列。
全文摘要
提供了一種馬鈴薯植株,它表現(xiàn)出其塊莖中具有降低的α葡L－型塊莖磷酸化酶(GLTP)或α葡聚糖H－型塊莖磷酸化酶(GHTP)活性水平。特別是當貯存在低于7℃的溫度下,表現(xiàn)出具有降低的GLTP或GHTP酶活性的馬鈴薯塊莖中,淀粉變成糖的轉(zhuǎn)化作用降低了。馬鈴薯中冷甜化作用降低,使馬鈴薯可貯存在較低的溫度,導致休眠期延長,發(fā)病率降低,貯存壽命增加。還提供了產(chǎn)生這種馬鈴薯植株的方法,該植株可產(chǎn)生表現(xiàn)具有降低的GLTP或GHTP酶活性的塊莖。通過如下技術可實現(xiàn)使馬鈴薯塊莖中GLTP或GHTP活性降低:用同源性反義RNA抑制基因表達,應用共抑制,調(diào)節(jié)性沉默序列,化學的和蛋白質(zhì)抑制劑,或者應用位點定向誘變或分離可替換性等位基因,以便獲得具有降低的淀粉親和性或活性的GLTP或GHTP變體。
文檔編號A01H5/00GK1246894SQ98802413
公開日2000年3月8日 申請日期1998年2月5日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月10日
發(fā)明者L·M·考楚克, J·D·阿姆斯特隆, D·R·林奇, N·R·諾勒斯 申請人:加拿大農(nóng)業(yè)及農(nóng)業(yè)食品部