用于細胞動員中的硫酸葡聚糖的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 實施方案一般設及進入受試者血流中的細胞的動員。
[000引發(fā)明背景
[0003] 干細胞和祖細胞是具有分裂和發(fā)育W形成成熟系統(tǒng)的任何細胞類型的能力的未 成熟細胞。造血干細胞化SC)能夠產(chǎn)生免疫系統(tǒng)和骨髓的細胞。HSC移植化SCT)被用來 恢復患者的正常造血W治療在化療或放射后的各種疾病。在過去的幾十年中，HSCT已經(jīng)變 成各種病癥（包括多發(fā)性骨髓瘤（MM)、非霍奇金氏淋己瘤（NHL)和需要同種異體移植的病 癥）的臨床例行治療。不管在近幾年中的明顯改進，但是手術(shù)仍然與相當高的致病率和死 亡率相關(guān)聯(lián)，運是由于并發(fā)癥和原發(fā)疾病的復發(fā)。還繼續(xù)需要改進干細胞來源、細胞收獲程 序、調(diào)理療法和免疫抑制治療。存在兩種主要類型的服CT，或同種異體（其中干細胞源自相 容的健康供體）或自體，當干細胞從患者收集且在高劑量的化療/放療調(diào)理療法后的后期 給回相同患者。在同種異體W及特別是自體HSCT中，周邊血液如今具有與干細胞來源幾乎 完全更換的骨髓。作為細胞來源的周邊血液是優(yōu)選的，因為它設及供體的較少侵入式手術(shù) 且所移植細胞的植入相比于使用骨髓作為細胞來源的更加快速。
[0004] 不管在近幾年中的明顯改進，但是手術(shù)仍然與相當高的致病率和死亡率相關(guān)聯(lián)， 此由于移植相關(guān)性并發(fā)癥（主要是同種異體）和原發(fā)疾病的復發(fā)（主要是自體）導致。因 此，還繼續(xù)需要改進干細胞來源、細胞收獲方案、調(diào)理療法和免疫抑制治療。
[0005] 如今，干細胞是通過用粒細胞集落刺激因子（G-CS巧處理供體而動員到周邊 血液且所述細胞是通過血液成分分離術(shù)收集W供后續(xù)移植用。在輸注至接受者的血流 中后，健康造血細胞遷移到骨髓，在那它們可W分化產(chǎn)生成熟血液細胞并恢復造血。最 近，已經(jīng)批準普樂沙福（plerixafor) (M0Z0BIL?，AMD3100,1，1' -[1，4-亞苯基雙（亞甲 基）]-雙-1，4, 8, 11-四氮雜環(huán)四癸燒）與G-CSF組合來增加MM和饑正患者中祖細胞的動 員。
[0006] G-CSF和普樂沙福的組合治療的一個明顯局限是減緩干細胞動員。雖然小鼠中的 實驗數(shù)據(jù)指示在施用普樂沙福1小時后于動員干細胞中出現(xiàn)峰度roxmeyer 2005)，但是人 類中對應的峰是在施用普樂沙福約9小時后首次開始（Mozobil?產(chǎn)品專論）。由此，被動 員干細胞的收獲延遲直到施用普樂沙福約11小時后，運暗示長住院時間（Mozobil?產(chǎn)品專 論）。因此，實踐是普樂沙福需要在實際細胞收獲前的那天施用。
[0007] Sweeney 2000和Sweeney 2002研究硫酸化多糖（包括IOkDa的硫酸葡聚糖）在 小鼠和猴干細胞/祖細胞的動員中的效應。在小鼠和猴中，施用硫酸葡聚糖分別3小時和 6小時后，硫酸葡聚糖導致集落形成細胞（CFC)的動員。因此，在Sweeney 2000和Sweeney 2002中所呈現(xiàn)的結(jié)果似乎指示，就動員干細胞/祖細胞而言，硫酸葡聚糖比普樂沙福慢約 =倍。 發(fā)明概要
[0008] -般目標是提供一種祀細胞進入受試者血流中的有效動員。
[0009] 另一個一般目標是提供在受試者血流中高水平的被動員祀細胞。
[0010] 運些和其它目標是通過本文所公開的實施方案得到滿足。
[0011] 所述實施方案的一方面設及一種具有3500與9500化范圍內(nèi)的平均分子量的硫酸 葡聚糖，或其藥學上可接受的衍生物，其用于動員祖細胞和/或干細胞進入受試者的周邊 血液。所述實施方案的一個相關(guān)方面定義一種具有3500與9500化范圍內(nèi)的平均分子量的 硫酸葡聚糖，或其藥學上可接受的衍生物的用途，其用于制造動員祖細胞和/或干細胞進 入受試者的周邊血液的藥物。所述實施方案的另一相關(guān)方面定義一種動員祖細胞和/或干 細胞進入受試者的周邊血液的方法。所述方法包括施用有效量的具有3500與9500化范圍 內(nèi)的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其藥學上可接受的衍生物給所述受試者。
[0012] 所述實施方案的另一方面設及一種具有3500與9500化范圍內(nèi)的平均分子量的硫 酸葡聚糖，或其藥學上可接受的衍生物，其用于動員祀白血球，特別是淋己細胞進入受試者 的血流。所述實施方案的一相關(guān)方面定義一種具有3500與9500化范圍內(nèi)的平均分子量的 硫酸葡聚糖，或其藥學上可接受的衍生物的用途，其用于制造動員祀白血球，特別是淋己細 胞進入受試者的血流的藥物。所述實施方案的另一相關(guān)方面定義一種動員祀白血球，特別 是淋己細胞進入受試者的血流的方法。所述方法包括施用有效量的具有3500與9500化范 圍內(nèi)的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其藥學上可接受的衍生物給所述受試者。
[0013] 所述實施方案的又一方面設及一種細胞動員組合物，其包括具有3500與9500化 范圍內(nèi)的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其藥學上可接受的衍生物W及粒細胞集落刺激因 子（G-CSF)。所述實施方案的其它相關(guān)方面定義一種細胞動員組合物，其包括具有3500與 9500化范圍內(nèi)的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其藥學上可接受的衍生物和G-CSF，其用于 動員祖細胞和/或干細胞進入受試者的周邊血液和/或用于動員祀白血球，特別是淋己細 胞進入受試者的血流。所述實施方案的進一步相關(guān)方面定義一種細胞動員組合物的用途， 所述組合物包括具有3500與9500化范圍內(nèi)的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其藥學上可接 受的衍生物和G-CSF，其用于制造用于動員祖細胞和/或干細胞進入受試者的周邊血液和/ 或用于動員祀白血球，特別是淋己細胞進入受試者的血流的藥物。所述實施方案的還有其 它相關(guān)方面定義一種動員祖細胞和/或干細胞進入受試者的周邊血液或動員祀白血球，特 別是淋己細胞進入受試者的血流的方法。所述方法包括施用有效量的細胞動員組合物給所 述受試者，所述組合物包括具有3500與9500Da范圍內(nèi)的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其藥 學上可接受的衍生物和G-CSF。
[0014] 在一個實施方案中，所述藥學上可接受的衍生物優(yōu)選為硫酸葡聚糖的藥學上可接 受的鹽。
[0015] 本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)，關(guān)于平均分子量具有狹窄范圍的硫酸葡聚糖相比于具有更小或 更大平均分子量的硫酸葡聚糖分子實現(xiàn)顯著改進的細胞動員。
[0016] 具有低于本發(fā)明實施方案范圍的平均分子量的硫酸葡聚糖分子就動員祖細胞和/ 或干細胞或白血球而言并不具有任何明顯效果。具有高于本發(fā)明實施方案范圍的平均分 子量的硫酸葡聚糖分子似乎不具有任何加成效應W及當與其它細胞動員化合物諸如G-CSF 一起使用時沒有協(xié)同效應，且似乎相比于本發(fā)明實施例具有更緩慢的動員效應。
[0017] 本發(fā)明實施方案提供一種具有未預期動員特性的有效細胞動員，其幾乎在施用 硫酸葡聚糖后立即觸發(fā)細胞動員，被動員細胞的峰值已經(jīng)在施用硫酸葡聚糖后在小鼠中 7. 5-30分鐘內(nèi)且在人類中30-120分鐘內(nèi)開始。所述實施方案的硫酸葡聚糖分子可W額外 地與其它細胞動員化合物W協(xié)同方式組合來甚至進一步增加被動員細胞數(shù)量。
[0018] 附圖簡述
[0019] 所述實施方案連同其其它目標和優(yōu)點可最好通過參考W下描述W及附圖一起來 理解，其中：
[0020] 圖1說明通過單次S. C.注射硫酸葡聚糖（LMW-D巧或AMD3100相比于對照（巧樣 酸單水合物（CAM))所引發(fā)的白細胞動員。在3小時（LMW-D巧或1小時（AMD3100)后采集血 樣。顯示平均值±SEM。統(tǒng)計分析相對于對照組比較LMW-DS或AMD3100(卸<0. 05，**p<0. 01， ***p<0. 001)或相對于 AMD3100 比較 LMW-DS (.;p< 0.050.01，門;p< 0.001 )。
[0021] 圖2說明LMW-DS對HGF血液濃度的效應。用單次S. C.注射LMW-DS或AMD3100處 理動物。使用CAM作為媒介物對照。在3小時（LMW-D巧或1小時（AMD3100)后采集血樣。 顯示平均值+SEM。統(tǒng)計分析相對于對照組比較LMW-DS或AMD3100 (卸<0. 05, **卸<0. 001) 或相對于 AMD3100 比較 LMW-DS -WpO.OOl)。
[0022] 圖3說明通過單次i.V.注射LMW-DS和AMD3100到周邊血液的白細胞動員。使 用CAM作為媒介物對照。在30分鐘（LMW-DS和媒介物）或1小時（AMD3100)后采集血樣。 顯示平均值+SEM。統(tǒng)計分析相對于對照組比較LMW-DS或AMD3100 (*p<0. 05, **p<0. 01， ***p<0. 001)或相對于 AMD3100 比較 LMW-DS (';'p<〇.〇5，';-.;p<〇.〇I I)。
[0023] 圖4A和4B說明單次i.V.注射LMW-DS或s. c.注射AMD3100對動員周邊血液 中的造血集落形成細胞（CFC)的效應。使用CAM緩沖液（i.v.)作為媒介物對照。在30 分鐘（LMW-DS和媒介物）或1小時（AMD3100)后采集血樣。顯示平均值±SEM。統(tǒng)計 分析相對于對照組比較LMW-DS或AMD3100(*p<0. 05, **p<0. 01)或相對于AMD3100比較 LMW-DS C'p<0.05)〇
[0024]圖5說明在單次i.V.注射LMW-DS或CAM(對照）后被動員祖細胞師C)的祖細 胞亞型（C即-GM、C即-GEMM和B即-巧的區(qū)別。使用CAM緩沖液作為對照且此值是使用0值 (陰性對照）。顯示平均值±SEM。統(tǒng)計分析相對于對照組比較LMW-DS(*p<0. 05，*卸<0. 01， ***p<0.001)。
[00巧]圖6說明通過G-CSF和LMW-DS或G-CSF和AMD3100的組合相比于CAM緩沖液 (媒介物）所引發(fā)的白細胞動員。在30分鐘（LMW-DS和媒介物）或1小時（AMD3100)后 采集血樣。顯示平均值± SEM。統(tǒng)計分析相對于對照組比較G-CSF+LMW-DS或G-CSF和 AMD3100(G-CSF+CAM) (*p<0. 05, **p<0. 01，**卸<0. 001)或相對于 G-CSF+AMD3100 比較 G-CSF+LMW-DS (';p< 0.05，；-;p< 0.01，';'中中口< 0.001)。
[0026] 圖7A和7B說明G-CSF和LMW-DS或G-CSF和AMD3100在周邊血液中祖細胞動員 的組合治療。使用CAM緩沖液作為媒介物對照。在30分鐘（LMW-DS和媒介物）或1小時 (AMD3100)后采集血樣。顯示平均值±SEM。統(tǒng)計分析相對于對照組比較G-CSF+LMW-DS 或 G-CSF 和 AMD3100(G-CSF+CAM) (*p<0. 05, **p<0. 01)或相對于 G-CSF+AMD3100 比較 G-CSF+LMW-DS (-;'p< 0-05P < 0,01)。
[0027] 圖 8 說明在小鼠中單次注射 lOOmg/kg LMW-DS、G-CSF、G-CSF+LMW-DS、 G-CSF+AMD3100巧mg/kg)或CAM (媒介物）后祖細胞的動員的觀察。用G-CSF和LMW-DS的 組合治療相比于CAM緩沖液、LMW-DS和G-CSF顯著增加CFC數(shù)量。誤差棒顯示沈M，n = 6-10。
[0028] 圖 9 說明在小鼠中單次注射 lOOmg/kg LMW-DS、G-CSF、G-CSF+LMW-DS、 G-CSF+AMD3100巧mg/kg)或CAM (媒介物）后淋己細胞的動員的觀察。施用LMW-DS相比 于G-CSF或AMD3100的單一療法增加周邊血液中的淋己細胞，且與G-CSF組合，相比于 G-CSF+AMD3100增加顯著。誤差棒顯示沈M，n = 6-10。
[0029] 圖10說明硫酸葡聚糖對周邊血液中白血球的效應。用單次i. V.注射不同平均分 子量的硫酸葡聚糖值S3或DS5) W 50mg/kg的劑量處理動物。使用緩沖鹽水（化Cl)作為媒 介物對照。一些動物使用五己比妥鋼（PNB)代替異氣燒進行鎮(zhèn)靜，來比較不同麻醉方法的 效應。誤差棒顯示沈M。使用學生T檢驗來評估相比于對照組的統(tǒng)計上顯著差異（*p<0. 05， **p<0. 01，***p<0.001)。
[0030] 圖11說明硫酸葡聚糖對動員造血祖細胞進入周邊血液中的效應。用單次i. V.注 射不同平均分子量的硫酸葡聚糖值S3或DS5)或媒介物（化Cl)處理動物。誤差棒顯示沈M。 使用學生T檢驗來評估相比于對照組的統(tǒng)計上顯著差異（*p<0. 05)。
[0031] 圖12說明硫酸葡聚糖對增加周邊血液中的HGF水平的療效。用單次i. V.注射不 同平均分子量的硫酸葡聚糖值S3或DS5)或媒介物（化Cl)處理動物。誤差棒顯示沈M。使 用學生T檢驗來評估相比于對照組的統(tǒng)計上顯著差異（***p<0. 001)。
[0032] 圖 13 說明在接受 10 分鐘 i. V.輸注 15mg/kg LMW-DS (上圖）、18mg/kg LMW-DS (中 圖）或24mg/kg LMW-DS(下圖）在0時間時人類周邊血液中的淋己細胞的動員。黑線代表 平均淋己細胞水平且灰線代表單人類的淋己細胞水平。
【具體實施方式】
[0033] 本發(fā)明實施方案一般設及動物，優(yōu)選是哺乳動物且特別是人類的細胞動員。特定 來說，所述實施方案設及干細胞和/或祖細胞和/或特定白血球的動員，其可用于例如細胞 移植，包括造血干細胞移植化SCT)。
[0034] 所述實施方案是基