專利名稱：：硫酸角質(zhì)素寡聚糖級(jí)分及含該級(jí)分的藥劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及作為抗炎癥劑、抗過敏劑、免疫調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑及可以作為藥劑有效成分的硫酸角質(zhì)素寡聚糖。
背景技術(shù)：
：硫酸角質(zhì)素是以N-乙?；咸烟前窔埢?位O-硫酸化的N-乙?；樘前纷鳛榛窘Y(jié)構(gòu)的葡萄糖胺聚糖。特別是已知構(gòu)成二糖單元中的N-乙?；咸烟前窔埢?位以外的羥基進(jìn)一步被硫酸化的高硫酸化硫酸角質(zhì)素，存在于鯊魚等軟骨魚類、鯨魚、牛等的哺乳動(dòng)物的軟骨、骨、角膜中。作為生成其降解物硫酸角質(zhì)素寡聚糖的方法，有在硫酸角質(zhì)素中使用來自桿菌屬細(xì)菌的硫酸角質(zhì)素降解酶(角質(zhì)素酶II；日本專利申請公開2-57182號(hào)公報(bào))的報(bào)告。另外，對于用角質(zhì)素酶II降解來自牛軟骨的硫酸角質(zhì)素后，分級(jí)得到的25種低聚物糖級(jí)分進(jìn)行分析，推定用下述(I)式表示的四硫酸化N-乙?；樘前匪奶?以下，稱為“硫酸角質(zhì)素四糖(I)”用下述(II)式表示的三硫酸化N-乙?；樘前肺逄?以下，稱為“硫酸角質(zhì)素五糖(II)”、用下述(III)式表示的二硫酸化N-乙酰基乳糖胺二糖(以下，稱為“硫酸角質(zhì)素二糖(III)”等結(jié)構(gòu)的報(bào)告[Biochemistry，33，4836-4846(1994)。Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(I)NeuAc～Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(II)Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(III)(式中，Gal表示半乳糖、GlcN表示葡萄糖胺、Neu表示神經(jīng)氨酸、Ac表示乙?；?、6S表示6-0-硫酸酯。另外，～表示α2，3鍵或α2，6鍵。)可是，到目前為止，還沒有高效地，大量制備除去雜質(zhì)(例如內(nèi)毒素、核酸、蛋白質(zhì)、蛋白酶、硫酸角質(zhì)素寡聚糖以外的葡萄糖胺聚糖類等)的純的硫酸角質(zhì)素寡聚糖，特別是硫酸角質(zhì)素四糖(I)、硫酸角質(zhì)素五糖(II)及硫酸角質(zhì)素二糖(III)的報(bào)告。特別是這類雜質(zhì)的存在，對于以硫酸角質(zhì)素寡聚糖作為醫(yī)藥品使用時(shí)，存在致命的缺點(diǎn)。進(jìn)而，對于該硫酸角質(zhì)素寡聚糖的藥理作用(特別是抗炎癥作用、抗過敏作用、免疫調(diào)節(jié)作用、細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用)卻全然不知。發(fā)明公開本發(fā)明就是從上述觀點(diǎn)進(jìn)行研究的，是以基本上不混有雜質(zhì)的硫酸角質(zhì)素寡聚糖作為抗炎癥劑、抗過敏劑、免疫調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑(以下，稱為“分化誘導(dǎo)劑”)或細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑利用，作為研究課題。本發(fā)明人，為了解決上述課題，用硫酸角質(zhì)素降解酶降解高硫酸化硫酸角質(zhì)素，從其降解產(chǎn)物中，制備二～五糖單元的寡聚糖、特別是二糖、四糖及五糖單元的寡聚糖，對其藥理作用進(jìn)行認(rèn)真研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些寡聚糖及其鹽顯示了優(yōu)良的抗炎癥作用、抗過敏作用、免疫調(diào)節(jié)作用、細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明的抗炎癥劑、抗過敏劑、免疫調(diào)節(jié)劑、分化誘導(dǎo)劑或細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑(以下，將這些藥劑，總稱為“本發(fā)明的藥劑”)，是含有硫酸角質(zhì)素寡聚糖和/或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分的。本說明書中的“硫酸角質(zhì)素寡聚糖”是指用內(nèi)(endo)-β-N-乙?；咸烟前访感土蛩峤琴|(zhì)素降解酶，將硫酸角質(zhì)素進(jìn)行降解得到的硫酸角質(zhì)素的降解產(chǎn)物。作為本發(fā)明藥劑所用的硫酸角質(zhì)素寡聚糖，列出的是具有唾液酸和/或巖藻糖的硫酸化的N-乙?；樘前穯卧牧蛩峤琴|(zhì)素寡聚糖、在其還原末端上具有硫酸化的N-乙?；咸前返亩逄菃卧墓丫厶?，在1個(gè)分子中至少有2處的烴基硫酸化的硫酸角質(zhì)素寡聚糖，特別是上述的硫酸角質(zhì)素寡聚糖至少含有用Gal(6S)-GlcNAc(6S)(其中，Gal表示半乳糖、GlcN表示葡萄糖胺、Ac表示乙?；?、6S表示6-0-硫酸酯。)所示的二糖作為其構(gòu)成成分。進(jìn)而，作為上述硫酸角質(zhì)素寡聚糖，作為適宜的例子，可舉出用下述(I)式表示的四硫酸化N-乙酰基乳糖胺四糖、用(II)式表示的三硫酸化N-乙酰基乳糖胺五糖、用(III)式表示的二硫酸化N-乙?；樘前范堑取al(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(I)NeuAc～Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(II)Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(III)(式中，Gal表示半乳糖、GlcN表示葡萄糖胺、Neu表示神經(jīng)氨酸、Ac表示乙?；?S表示6-0-硫酸酯。另外，～表示α2，3鍵、或α2，6鍵。)本發(fā)明還提供了在還原末端具有硫酸化了的N-乙酰基葡萄糖胺的二～五糖單元的寡聚糖；提供了在1個(gè)分子中至少有2處羥基被99％以上硫酸化的硫酸角質(zhì)素寡聚糖的，并具有下述特性的硫酸角質(zhì)素寡聚糖級(jí)分。(a)基本上不含內(nèi)毒素，另外，核酸、蛋白質(zhì)、蛋白酶的含量在檢出界限以下。(b)基本上不含透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸類肝素及硫酸角質(zhì)素。另外，本發(fā)明提供含有99％以上的，至少以Gal(6S)-GlcNAc(6S)表示的二糖作為構(gòu)成成分的硫酸角質(zhì)素寡聚糖，且具有上述(a)及(b)特性的硫酸角質(zhì)素寡聚糖級(jí)分。另外，作為含在上述寡聚糖級(jí)分的硫酸角質(zhì)素寡聚糖，可舉出用上述(I)式表示的四硫酸化N-乙酰基乳糖胺四糖、用(II)式表示的三硫酸化N-乙?；樘前肺逄?、用(III)式表示的二硫酸化N-乙?；樘前范堑葍?yōu)選例子。進(jìn)而，作為這些硫酸角質(zhì)素寡聚糖，可舉出用內(nèi)-β-N-乙?；咸烟前访感土蛩峤琴|(zhì)素降解酶，將來自軟骨魚類的高硫酸化硫酸角質(zhì)素降解后、分級(jí)分離得到的硫酸角質(zhì)素寡聚糖。本發(fā)明進(jìn)一步包括將硫酸角質(zhì)素用具有下述理化性質(zhì)的硫酸角質(zhì)素降解酶降解的步驟和從降解生成物分離出具有下述性質(zhì)的硫酸角質(zhì)素寡聚糖的步驟，從而提供了硫酸角質(zhì)素寡聚糖的制備方法。①作用與硫酸角質(zhì)素作用，將其N-乙?；被咸烟擒真I進(jìn)行水解；②底物特異性與硫酸角質(zhì)素I、硫酸角質(zhì)素II及多硫酸角質(zhì)素作用，作為主要的降解物，生成硫酸化硫酸角質(zhì)素二糖及硫酸化硫酸角質(zhì)素四糖；優(yōu)選的，進(jìn)而還具有下述理化性質(zhì)③最適反應(yīng)pH4.5～6(0.1M醋酸緩沖液及10mMTris-醋酸緩沖液中，37℃)；④pH穩(wěn)定性6～7(0.1M醋酸緩沖液及10mMTris-醋酸緩沖液中，37℃、放置1小時(shí))；⑤最適反應(yīng)溫度50～60℃(0.1M醋酸緩沖液、pH6.0、反應(yīng)10分鐘)；⑥熱穩(wěn)定性至少在45℃以下穩(wěn)定(0.1M醋酸緩沖液、pH6.0、放置1小時(shí))。硫酸角質(zhì)素寡聚糖具有以下的性質(zhì)(A)以硫酸化N-乙酰乳糖胺為基本骨架的硫酸角質(zhì)素寡聚糖作為主成分；(B)基本上不含內(nèi)毒素，核酸、蛋白質(zhì)及蛋白酶含量在微量或檢出界限以下；(C)基本上不含透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸類肝素及硫酸角質(zhì)素。另外，在上述硫酸角質(zhì)素寡聚糖級(jí)分的制備方法中，例如，作為原料的硫酸角質(zhì)素，使用高硫酸化硫酸角質(zhì)素時(shí)，可得到用上述(I)式表示的四硫酸化N-乙?；樘前匪奶?、用(II)式表示的三硫酸化N-乙?；樘前肺逄?、用(III)式表示的二硫酸化N-乙?；樘前范堑鹊牧蛩峤琴|(zhì)素寡聚糖、特別是可得到用(I)式表示的四硫酸化N-乙酰基乳糖胺四糖及(III)式表示的二硫酸化N-乙?；樘前范菫橹鞒煞值牧蛩峤琴|(zhì)素寡聚糖。另外，在本發(fā)明中，優(yōu)選的二～五糖單元的硫酸角質(zhì)素寡聚糖，通常有2～4處被硫酸化。另外，在含有本發(fā)明可以使用的含唾液酸的硫酸角質(zhì)素寡聚糖中，作為唾液酸，可舉出N-乙酰基神經(jīng)氨酸及N-乙酰神經(jīng)氨酸，但優(yōu)選的是N-乙?；窠?jīng)氨酸。另外，唾液酸也可以使用α2，3鍵或α2，6鍵中的任何一種，但優(yōu)選的是α2，3鍵的。以下，詳細(xì)地說明本發(fā)明。<1>本發(fā)明所用的硫酸角質(zhì)素寡聚糖及硫酸角質(zhì)素寡聚糖級(jí)分本發(fā)明所用的，成為硫酸角質(zhì)素寡聚糖原料的硫酸角質(zhì)素，主要是以半乳糖或半乳糖-6-硫酸和N-乙酰基葡萄糖胺-6-硫酸的二糖重復(fù)結(jié)構(gòu)而構(gòu)成，依據(jù)動(dòng)物種類及器官等，硫酸含量不同，但通常從鯊魚等軟骨魚類、鯨魚、牛等哺乳動(dòng)物的軟骨、骨和角膜等原材料制備。作為原料使用的硫酸角質(zhì)素，通常只要是容易得到的，就沒有特別的限制，但優(yōu)選的是使用構(gòu)成糖的半乳糖殘基被硫酸化了的高硫酸化硫酸角質(zhì)素(將每個(gè)組成二糖，含有1.5～2分子硫酸基的高硫酸化硫酸角質(zhì)素，稱為多硫酸角質(zhì)素)。另外，作為半乳糖殘基的硫酸基位置，優(yōu)選的是6位。這樣的高硫酸化硫酸角質(zhì)素，例如可從鯊魚等軟骨魚類的軟骨的蛋白聚糖中取得。另外，也可使用市售的。本發(fā)明的硫酸角質(zhì)素寡聚糖，可通過在硫酸角質(zhì)素、優(yōu)選的是高硫酸化硫酸角質(zhì)素的緩沖溶液中，使內(nèi)-β-N-乙?；咸烟前访感土蛩峤琴|(zhì)素降解酶，例如來自桿菌屬細(xì)菌的角質(zhì)酶II(日本專利申請公開2-57182號(hào)公報(bào))，或本發(fā)明者們，從屬于桿菌屬細(xì)菌中新發(fā)現(xiàn)的新的硫酸角質(zhì)素降解酶作用、降解后，將得到的降解物分級(jí)分離后而得到。該降解反應(yīng)是在硫酸角質(zhì)素濃度為1.0～100mg/ml、調(diào)節(jié)成pH為6.0～7.0的緩沖溶液，溫度在25～40℃下，反應(yīng)1～72小時(shí)下進(jìn)行的。此時(shí)，緩沖溶液的濃度通常是0.01-0.2M。作為緩中液，只要可調(diào)節(jié)到上述pH范圍，就可以，對于種類沒有特別限制，例如可舉出醋酸緩中液、磷酸緩中液、Tris緩沖液。另外，用于降解反應(yīng)的酶量，對于硫酸角質(zhì)素1g，可使用從0.1～1.0單位。在此，所說的1單位，是指在1分鐘內(nèi)，生成相當(dāng)于1μmol的N-乙?；咸烟前返倪€原末端的酶量。上述新的硫酸角質(zhì)素降解酶是產(chǎn)生環(huán)狀芽胞桿菌，例如由本發(fā)明者們分離的環(huán)狀芽胞桿菌KsT202株產(chǎn)生的酶，是熱穩(wěn)定性優(yōu)良的硫酸角質(zhì)素降解酶。該酶是通過在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)環(huán)狀芽胞桿菌KsT202株，從該培養(yǎng)基或/和細(xì)菌菌體，按照通常的酶的精制法進(jìn)行純化而得到的。于平成6年9月5日，將環(huán)狀芽胞桿菌KsT202株，以微生物保藏號(hào)FERMP-14516，保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵政編碼305日本國茨城縣筑波市東一丁目1番3號(hào))中，于平成7年11月6日，根據(jù)布達(dá)佩斯條約，轉(zhuǎn)移到國際保藏，以保藏號(hào)為FERMBP-5285進(jìn)行保藏。另外，以下，表示上述新的硫酸角質(zhì)素降解酶的理化性質(zhì)。①作用與硫酸角質(zhì)素作用，將其N-乙酰基氨基葡萄糖苷鍵進(jìn)行水解。②底物特異性與硫酸角質(zhì)素I、硫酸角質(zhì)素II及多硫酸角質(zhì)素作用，作為主要的降解物，生成硫酸化硫酸角質(zhì)素二糖及硫酸化硫酸角質(zhì)素四糖。另外，也可確認(rèn)生成硫酸化硫酸角質(zhì)素五糖。③最適反應(yīng)pH4.5～6(在0.1M醋酸緩沖液及10mMTris-醋酸緩沖液中，37℃)④pH穩(wěn)定性6～7(在0.1M醋酸緩中液及10mMTris-醋酸緩中液中，37℃、放置1小時(shí))⑤最適反應(yīng)溫度50～60℃(0.1M醋酸緩中液、pH6.0、反應(yīng)10分鐘)⑥熱穩(wěn)定性至少在45℃以下穩(wěn)定(0.1M醋酸緩沖液、pH6.0、放置1小時(shí))。在制備本發(fā)明的硫酸角質(zhì)素寡聚糖級(jí)分時(shí)，可使用這樣新的硫酸角質(zhì)素降解酶和上述角質(zhì)酶II等的硫酸角質(zhì)素降解酶進(jìn)而使用常規(guī)方法固定化的固定化酶來進(jìn)行反應(yīng)。通過上述的酶的降解反應(yīng)，可將硫酸角質(zhì)素降解寡聚糖。接著，通過通常的分離提純方法，例如用乙醇沉淀和各種色譜進(jìn)行純化，可分離提純出作為目的物的硫酸角質(zhì)素寡聚糖。以二糖、四糖及五糖的硫酸角質(zhì)素寡聚糖為例，進(jìn)一步詳細(xì)地說明該提純方法，通常，首先通過乙醇沉淀，濃縮上述降解產(chǎn)物，接著，進(jìn)行凝膠過濾(分級(jí)分離分子量范圍100～10,000)，分別大致粗分級(jí)為二糖、四糖、五糖附近的硫酸角質(zhì)素寡聚糖。進(jìn)而，通過陰離子交換色譜，將該粗級(jí)分分離、分級(jí)成基本上不含內(nèi)毒素，另外核酸、蛋白質(zhì)、蛋白酶的含量在檢出界限以下，進(jìn)而，基本上，不含透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸類肝素及硫酸角質(zhì)素，即基本上分離、分級(jí)成純的二糖、四糖及五糖。本發(fā)明中，所說“基本上不含”是指可通過靈敏度高的檢出法檢出，但對于硫酸角質(zhì)素寡聚糖的藥理作用(抗炎癥作用、抗過敏作用、免疫調(diào)節(jié)作用、細(xì)胞分化誘導(dǎo)作用、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用等)是沒有作用的含量。另外，本發(fā)明的硫酸角質(zhì)素寡聚糖，是以硫酸角質(zhì)素作為原料，通過內(nèi)-β-N-乙酰基葡萄糖胺酶，將其降解，分級(jí)成二～五糖單元的寡聚糖級(jí)分，實(shí)質(zhì)上，不含有作為原料的硫酸角質(zhì)素。另外，也可通過優(yōu)選地或特異地切斷構(gòu)成硫酸角質(zhì)素的半乳糖或半乳糖-6-硫酸和N-乙?；咸烟前?6-硫酸的N-乙?；被咸烟擒真I，這種化學(xué)降解法，從降解硫酸角質(zhì)素的降解物，取得硫酸角質(zhì)素寡聚糖。如上所述那樣，可得到硫酸角質(zhì)素寡聚糖，特別是用上述(I)式表示的四硫酸化N-乙酰乳糖胺四糖、用(II)式表示的三硫酸化N-乙酰乳糖胺五糖、用(III)式表示的二硫酸化N-乙酰乳糖胺二糖等。另外，通過用式(I)、式(II)、式(III)表示的物質(zhì)的核磁共振譜(1H-NMR、13C-NMR)及高速原子沖擊質(zhì)譜分析的分析結(jié)果，如后面的實(shí)施例所示。本發(fā)明所使用的硫酸角質(zhì)素寡聚糖，也包括電離狀態(tài)的、附加質(zhì)子結(jié)構(gòu)的、或與堿金屬(鈉、鉀、鋰等)和堿土類金屬(鈣等)、銨等的無機(jī)堿之間形成的鹽、或二乙醇胺鹽、環(huán)己銨鹽、氨基酸鹽等的有機(jī)堿之間形成的鹽中，藥學(xué)上可接受的鹽。另外，本發(fā)明所用的硫酸角質(zhì)素寡聚糖和/或其鹽和，通常藥物上使用的載體、賦形劑、其他的添加物等組成的藥物組合物也是新的，可以抗炎癥、抗過敏、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化誘導(dǎo)、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)等為目的而給藥。本發(fā)明的硫酸角質(zhì)素寡聚糖級(jí)分可通過上述方法，從硫酸角質(zhì)素，特別是高硫酸化硫酸角質(zhì)素的酶降解物，除去內(nèi)毒素、核酸、蛋白質(zhì)、蛋白酶，目的物的硫酸角質(zhì)素寡聚糖以外的葡萄糖胺聚糖類等雜質(zhì)，制成99％以上含量的硫酸角質(zhì)素寡聚糖。<2>本發(fā)明的藥劑上述的硫酸角質(zhì)素寡聚糖和/或其在藥學(xué)上可接受的鹽，可作為抗炎癥劑、抗過敏劑、免疫調(diào)節(jié)劑、分化誘導(dǎo)劑或細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑等及其他用途的藥品而被廣泛應(yīng)用。本發(fā)明的抗炎癥劑，對于炎癥方面的任何疾病是有效的，具體的適應(yīng)癥，例如可舉出慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、變形性脊椎炎、骨關(guān)節(jié)炎、腰痛癥、手術(shù)后及外傷后的炎癥及腫脹的緩解、肩周炎、顎關(guān)節(jié)癥、腱鞘炎、腱周圍炎、肱骨髁炎(網(wǎng)球肘)、肌肉痛、角結(jié)膜炎等。本發(fā)明的抗炎癥劑，由于含有的硫酸角質(zhì)素寡聚糖和/或其藥學(xué)上可接受的鹽作用，對于這些疾病及癥狀，具有鎮(zhèn)痛消炎、解熱等抗炎癥作用。本發(fā)明的抗過敏劑，對于與過敏有關(guān)的任一病是有效的。但作為具體的適應(yīng)癥，可舉出例如過敏性鼻炎、過敏性角結(jié)膜炎，春季結(jié)膜炎、濕疹、皮炎、蕁麻疹、特應(yīng)性皮炎等。本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑，對于由于免疫系統(tǒng)異常引起的疾病是有效的，作為具體的適應(yīng)癥，例如可舉出人體自身免疫性淋巴細(xì)胞增生性綜合癥(humanautoimmunelymphoproliferativesyndrome；細(xì)胞81，935-946(1995)，科學(xué)268，1347-1349(1995))、淋巴細(xì)胞增生性疾病(lymphoproliferativedisorder；白血病和淋巴瘤363-368(1995))、血管免疫母細(xì)胞性淋巴結(jié)癥(angioimmunoblasticlymphadenopathy；Blood85(10)，2862-2869(1995))、免疫母細(xì)胞性淋巴結(jié)癥(immunoblasticlymphadenopathy；TheAmericanJournalofMedcicine63，849-(1977))、慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、園板狀紅斑狼瘡、多發(fā)性肌炎(平滑肌瘤)、硬皮癥、混合結(jié)締組織癥、慢性甲狀腺炎、原發(fā)性粘液水腫、甲狀腺中毒癥、惡性貧血、古德帕斯徹氏(Good-pasture)綜合癥、急性進(jìn)行性腎小球腎炎、重癥肌無力癥、尋常性天皰瘡、水皰性類天皰瘡、胰島素抵抗性糖尿病、少年性糖尿病、阿狄森病、萎縮性胃炎、男性不育癥、早發(fā)性更年期、晶狀體原性葡萄膜炎、交感性脈管炎、多發(fā)性硬化癥、進(jìn)行性全身性硬化癥、炎癥性腸疾病(克羅恩氏病潰瘍性結(jié)腸炎等)、原發(fā)膽汁性肝硬變、慢性活動(dòng)性肝炎、自身免疫性溶血性貧血、發(fā)作性血色素尿癥、特發(fā)性血小板減少性紫癜病、干燥綜合癥、抗磷脂抗體綜合癥等。本發(fā)明的分化誘導(dǎo)劑，對于由于生理細(xì)胞分化不全、免疫系統(tǒng)異常、惡性腫瘤等引起的一切疾病是有效的，作為具體的適當(dāng)癥，例如可舉出人體自身免疫性淋巴細(xì)胞增生性綜合癥、淋巴細(xì)胞增殖紊亂、血管免疫母細(xì)胞性淋巴結(jié)癥、免疫細(xì)胞性淋巴結(jié)癥、慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、炎癥性腸疾病(克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎等)、進(jìn)行性全身性硬化癥、多發(fā)性肌炎(平滑肌瘤)、干燥綜合癥、肉瘤、白血病、淋巴瘤、癌轉(zhuǎn)移的抑制、增生形成的預(yù)防(牛皮癬等的治療)、創(chuàng)傷治愈、骨髓發(fā)育不良縮合癥、硬皮癥等。本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，對于由于生理的細(xì)胞凋亡障礙、免疫系統(tǒng)異常、惡性腫瘤等引起的一切疾病，是有效的，但作為具體的適應(yīng)癥，例如可舉出人體自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合癥、淋巴細(xì)胞增殖紊亂、血管免疫母細(xì)胞性淋巴結(jié)癥、免疫母細(xì)胞性淋巴節(jié)癥、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、潰瘍性結(jié)腸炎、進(jìn)行性全身性硬化癥、多發(fā)性肌炎(平滑肌瘤)、干燥綜合癥、癌、白血病、淋巴腫瘤、癌轉(zhuǎn)移的抑制、增生形成的防止(牛皮癬等的治療)、骨髓發(fā)育不良癥候群、硬皮癥、異常腎小球膜細(xì)胞的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)(腎小球腎炎的治療)等。對于淋巴結(jié)重量的抑制、分化誘導(dǎo)、及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)、在MRL-lpr/lpr小鼠上已看到它們的效果。人體自身免疫性淋巴細(xì)胞增生性綜合癥(autoimmunelymphoproliferativesyndrome)與MRL-lpr/lpr小鼠相同地，由于Fas基因異常的原因，另外，可看到淋巴結(jié)腫脹等，與MRL-lpr/lpr小鼠的病態(tài)的類似性高。MRL-lpr/lpr小鼠可以說是人體自身免疫性淋巴細(xì)胞增生性綜合癥的適當(dāng)模型。因此在免疫調(diào)節(jié)劑、分化誘導(dǎo)劑及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑中，最優(yōu)選的本發(fā)明藥劑的適應(yīng)癥是人體自身免疫性淋巴細(xì)胞增生性綜合癥(autoimmunelymphoproliterativesyndrome)。本發(fā)明的藥劑可按照注射(肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)腔內(nèi)、眼內(nèi)、腹腔內(nèi)等)、點(diǎn)眼、滴注、經(jīng)皮、經(jīng)口、吸入等的給藥方法、進(jìn)行制備。作為劑型、可舉出注射劑(溶液、懸浮液、乳濁液、使用時(shí)溶解的固形劑等)、片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、液劑、脂質(zhì)體包涵體、軟膏劑、凝膠劑、外用散劑、噴霧劑、吸入散劑、點(diǎn)眼劑、眼軟膏劑等。對于制劑配制，可使用常用的賦形劑、粘合劑、潤滑劑、其他的著色劑、崩解劑等通常藥劑所用的成分。另外，在本發(fā)明的藥劑中，也可與硫酸角質(zhì)素寡聚糖同時(shí)，同時(shí)使用抗炎癥成分、抗過敏劑成分、免疫調(diào)節(jié)成分、分化誘導(dǎo)成分、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)成分等。在上述的給藥方法及劑型中，在抗炎癥劑及抗過敏劑中，優(yōu)選的是表1中所示的。另外，在免疫調(diào)節(jié)劑、分化誘導(dǎo)劑及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑中，優(yōu)選的給藥方法及劑型表示在表2中。表1表2本發(fā)明的抗炎癥劑、抗過敏劑的推定有效給藥量，在全身給藥時(shí)，按硫酸角質(zhì)素寡聚糖量，是30～300mg/人/天，另外，局部給藥時(shí)，是1～10mg/人/天。另外，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑，分化誘導(dǎo)劑、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的推定有效給藥量，按硫酸角質(zhì)素寡聚糖量，是30～6000mg/人/天。附圖簡述圖1是表示在實(shí)施例1中制備的四硫酸化N-乙?；樘前匪奶?硫酸角質(zhì)素四糖(I))，用HPLC進(jìn)行凝膠過濾時(shí)色譜時(shí)的圖。圖2是表示對于實(shí)施例1中制備的三硫酸化N-乙?；樘前肺逄?硫酸角質(zhì)素五糖(II)，用HPLC進(jìn)行凝膠過濾時(shí)的色譜圖。圖3是表示對于實(shí)施例1中制備的二硫酸化N-乙?；樘前范?硫酸角質(zhì)素二糖(III)，用HPLC進(jìn)行凝膠過濾時(shí)的色譜圖。圖4是表示實(shí)施例1中制備的硫酸角質(zhì)素五糖(II)的400MHz的1H-NMR光譜圖。圖5是表示給與硫酸角質(zhì)素四糖(I)、硫酸角質(zhì)素五糖(II)或硫酸角質(zhì)素二糖(III)的木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)炎模型兔子的關(guān)節(jié)液量圖。圖6是表示對于引起炎癥的大鼠，在誘導(dǎo)炎癥的5分鐘前，給與硫酸角質(zhì)素四糖(I)或各種試驗(yàn)物質(zhì)時(shí)的足浮腫率的對時(shí)間的變化圖。圖7是表示對于引起炎癥的大鼠，在誘導(dǎo)炎癥的3分鐘前，給與硫酸角質(zhì)素四糖(I)或各種試驗(yàn)物質(zhì)時(shí)的足浮腫率的對時(shí)間的變化圖。圖8表示給與硫酸角質(zhì)素四糖(I)或醋酸地塞米松的角叉菜膠胸膜炎大鼠的胸水液量圖。圖9表示給與硫酸角質(zhì)素四糖(I)或醋酸地塞米松的角叉菜膠胸膜炎大鼠的胸水中的白細(xì)胞數(shù)圖。圖10表示硫酸角質(zhì)素四糖(I)、硫酸角質(zhì)素五糖(II)及硫酸角質(zhì)素二糖(III)對于由于N-甲?；?Met-Leu-Phe(FMLP)刺激引起的豚鼠中性白細(xì)胞、產(chǎn)生活性氧(O2-)抑制效果圖。圖11是表示硫酸角質(zhì)素四糖(I)給藥及非給藥的過敏性結(jié)膜炎模型豚鼠結(jié)膜炎程度的評(píng)價(jià)圖。圖12是表示硫酸角質(zhì)素四糖(I)、硫酸角質(zhì)素五糖(II)或硫酸角質(zhì)素二糖(III)給藥及非給藥的對過敏性結(jié)膜炎模型豚鼠結(jié)膜炎程度的評(píng)價(jià)圖。圖13是表示對于過敏性結(jié)膜炎模型豚鼠，以各種濃度給與硫酸角質(zhì)素四糖(I)時(shí)的結(jié)膜炎程度的評(píng)價(jià)圖。圖14是表示對于是自身免疫疾患模型小鼠MRL小鼠，以各種投藥量反復(fù)給與硫酸角質(zhì)素二糖(III)28天時(shí)的小鼠頜下淋巴結(jié)重量圖。圖15是表示以各種給藥量，反復(fù)給與硫酸角質(zhì)素二糖(III)56天時(shí)的MRL小鼠的腸系膜淋巴結(jié)重量圖。圖16表示以各種給藥量，反復(fù)給與硫酸角質(zhì)素二糖(III)56天時(shí)的MRL小鼠的頜下淋巴結(jié)重量圖。圖17表示對于以各種給藥量，給與硫酸角質(zhì)素二糖(III)時(shí)的MRL小鼠的腸系膜淋巴結(jié)切片標(biāo)本(HE染色)的染色濃度的分析結(jié)果圖。圖18表示對于以各種給藥量給與硫酸角質(zhì)素二糖(III)時(shí)的MRL小鼠的頜下淋巴結(jié)切片標(biāo)本(HE染色)的染色濃度的分析結(jié)果圖。圖19是表示以各種給藥量，給與硫酸角質(zhì)素二糖(III)時(shí)的MRL小鼠淋巴細(xì)胞的CD3及CD4陽性細(xì)胞的比例(％)圖。圖20是表示以各種給藥量，給與硫酸角質(zhì)素二糖(III)時(shí)的MRL小鼠淋巴細(xì)胞的CD3及CD8a陽性細(xì)胞的比例(％)圖。圖21是表示以各種給藥量，給與硫酸角質(zhì)素二糖(III)時(shí)的MRL小鼠淋巴細(xì)胞的CD3及B220陽性細(xì)胞的比例(％)圖。圖22是表示以各種給藥量，給與硫酸角質(zhì)素二糖(III)時(shí)的MRL小鼠頜下淋巴結(jié)中的細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)圖。實(shí)施本發(fā)明的最佳方案以下，通過實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明。另外，制備例是表示從桿菌屬細(xì)菌得到的新的硫酸角質(zhì)素降解酶的制備例，實(shí)施例1分別表示硫酸角質(zhì)素寡聚糖級(jí)分的制備實(shí)施例，實(shí)施例2表示硫酸角質(zhì)素寡聚糖的急性毒性及各種藥理作用的實(shí)施例。另外，實(shí)施例3、4、5及6是制劑的實(shí)施例。制備例硫酸角質(zhì)素降解酶的制備<1>環(huán)狀芽胞桿菌KsT202株的分離在含有氮源、無機(jī)鹽類及硫酸角質(zhì)素的液體培養(yǎng)基5ml中，添加少量土壤，在45℃下，振動(dòng)培養(yǎng)3天。培養(yǎng)后，將培養(yǎng)上清液10μl點(diǎn)在濾紙上。同樣地，也將培養(yǎng)基(對照)10μl點(diǎn)在濾紙上。風(fēng)干后，將濾紙浸入甲苯胺蘭液中。用稀醋酸液充分洗凈濾紙后，將培養(yǎng)上清液與對照的斑點(diǎn)部位色調(diào)進(jìn)行比較。由于甲苯胺蘭與硫酸角質(zhì)素結(jié)合，顯示蘭色，所以與對照進(jìn)行比較，可確認(rèn)，顏色淺的試樣中存在硫酸角質(zhì)素同化菌，可使用平板培養(yǎng)基(例如心臟灌注瓊脂培養(yǎng)基HeartinfusionAgar)，用通常方法從培養(yǎng)液純化分離菌。對于純粹分離了的各種菌，使用液體培養(yǎng)基，與上述相同地，檢查硫酸角質(zhì)素的同化性能，得到硫酸角質(zhì)素同化菌。研究該株的形態(tài)學(xué)的性質(zhì)、生育特性、生理學(xué)的性質(zhì)的結(jié)果，本菌株確定為環(huán)形芽胞桿菌(Bacilluscirculans)。本菌株是在利用硫酸角質(zhì)素上，與公知的菌株有區(qū)別的新菌株。另外，環(huán)形芽胞桿菌KsT202株，在平成6年9月5日，在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，以保藏號(hào)FERMP-14516進(jìn)行保藏，在平成7年11月6日，按照布達(dá)佩斯條約轉(zhuǎn)移到國際保藏，以保藏號(hào)FERMBP-5285進(jìn)行保藏。<2>硫酸角質(zhì)素降解酶的制備將胨(極東制藥工業(yè)(株)制)1.5％、啤酒酵母浸膏(日本制藥(株)制)0.75％、從鯊魚軟骨制備的多硫酸角質(zhì)素(生化學(xué)工業(yè)(株)制)0.75％、K2HPO40.5％、MgSO47H2O0.02％、NaCl0.5％消泡劑阿卡爾(Adekanol)LG109(商品名，旭電化工業(yè)(株)制)0.0015％(pH8.0)組成的培養(yǎng)基20L，加入到30L容量的發(fā)酵罐中，在121℃下，高壓蒸汽滅菌20分鐘后，將預(yù)先在相同培養(yǎng)基下，37℃下，振動(dòng)培養(yǎng)16小時(shí)的KsT202株的培養(yǎng)液1L(5％)進(jìn)行無菌地接種，在45℃下，通氣(1vvm)，攪拌(300rpm)、培養(yǎng)24小時(shí)。在20L培養(yǎng)液連續(xù)離心機(jī)中，進(jìn)行離心除去菌體，得到約20L的菌體外液。在該菌體外液中，加入硫酸銨，以達(dá)到0.7飽和，用離心分離，收集生成的沉淀，使其溶解在2.5L的10mMTris醋酸緩沖液(pH7.5)中。在該溶液中，加入硫酸銨，達(dá)到0.35飽和，用離心分離除去生成的沉淀，進(jìn)而，添加硫酸銨，達(dá)到0.55飽和后，用離心分離，回收生成的沉淀。將沉淀溶解在2.5L的10mMTris醋酸緩沖液(pH7.5)中，通過用同一緩中液平衡了的DEAE-纖維素DE52(Whatman公司)柱(5.2×24cm)，吸附酶。用同一緩沖液1.5L洗柱后，在同一緩沖液中，將NaCl濃度，從0～0.3M直線地上升，使酶洗脫出。收集活性級(jí)分，添加硫酸銨，以達(dá)到0.55飽和，用離心分離收集沉淀，溶解到少量的10mMTris醋酸緩中液(pH7.5)中。然后，加在SephacrylS-300(弗爾馬西亞公司)柱(3.4×110cm)中，用含有0.5MNaCl的50mMTris醋酸緩中液(pH7.5)進(jìn)行凝膠過濾。通過使用UK-10膜(AdvantecToyo)的超濾，將活性級(jí)分濃縮，在約100倍量的10mMTris醋酸緩沖液(pH7.5)中透析。將透析后內(nèi)液通過預(yù)先用同一緩沖液平衡了的DEAE-Toyopearl(Tosoh公司)柱(2.2×15cm)，使酶吸附，用含有0.1MNaCl的同一緩中液150ml洗柱后，在同一緩沖液中，將NaCL濃度，從0.1M直線上升到0.2M，使酶洗脫出。通過超濾，將活性級(jí)分濃縮，加到SephacrylS-300柱(2.2×101cm)中，進(jìn)行凝膠過濾。在活性級(jí)分中，添加NaCl，以達(dá)到4M后，加到用含有4MNaCl的10mMTris醋酸緩沖液(pH7.5)平衡了的苯基瓊脂糖(Pharmacia公司)柱(1.6×15cm)，吸附酶，在同一緩沖液中，將NaCl濃度，從4M，線性地減少到0，使酶洗脫出。得到的酶是29單位或U，比活性是2.09單位或U/mg(換算成牛血清白蛋白重量)。在精制酶中，不含糖苷酶類的雜質(zhì)酶。這樣得到的硫酸角質(zhì)素降解酶，具有以下性質(zhì)。①作用與硫酸角質(zhì)素作用，將其N-乙?；被咸烟擒真I進(jìn)行水解。②底物特異性與硫酸角質(zhì)素I、硫酸角質(zhì)素II及多硫酸角質(zhì)素作用，作為主要的降解物，生成硫酸化硫酸角質(zhì)素二糖及硫酸化硫酸角質(zhì)素四糖。另外，可確認(rèn)也生成硫酸化硫酸角質(zhì)素五糖。③最適反應(yīng)pH4.5～6(在0.1M醋酸緩沖液及10mMTris-醋酸緩沖液中，37℃)④pH穩(wěn)定性6～7(在0.1M醋酸緩中液及10mMTris-醋酸緩沖液中，37℃、放置1小時(shí))⑤最適反應(yīng)溫度50～60℃(0.1M醋酸緩中液、pH6.0、反應(yīng)10分鐘)⑥熱穩(wěn)定性至少在45℃以下，穩(wěn)定(0.1M醋酸緩沖液、pH6.0、放置1小時(shí))。對于以下的實(shí)施例，使用上述得到的硫酸角質(zhì)素降解酶，但本發(fā)明不受該酶的限制，例如也可使用角質(zhì)素酶II等其他的內(nèi)-β-N-乙?；咸烟前访感土蛩峤到饷?。實(shí)施例1將來自鯊魚軟骨的高硫酸化硫酸角質(zhì)素50g，溶解在300ml的0.1M醋酸緩沖液(pH6.0)中。在該液中，加入25單位的上述硫酸角質(zhì)素降解酶，在37℃下，進(jìn)行降解24小時(shí)。反應(yīng)終了后，加入2倍體積(體積、以下相同)的乙醇，攪拌，在室溫下放置1夜。第二天，用離心分離(4000rpm、15分鐘)，將反應(yīng)液分離成上清液及沉淀，減壓濃縮上清液(以下，將該濃縮物稱為上清A)。另一方面，在沉淀中，加入300ml蒸餾水，進(jìn)行溶解，加入3倍量的乙醇，攪拌后，在室溫下，放置1夜。第二天，用離心分離，分離上清液及沉淀，將上清液減壓濃縮(以下，將該濃縮物稱為上清B)。將上清A，溶解在少量蒸餾水中，使用Bio-Gel-P-2柱(Bio-Rad)(3.6×134cm)，以蒸餾水作為溶劑，進(jìn)行凝膠過濾色譜分離，進(jìn)而，進(jìn)行離子交換色譜分離，分別取得含有硫酸角質(zhì)素四糖(I)、硫酸角質(zhì)素五糖(II)及硫酸角質(zhì)素二糖(III)級(jí)分，進(jìn)行冷凍干燥。將這些硫酸角質(zhì)素寡聚糖級(jí)分，分別溶解到少量蒸餾水中，通過使用預(yù)先用蒸餾水平衡了的Muromac柱(室町化學(xué)工業(yè)(株)制)(4.3×35cm)進(jìn)行陰離子交換色譜分離，分別進(jìn)一步純化。對于洗脫溶劑，使用NaCl水，將NaCl濃度，從0直線地上升到3M，分別使硫酸角質(zhì)素四糖(I)、硫酸角質(zhì)素五糖(II)、硫酸角質(zhì)素二糖(III)洗脫出。將得到的硫酸角質(zhì)素四糖(I)級(jí)分、硫酸角質(zhì)素五糖(II)級(jí)分、硫酸角質(zhì)素二糖(III)級(jí)分分別進(jìn)行減壓濃縮后，通過使用CellulofineGcl-25柱(Seikagaku公司)(3.2×125cm)的凝膠過濾色譜，進(jìn)行脫鹽、冷凍干燥。從上清B，通過同樣的操作，也可得到硫酸角質(zhì)素四糖(I)、硫酸角質(zhì)素五糖(II)、硫酸角質(zhì)素二糖(III)。對于這樣得到的硫酸角質(zhì)素四糖(I)、硫酸角質(zhì)素五糖(II)及硫酸角質(zhì)素二糖(III)，用HPLC(高效液相色譜)進(jìn)行凝膠過濾時(shí)的色譜圖，分別如圖1、圖2、圖3所示。由硫酸角質(zhì)素50g得到的硫酸角質(zhì)素四糖(I)是7.8g(15.6％)、硫酸角質(zhì)素五糖(II)是1.3g(2.6％)、硫酸角質(zhì)素二糖(III)是10.4g(20.8％)，其中任何一種都不含內(nèi)毒素、核酸、蛋白質(zhì)、蛋白酶、其他的葡萄糖胺聚糖類。以3-(三甲基硅烷基)丙酸鈉-D4作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使用日本電子JNM-EX400(400MHz)測定得到的硫酸角質(zhì)素四糖(I)、硫酸角質(zhì)素五糖(II)及硫酸角質(zhì)素二糖(III)的1H-NMR譜、使用日本電子JNM-EX400(100MHz)，測定13C-NMR譜?；瘜W(xué)位移用δ(ppm)表示、偶合常數(shù)用Hz表示。測定結(jié)果如下。硫酸角質(zhì)素四糖(I)1H-NMRδ(D2O，40℃)4.757(1H，d)，4.565(1H，d)，4.561(1H，d)，4.402(1H，dd)，4.342(2H，dd)，3.711(1H，dd)，3.626(1H，dd)，3.555(1H，dd)，2.069(3H，s)，2.047(3H，s)13C-NMRδ(D2O，25℃)177.81，177.63，177.30，105.87，105.69，97.84，93.34，84.98，82.41，81.91，81.25，75,55，75.44，75.20，75.13，75.02，73.70，72.68，72.07，71.10，71.01，70.61，69.82，69.59，69.29，58.92，57.94，56.42，25.09，25.76硫酸角質(zhì)素五糖(II)1H-NMRδ(D2O，25℃)圖4為測定圖13C-NMRδ(D2O，25℃)177.80，177.32，176.86，105.92，105.78，104.94，102.60，97.86，93.32，85.08，82.55，82.04，79.75，78.16，77.93，75.69，75.59，75.48，75.24，74.98，74.36，72.68，72.33，72.07，71.38，71.01，70.65，70.35，69.62，69.13，65.38，63.94，58.92，57.99，56.42，54.57，42.47，25.07，24.93，24.76硫酸角質(zhì)素二糖(III)1H-NMRδ(D2O，40℃)5.235(0.64H，d，J＝1.46Hz)，4.766(0.41H，d，J＝4.88Hz)，4.562(1.15H，d，J＝7.82Hz)，4.44(0.15H，br)，4.42(0.22H，br)，4.357(1.30H，d，J＝3.42Hz)，4.313(0.22H，d，J＝4.88Hz)，4.286(0.15H，d，J＝3.90Hz)，4.213(2.37H，d.，J＝5.37Hz)，4.183(0.37H，t，J＝3.42，2.93Hz)，4.01-3.97(2.06H，m)，4.006(d，J＝2.44Hz)，3.927(1.27H，d，J＝5.37Hz)，3.86-3.83(0.37H，br)，3.78-3.69(2.78H，m)，3.59-3.56(1.04H，m)，2.052(3.00H，m)13C-NMRδ(D2O，25℃)177.61，177.30，105.80，105.63，97.82，93.38，82.02，81.55，75.60，75.47，75.15，75.09，73.70，72.04，71.12，71.07，69.93，69.51，59.00，56.44，25.05，24.76另外，用高速原子轟擊質(zhì)譜分析法(FABMS)分析得到的硫酸角質(zhì)素四糖(I)、硫酸角質(zhì)素五糖(II)及硫酸角質(zhì)素二糖(III)。(1)陽離子FABMS(陽離子高速原子轟擊質(zhì)譜分析法)分別將硫酸角質(zhì)素四糖(I)制備成25nmol/μl的水溶液、將硫酸角質(zhì)素五糖(II)制備成40nmol/μl的水溶液、將硫酸角質(zhì)素二糖(III)制備成50nmol/μl的水溶液，分別以其1.0μl與α-硫代甘油(作為基質(zhì)使用)1.0μl混合，用于測定。測定是用finniganMATTSQ700三段四極桿型質(zhì)譜分析儀進(jìn)行的。另外，轟擊原子是使用氙(8KV)。其結(jié)果如表3所示。另外，表中括弧內(nèi)的數(shù)字，表示峰的相對強(qiáng)度(％)。表3</tables>[M-2H+3Na-102]+及[M-2H+3Na-102-102]+是碎片離子。(2)陰離子FABMS(陰離子高速原子轟擊質(zhì)譜分析法)分別將硫酸角質(zhì)素四糖(I)制備成25nmol/μl的水溶液、將硫酸角質(zhì)素五糖(II)制備成40nmol/ul的水溶液、將硫酸角質(zhì)素二糖(III)制備成40nmol/μl的水溶液。將得到的各個(gè)硫酸角質(zhì)素寡聚糖的水溶液，分別取1.0μl、1.0μl、0.5μl，分別與1.0μl的α-硫代甘油(作為基質(zhì)使用)混合，進(jìn)行測定。測定是用finniganMATTSQ700三段四極桿型質(zhì)譜分析儀進(jìn)行的。另外，轟擊原子是使用氙。其結(jié)果如表4所示。另外，表中括弧內(nèi)的數(shù)字表示峰的相對強(qiáng)度。表4([M+Na-2H-102]-是碎片離子。)進(jìn)而，測定得到的純化硫酸角質(zhì)素四糖(I)、硫酸角質(zhì)素五糖(II)及硫酸角質(zhì)素二糖(III)中的內(nèi)毒素、核酸、蛋白質(zhì)、及蛋白酶的含量。其結(jié)果如表5所示。表5注)a)每1mg硫酸角質(zhì)素寡聚糖的內(nèi)毒素含量是使用Toxicolor(商標(biāo))系統(tǒng)(Seikagaku公司(株)制)測定的。EU內(nèi)毒素單位(EndotoxinUnit)b)對于DNA，用臨界值法[DNA測定裝置臨界值(美國分子裝置社制)]進(jìn)行測定。c)將牛血清白蛋白，作成標(biāo)準(zhǔn)物，用Lowry法進(jìn)行測定。d)以FITC酪蛋白，作為底物進(jìn)行測定。另外，在使用醋酸纖維素膜(Cepallax富士照片(株)制)的電泳法(緩沖液0.1M吡啶·甲酸、pH3.0、電流0.5mA/cm、電泳時(shí)間30分鐘、染色0.5％Alucian藍(lán)溶液)，確認(rèn)純化硫酸角質(zhì)素四糖(I)，硫酸角質(zhì)素五糖(II)及硫酸角質(zhì)素二糖(III)中的透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸類肝素及硫酸角質(zhì)素等的葡萄糖胺聚糖類的含量時(shí)，從任何的硫酸角質(zhì)素寡聚糖中都檢測不出任何化合物(檢出界限以下)。實(shí)施例2對于以上得到的硫酸角質(zhì)素四糖(I)、硫酸角質(zhì)素五糖(II)及硫酸角質(zhì)素二糖(III)，進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)及各種藥理作用試驗(yàn)。<急性毒性試驗(yàn)>使用5周齡的ICR系的雌雄性小鼠，對于由實(shí)施例1生產(chǎn)的各個(gè)純化硫酸角質(zhì)素寡聚糖，進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。將硫酸角質(zhì)素四糖(I)、硫酸角質(zhì)素五糖(II)及硫酸角質(zhì)素二糖(III)的各個(gè)PBS(磷酸鹽緩沖液生理NaCl水)溶液，以1000mg/kg或2000mg/kg的用量，給藥到靜脈內(nèi)，給藥后14天，對于一般狀態(tài)及生死進(jìn)行觀察及測定體重。然后，殺死動(dòng)物，進(jìn)行解剖檢查。其結(jié)果，未發(fā)現(xiàn)死亡的動(dòng)物，且觀察一般狀態(tài)、測定體重、剖檢中也未發(fā)現(xiàn)異常。從以上結(jié)果得到結(jié)論，即將上述硫酸角質(zhì)素寡聚糖的任何一種，給藥于小鼠的靜脈內(nèi)，其最少死亡量都在2000mg/kg以上。<抗炎癥作用試驗(yàn)>(1)使用木瓜蛋白酶誘發(fā)的兔關(guān)節(jié)炎模型的抗炎癥作用試驗(yàn)使用木瓜蛋白酶誘發(fā)的兔關(guān)節(jié)炎模型，以關(guān)節(jié)液量作為指標(biāo)，對于硫酸角質(zhì)素寡聚糖的抗炎作用進(jìn)行試驗(yàn)。(1-1)使用兩膝關(guān)節(jié)炎模型，硫酸角質(zhì)素四糖關(guān)節(jié)腔內(nèi)給藥的抗炎癥效果將150μl的木瓜蛋白酶的生理NaCl水溶液(1％)注入到體重約3kg的日本白色本地種兔子(雌性)的兩膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，制作關(guān)節(jié)炎模型。注入木瓜蛋白酶后的第1天，將150μl(1.5mg/關(guān)節(jié))的用實(shí)施例1制備的純化硫酸角質(zhì)素四糖(I)的PBS溶液(1％)，注入到左側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)(以下，稱為硫酸角質(zhì)素四糖(I)給藥足)、另外，在右側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，注入150μl的PBS(以下，稱為硫酸角質(zhì)素四糖(I)非給藥足。另外，以下將給與硫酸角質(zhì)素四糖(I)的兔子稱為投藥組)。另外，對于只注入木瓜蛋白酶的兔子(以下，稱為對照組)及不注入木瓜蛋白酶的正常兔子(以下，稱正常組)，也進(jìn)行同樣地試驗(yàn)。在注入后的第七天，從兔子耳朵動(dòng)脈采血，分離含肝素血漿。解剖采血后的兔子，分離兩膝關(guān)節(jié)。用2ml的生理NaCl水，洗滌關(guān)節(jié)腔3次，回收關(guān)節(jié)液。測定血漿和回收關(guān)節(jié)液中的鈣濃度，從下式計(jì)算關(guān)節(jié)液量關(guān)節(jié)液量(μl/關(guān)節(jié))＝回收關(guān)節(jié)液中的鈣量(μg/關(guān)節(jié))/血漿中的鈣濃度(μg/μl)以上結(jié)果如表6所示。另外，表中的n表示用于實(shí)驗(yàn)的各組兔子的只數(shù)。表6</tables>注)*顯著性是通過Duncan多重比較檢定的。從該結(jié)果明顯地可看到，本發(fā)明的硫酸角質(zhì)素四糖(I)給藥組的關(guān)節(jié)液量，與對照組比較，明顯地少，可以確定硫酸角質(zhì)素四糖(I)，對于關(guān)節(jié)炎有改善作用。(1-2)使用兩膝關(guān)節(jié)炎模型，硫酸角質(zhì)素四糖肌內(nèi)給藥的抗炎癥效果用(1-1)所述的方法，制作關(guān)節(jié)炎模型，在木瓜蛋白酶注入后的第1天，在左臀部的肌肉內(nèi)注入150μl(0.5mg/kg體重)的用實(shí)施例1制備的純化硫酸角質(zhì)素四糖(I)的PBS溶液(1％溶液)(以下，稱為硫酸角質(zhì)素四糖(I)給藥組)。對照是以注入150μlPBS，代替硫酸角質(zhì)素四糖(I)的PBS溶液(以下，稱為對照組)。對于不注入木瓜蛋白酶的正常兔子(以下，稱為正常組)，也進(jìn)行同樣地試驗(yàn)。在注入后第7天，用與(1-1)相同方法，計(jì)算關(guān)節(jié)液量。以上結(jié)果如表7所示。另外，表中的n表示用于實(shí)驗(yàn)的各群兔子的只數(shù)。表7</tables>注)*顯著性，按照Duncan多重比較測定進(jìn)行。該結(jié)果表明，本發(fā)明的硫酸角質(zhì)素四糖(I)給藥組的關(guān)節(jié)液量，與對照組相比，明顯地少，可看到硫酸角質(zhì)素四糖(I)，對于關(guān)節(jié)炎有改善作用。(1-3)使用單膝關(guān)節(jié)炎模型，將硫酸角質(zhì)素四糖給藥于肌肉內(nèi)的抗炎癥效果在體重約3kg的日本白色本地種兔(雌性)的左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，注入150μl木瓜蛋白酶的生理鹽水溶液(1％)，右膝不做任何置地，制作單膝關(guān)節(jié)炎模型。在注入木瓜蛋白酶后的第1天，在左臀部的肌肉內(nèi)，注入150μl(1.0mg/kg、0.5mg/kg、0.25mg/kg)的用實(shí)施例1制備的純化硫酸角質(zhì)素四糖(I)的PBS溶液(2％、1％及0.5％溶液)(以下，稱為硫酸角質(zhì)素四糖(I)給藥組)。對照是注入150μl的PBS，代替硫酸角質(zhì)素四糖(I)的PBS溶液(以下，稱為對照組)。對于未注入木瓜蛋白酶的正常兔子(以下，稱正常組)，也進(jìn)行同樣的試驗(yàn)。在注入后第七天，用與(1-1)相同方法，計(jì)算關(guān)節(jié)液量。以上的結(jié)果，如表8所示。另外，表中的n表示用于實(shí)驗(yàn)的各組兔子的只數(shù)。表8注)*顯著性是通過TUKEY多重比較檢定的。從該結(jié)果表明，本發(fā)明的硫酸角質(zhì)素四糖(I)的給藥組的關(guān)節(jié)液量，與各對照組相比，明顯地少，可看出硫酸角質(zhì)素四糖(I)，對于關(guān)節(jié)炎有改善作用。(1-4)使用單膝關(guān)節(jié)炎模型，各種硫酸角質(zhì)素寡聚糖，肌肉內(nèi)給藥的抗炎效果除了使用150μl(0.5mg/kg)的由實(shí)施例1制備的純化硫酸角質(zhì)素四糖(I)、硫酸角質(zhì)素五糖(II)及硫酸角質(zhì)素二糖(III)的1.0.％PBS溶液之外，其他用與(1-3)完全相同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其結(jié)果如圖5所示。另外，圖中的*、**、及***，分別表示在p＜0.05、p＜0.01、p＜0.001下，有顯著性差異。另外，用于試驗(yàn)的兔子，每組都是10只。從該結(jié)果可看到，硫酸角質(zhì)素四糖(I)給藥組、硫酸角質(zhì)素五糖(II)給藥組及硫酸角質(zhì)素二糖(III)給藥組的關(guān)節(jié)液量，與對照組比較，哪一種都明顯地少，說明上述各硫酸角質(zhì)素寡聚糖，對關(guān)節(jié)炎有改善作用。(2)使用大鼠逆轉(zhuǎn)被動(dòng)足浮腫阿圖斯(Arthus)反應(yīng)的抗炎癥作用試驗(yàn)用作為III型過敏炎癥模型的大鼠足浮腫逆轉(zhuǎn)被動(dòng)阿圖斯反應(yīng)檢測硫酸角質(zhì)素寡聚糖效果。即，在給與試驗(yàn)物質(zhì)的大鼠足底部，皮下注射兔子抗卵白蛋白血清，進(jìn)而，從尾靜脈注射卵白蛋白，誘發(fā)炎癥(浮腫)，研究試驗(yàn)物質(zhì)對于浮腫的抑制效果。(試驗(yàn)物質(zhì)的給藥)將5周齡的CrjSD系雄性大鼠，預(yù)備飼養(yǎng)1周后，禁食約17小時(shí)，在誘發(fā)炎癥前，作為試驗(yàn)物質(zhì)，給與由實(shí)施例1制備的純化硫酸角質(zhì)素四糖(I)、消炎痛(西格瑪祠、LotNo.19F0018)或地塞米松(萬有制藥(株)、地塞米松注射液、LotNo.8D307P)、或者，作為陰性對照，給與生理鹽水((株)大塚制藥工業(yè)、LotNo.K3H72)。分別使用將硫酸角質(zhì)素四糖(I)及地塞米松溶解在生理鹽水的溶液、將消炎痛溶解在0.5％羥甲基纖維素鈉(CMC-Na和光純藥工業(yè)(株)、LotNo.PTN1418)的溶液。每100g體重，給藥體積為0.5ml。另外，作為給藥途徑，硫酸角質(zhì)素四糖(I)、生理鹽水及地塞米松從尾靜脈給藥，消炎痛經(jīng)口給藥。另外，除去消炎痛的藥物是通過盲法給藥。各試驗(yàn)物質(zhì)的給藥量及給藥順序如下。每組以5只構(gòu)成。(i)誘發(fā)炎癥5分鐘前給藥①生理鹽水(陰性對照)②硫酸角質(zhì)素四糖(I)1mg/kg③硫酸角質(zhì)素四糖(I)3mg/kg④硫酸角質(zhì)素四糖(I)10mg/kg(ii)誘發(fā)炎癥30分鐘前給藥⑤消炎痛(陽性對照)5mg/kg(iii)誘發(fā)炎癥3小時(shí)前給藥⑥硫酸角質(zhì)素四糖(I)1mg/kg⑦硫酸角質(zhì)素四糖(I)3mg/kg⑧硫酸角質(zhì)素四糖(I)10mg/kg⑨地塞米松(陽性對照)1mg/kg(炎癥的誘發(fā))在上述的各大鼠的足底部，皮下注射兔子抗卵白蛋白血清，進(jìn)而，從尾靜脈注射卵白蛋白，誘發(fā)炎癥(足浮腫)，所使用的抗血清是如下方法制備的。在兔子背部皮內(nèi)，每周1次，共3次注射含有2％卵白蛋白(EggAlbumin5×Cryst，LotNo.P93601，生化學(xué)工業(yè)(株))的生理鹽水和弗氏完全佐劑的等量混合液(乳濁液)1ml(每1只注射卵白蛋白10mg)，致敏。從最終致敏后約34天采血，得到抗血清。對于得到的抗血清，用雙層法測定抗體值效價(jià)。即，以用生理鹽水稀釋的抗血清和含有0.1％卵白蛋白的生理鹽水(1mg/ml)的白色沉淀反應(yīng)作為指標(biāo)，進(jìn)行測定。其結(jié)果，得到的抗血清的抗體效價(jià)是×27。在給與各試驗(yàn)物質(zhì)的大鼠左后肢足底部，經(jīng)過對各組所設(shè)定的時(shí)間后，皮下給藥0.1ml的6倍稀釋的抗血清。接著，從尾靜脈注射含有0.5％卵白蛋白的生理鹽水(25mg/5ml/kg)，誘發(fā)炎癥。使用足體積測定裝置(TK-101、Unicom(株))測定誘發(fā)炎癥前與后的1、2、3及4小時(shí)各組處置足的體積，從與誘發(fā)前值的差，求出足浮腫率，進(jìn)而，算出試驗(yàn)物質(zhì)給藥組，對于對照組的浮腫抑制率。對于得到的各個(gè)浮腫率，由最小明顯差檢定，進(jìn)行平均值差的檢定。各給藥組的足浮腫率及浮腫抑制率如表9所示，誘發(fā)炎癥5分鐘前及3小時(shí)前給藥組的足浮腫率如圖6、7所示。圖中，*及**分別表示P＜0.05、P＜0.01時(shí)，有顯著性差異。表9*，**在P＜0.05(*)及P＜0.01(**)時(shí)，與對照有顯著性差異其結(jié)果，對于作為陰性對照的生理鹽水給藥組，14時(shí)后的足浮腫率是40.9％，而對于硫酸角質(zhì)素四糖(I)誘發(fā)炎癥5分鐘前給藥組，是29.1～34.4％，在1mg/kg給藥組與10mg/kg給藥組中可看到顯著性差異。在誘發(fā)炎癥1小時(shí)后，未看到與用量有關(guān)的反應(yīng)，但在4小時(shí)后，在3mg/kg給藥組及10mg/kg給藥組是37.2％及35.4％值明顯降低。另外，對于硫酸角質(zhì)素四糖(I)誘發(fā)炎癥3小時(shí)前給藥組，誘發(fā)炎癥1小時(shí)后，未看到顯著性差異，但2小時(shí)后，3mg/kg給藥組是35.3％、3小時(shí)后，10mg/kg給藥組是41.5％、進(jìn)而，4小時(shí)后，1mg/kg給藥組是38％值明顯降低。另外，對于消炎痛給藥組，2小時(shí)后及4小時(shí)后，顯示值明顯降低。另外，對于地塞米松給藥組，1～4小時(shí)后，任何一個(gè)測定點(diǎn)都是值明顯降低。足浮腫抑制率，對于消炎痛給藥組，1～4小時(shí)后，是9～17.5％，對于硫酸角質(zhì)素四糖(I)-誘發(fā)炎癥前5分鐘給藥組，計(jì)算出8.6～36.5％的高足浮腫抑制率。另外，硫酸角質(zhì)素四糖(I)-3小時(shí)前給藥組，是-8.1～24.4％。另一方面，對于地塞米松組藥組，是31.7～58.1％的高足浮腫抑制率。(3)對大鼠角叉菜膠胸膜炎模型的抗炎癥作用試驗(yàn)使用一般用于抗炎癥劑評(píng)價(jià)的炎癥模型的大鼠的角叉菜膠胸膜炎模型，研究硫酸角質(zhì)素寡聚糖的作用。試驗(yàn)中，使用了體重約150～170g的S.D.大白鼠(雌)37只。用生理鹽水，將λ-角叉菜膠(西格瑪社制)溶解成2％濃度，用0.8μm的過濾器進(jìn)行過濾。將得到的角叉菜膠溶液，以100μl/只的比例，給與大鼠的胸腔內(nèi)，制成胸膜炎模型。在19只上述胸膜炎模型大鼠中，將溶解在PBS中的硫酸角質(zhì)素四糖(I)，以20mg/kg或10mg/kg的給藥量，進(jìn)行皮下(s.c.)給藥。另外，作為陽性對照，在8只上述大鼠中，將甾體類(醋酸地塞米松(萬有制藥(株))，以臨床給藥量的150μg/kg，皮下給藥。作為陰性對照，在10只中，將PBS皮下給藥。各個(gè)給藥是在給與角叉菜膠之后進(jìn)行。給藥情況如表10所示。表10將各個(gè)大鼠，在λ-角叉菜膠給藥6小時(shí)后進(jìn)行解剖。打開大鼠的胸腔，用帶有針頭的2ml注射器取出貯留的胸液。然后，用1ml的生理鹽水洗滌胸腔，回收洗滌液。測定用注射器回收的胸液量，進(jìn)而，用自動(dòng)血球計(jì)數(shù)裝置測定胸液中的白血球數(shù)(細(xì)胞數(shù))。其結(jié)果如圖8、9所示。圖中*及**，分別表示在P＜0.05、P＜0.01(P是Duncan檢驗(yàn)的顯著性)，水平有顯著性差異。如圖8所示，硫酸角質(zhì)素四糖(I)10mg/kg給藥組的胸水液量，與陰性對照組相比較，明顯少，但與硫酸角質(zhì)素四糖(I)20mg/kg給藥群相比較，沒有差別，認(rèn)為無劑量依賴性。醋酸地塞米松給藥組的胸水液量，與陰性對照組相比較，明顯少。另外，胸水中的白血球數(shù)硫酸角質(zhì)素四糖(I)10mg/kg給藥組及20mg/kg給藥組中任何一個(gè)與陰性對照組相比較，明顯少，劑量依賴減少(圖9)。醋酸塞地米松給藥組的白血球數(shù)，與對照組相比較，明顯少(圖9)。從上述結(jié)果表明，硫酸角質(zhì)素四糖(I)，對于大鼠的角叉菜膠胸膜炎模型，顯示了抗炎作用。(4)對豚鼠嗜中性白細(xì)胞的活性氧(O2-)產(chǎn)生的抑制作用將溶解于生理鹽水的糖原(TypeII、Oyster；西格瑪社制)的0.2％水溶液，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌后，在5周齡的Hartley系豚鼠(雌性；從日本SLC社購入)的腹腔內(nèi)，給藥20ml。在給藥的16小時(shí)后，使豚鼠失血而死，將含有肝素10U/ml的生理鹽水20ml注入腹腔內(nèi)，回收腹腔浸出液。然后，除了培養(yǎng)時(shí)外，完全在冰水下操作。將回收了的液體，以1000rpm離心分離10分鐘，用純化水，將得到的沉淀溶血后，將其以2倍濃度的Hanks液(不含酚紅；日水制藥廠)回到等滲透狀態(tài)，進(jìn)而，以1000rpm，離心分離10分鐘。將得到的沉淀懸浮在Hanks液中，進(jìn)行2次離心分離操作，得到嗜中性白細(xì)胞。將采取的豚鼠嗜中性白細(xì)胞懸浮在Hanks液中，用血球測定裝置(systemK-2000，東亞醫(yī)用電子(株)制)，測定白血球數(shù)，用Hanks液稀釋成2×106個(gè)/ml的液體，作為細(xì)胞懸浮液，用于測定。將細(xì)胞懸浮液1ml和用上述實(shí)施例1制備的純化硫酸角質(zhì)素寡聚糖(硫酸角質(zhì)素四糖(I)、硫酸角質(zhì)素五糖(II)或硫酸角質(zhì)素二糖(III)10μl混合后，在37℃下，預(yù)培養(yǎng)1小時(shí)。然后，在其中，順序加入1.6mM的細(xì)胞色素c(TYpeIII，HorseHeart；西格瑪社制)液50μl、100μM的N-甲?；?Met-Leu-Pue(以下稱為FMLP。西格瑪社制)10μl，進(jìn)行混合。將其，在37℃下，培養(yǎng)10分鐘后，進(jìn)行冰冷，使反應(yīng)停止，用3000rpm，離心分離5分鐘。取出由離心分離得到的上清液，測定其550nm的吸光度，求出培養(yǎng)10分鐘后的每2×106細(xì)胞的還原型細(xì)胞色素c量。若產(chǎn)生活性氧(O2-)，還原型細(xì)胞色素c量增加。另外，以終濃度20μg/ml添加重組人體SOD(recombinanthumansuperoxidedismutase)，作為空白。另外，所用的豚鼠是6只，分別獨(dú)立進(jìn)行試驗(yàn)。分別算出將對照組(不添加硫酸角質(zhì)素寡聚糖的)的還原型細(xì)胞色素量作為100％時(shí)的各硫酸角質(zhì)素寡聚糖添加組的比例，將與對照組的差，作為活性氧(O2-)產(chǎn)生抑制率(％)進(jìn)行計(jì)算，進(jìn)而，求出各實(shí)驗(yàn)的平均值。其結(jié)果如圖10所示。另外，圖中的各硫酸角質(zhì)素寡聚糖的濃度是最終濃度。從該結(jié)果表明，硫酸角質(zhì)素四糖(I)，以0.01、0.1及1.0mg/ml的濃度，濃度依賴性地，顯著地抑制活性氧(O2-)產(chǎn)生，這就表明硫酸角質(zhì)素四糖(I)具有抗炎癥作用。另外，也看出硫酸角質(zhì)素二糖(III)及硫酸角質(zhì)素五糖(II)也有輕微地活性氧產(chǎn)生抑制作用。從該結(jié)果看，硫酸角質(zhì)素寡聚糖，由于抑制了中性白細(xì)胞的活性氧(O2-)的產(chǎn)生，而發(fā)揮了抗炎癥作用。<抗過敏作用>對于誘發(fā)變應(yīng)性結(jié)膜炎的豚鼠，用各種硫酸角質(zhì)素寡聚糖點(diǎn)眼，研究其效果。(1)對于過敏性結(jié)膜炎的硫酸角質(zhì)素四糖(I)的效果用乙酸乙酯，將甲苯·二異氰酸鹽(toluenediisocyanate，以下，稱為TD1)稀釋成10％濃度。將得到的10％TD1，在體重約900～1000g的Hartley系豚鼠(雌性)10只的左右鼻前庭(10μl/只)上，1天1次，涂敷5天，制成TD1致敏模型。在TD1致敏模型的左眼上，點(diǎn)上由實(shí)施例1制備的純化硫酸角質(zhì)素四糖(I)的PBS溶液(100mg/ml)，在右眼上，作為對照，點(diǎn)上PBS。點(diǎn)眼用量，每次點(diǎn)眼容器都是1商(48±4.6μl(S.D))。10分鐘后，在兩眼上，點(diǎn)上6.5ul的10％TD1，誘發(fā)結(jié)膜炎。放置5分鐘后，進(jìn)而，在左眼上點(diǎn)硫酸角質(zhì)素四糖(I)的PBS溶液(100mg/ml)，在右眼上點(diǎn)PBS。15分鐘后，觀察兩眼。用0、+1、+2、+3的4個(gè)階段，對于充血、浮腫、流淚3項(xiàng)，評(píng)價(jià)結(jié)膜炎的程度。其結(jié)果，將評(píng)價(jià)的平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差一起表示在圖11中。另外，圖中*表示在P＜0.05(P是X2檢定的顯著性水平)下有顯著性差異。其結(jié)果，硫酸角質(zhì)素四糖(I)，對于觀察的充血、浮腫、流淚的3項(xiàng)都有抑制趨勢，特別是對于浮腫，與對照相比較，有明顯抑制作用。(2)對于過敏性結(jié)膜炎的各種硫酸角質(zhì)素寡聚糖的效果在與上述(1)相同制作的各組10只的TD1致敏模型的左眼上，點(diǎn)入作為被檢物質(zhì)的用上述實(shí)施例1制備的純化硫酸角質(zhì)素二糖(III)、硫酸角質(zhì)素四糖(I)或硫酸角質(zhì)素五糖(II)的PBS溶液(都是6.0mg/ml)，在右眼上作為對照，點(diǎn)入PBS。結(jié)膜炎的程度，與上述(1)的評(píng)價(jià)相同。作為結(jié)果，將評(píng)價(jià)的平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差一起表示于圖12中。另外，圖中*表示在P＜0.05(P是X2檢定的顯著性)下，有顯著性差異。其結(jié)果表明，硫酸角質(zhì)素二糖(III)、硫酸角質(zhì)素四糖(I)及硫酸角質(zhì)素五糖(II)中的任何一種，對于充血、浮腫、流淚3項(xiàng)，都有抑制趨勢，特別是硫酸角質(zhì)素四糖(I)，顯示了明顯抑制浮腫的效果。(3)各種濃度的硫酸角質(zhì)素四糖(I)對于過敏性結(jié)膜炎的效果在與上述(1)相同制作的各組10只的致敏模型的左眼中，作為被檢物質(zhì)，以各種濃度(6mg/ml、3mg/ml、1.5mg/ml或0.75mg/ml點(diǎn)上含有用實(shí)施例1配制的純化硫酸角質(zhì)素四糖(I)的PBS溶液，在右眼上，作為對照，點(diǎn)上PBS。結(jié)膜炎的程度，與上述(1)相同地評(píng)價(jià)。作為結(jié)果，將評(píng)價(jià)的平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差一起表示在圖13中。另外，圖中*表示在P＜0.05(P是X2檢定的顯著性)是有顯著性差異的。其結(jié)果表明，任何一種濃度的硫酸角質(zhì)素四糖(I)PBS溶液中，對于充血、浮腫、流淚等3項(xiàng)都有抑制趨勢，特別是，6mg/ml、3mg/ml及1.5mg/ml濃度的硫酸角質(zhì)素四糖(I)PBS溶液，對于浮腫，有明顯的抑制效果。<免疫調(diào)節(jié)作用·細(xì)胞分化誘導(dǎo)作用·細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用>研究硫酸角質(zhì)素寡聚糖，對于作為自身免疫疾病模型的MRL小鼠的效果。(1)淋巴結(jié)重量抑制作用(1-1)MRL小鼠中的硫酸角質(zhì)素四糖(I)的4周反復(fù)肌肉內(nèi)給藥試驗(yàn)對于MRL-1pr/1pr小鼠，分別以5次/周、4周時(shí)間，將由實(shí)施例1制備的純化硫酸角質(zhì)素四糖(I)的PBS溶液(100mg/ml)，1次10mg/kg體重注射大腿肌肉(以下，稱給藥組)，另外，作為對照，將PBS也注射在大腿肌內(nèi)。然后，解剖小鼠，測定脾臟及腸系膜淋巴結(jié)的重量，求出平均重量。將結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)誤差一起表示在表11中。另外，表中的n表示所用小鼠的只數(shù)。表11結(jié)果，注射硫酸角質(zhì)素四糖(I)的組中，可看到脾臟及腸系膜淋巴結(jié)重量增加抑制傾向，顯示了硫酸角質(zhì)素四糖(I)的免疫調(diào)節(jié)作用。(1-2)MRL小鼠的硫酸角質(zhì)素二糖(III)的28天反復(fù)肌肉內(nèi)給藥試驗(yàn)對于MRL-1pr/1pr小鼠，分別以7次/周，4周時(shí)間，將由實(shí)施例1制備的純化硫酸角質(zhì)素二糖(III)的PBS溶液，每次1mg/kg體重、5mg/kg體重或25mg/kg體重注射大腿肌(以下，分別稱為1mg/kg給藥組、5mg/kg給藥組、25mg/kg給藥組)，另外，作為對照，將PBS注射到大腿肌肉內(nèi)(以下，稱對照組)。然后，解剖小鼠，測定頜下淋巴結(jié)重量，求出平均重量。將其結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)誤差一起表示在圖14中。另外，所使用的小鼠，每組都是6只。另外，圖中*表示P＜0.05(P是Bonferroni多重比較檢定的顯著性)下，有顯著性差異。其結(jié)果，即使在任何給藥量的硫酸角質(zhì)素二糖(III)給藥組，都可以看到頜下淋巴結(jié)重量增加抑制效果，特別是，在5mg/kg給藥組中，與對照組相比較，有明顯重量增加抑制效果，顯示了硫酸角質(zhì)素二糖(III)具有免疫調(diào)節(jié)作用。(1-3)MRL小鼠中的硫酸角質(zhì)素二糖(III)的56天反復(fù)肌肉內(nèi)給藥試驗(yàn)對于MRL-1pr/1pr小鼠，分別以7次/周，8周時(shí)間，將由實(shí)施例1制備的純化硫酸角質(zhì)素二糖(III)的PBS溶液，以1次2.5mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重，注射到大腿肌肉內(nèi)(以下分別稱為2.5mg/kg給藥組、5mg/kg給藥組、10mg/kg給藥組)，另外，作為對照，將PBS(以下稱為對照組)也注射到大腿肌肉內(nèi)。然后，解剖小鼠，分別測定腸系膜淋巴結(jié)及頜下淋巴結(jié)重量，求出平均重量。關(guān)于腸系膜淋巴結(jié)的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)誤差一起如圖15所示、關(guān)于頜下淋巴結(jié)的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)誤差一起表示在圖16中。另外，所用的小鼠，每組都是7只。從該結(jié)果可看到在硫酸角質(zhì)素二糖(III)的2.5mg/kg給藥組中，腸系膜淋巴結(jié)的重量抑制效果、在10mg/kg給藥組中，腸系膜淋巴結(jié)及頜下淋巴結(jié)重量增加抑制效果，由此，顯示了硫酸角質(zhì)素二糖(III)的免疫調(diào)節(jié)作用。(2)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用(2-1)以細(xì)胞染色濃度作為指標(biāo)的細(xì)胞分化誘導(dǎo)的分析對于MRL-1pr/1pr小鼠，分別以7次/周，4周時(shí)間，將由實(shí)施例1制備的純化硫酸角質(zhì)素二糖(III)的PBS溶液，以1次1mg/kg體重、5mg/kg體重或25mg/kg體重，注射到大腿肌肉內(nèi)(以下，分別稱為1mg/kg給藥組、5mg/kg給藥組、25mg/kg給藥組)，另外，作為對照組，將PBS(以下，稱為對照組)，注射到大腿肌肉內(nèi)。然后，解剖小鼠，制作腸系膜淋巴結(jié)及頜下淋巴結(jié)的切片標(biāo)本(HE染色)。對于該標(biāo)本，使用圖像分析裝置(PIAS制)分析每單位面積的染色濃度。另外，由于未分化細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的比例多，核染色淺，所以每單位面積的染色濃度低。分化了的細(xì)胞，由于核所占的比例大，且核染色深，所以單位面積的染色深。將腸系膜淋巴結(jié)的分析結(jié)果、頜下淋巴結(jié)的分析結(jié)果，分別與標(biāo)準(zhǔn)誤差一起表示在圖17、圖18中。另外，圖中**表示在P＜0.01(P是Bonferroni多重比較檢定的顯著性)下，有顯著性差異。另外，所使用的小鼠，都是6只。從該結(jié)果，可看到，在上述任何一個(gè)給藥量的硫酸角質(zhì)素二糖(III)給藥組，每單位面積的染色濃度都增加。(相對亮度減少)，特別是在5mg/kg給藥組及25mg/kg給藥組中，與對照組比較，染色濃度明顯地增加。這顯示出，通過硫酸角質(zhì)素二糖(III)分化的細(xì)胞增加，硫酸角質(zhì)素二糖(III)具有細(xì)胞分化誘導(dǎo)作用。(2-2)以淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞表面抗原作為指標(biāo)的分化誘導(dǎo)的分析對于MRL-1pr/1pr小鼠，分別以7次/周，8周時(shí)間，將由實(shí)施例1制備的純化硫酸角質(zhì)素二糖(III)的PBS溶液，以1次2.5mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重注射到大腿肌肉內(nèi)(以下，分別稱為2.5mg/kg給藥組、5mg/kg給藥組、10mg/kg給藥組)，另外，作為對照，將PBS(以下，稱為對照組)，也注射到大腿肌肉內(nèi)。然后，解剖小鼠，將淋巴結(jié)在細(xì)胞篩網(wǎng)(Cellstrainer)(Falcon2350)上磨碎，制備淋巴細(xì)胞。對于制備的各給藥組的淋巴細(xì)胞，分別進(jìn)行使用抗CD3抗體(生化學(xué)工業(yè)(株)制)及抗CD4抗體(pharminjen制)的二重免疫染色、使用抗CD3抗體和抗CD8a抗體(pharminjen制)的二重免疫染色、及使用抗CD3抗體及抗B220抗體(pharminjen制)的二重免疫染色。另外，CD3、CD4及CD8a是在T細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞表面抗原，B220是在B細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞表面抗原。另外，眾所周知在無標(biāo)志的淋巴細(xì)胞上還未發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞表面抗原表達(dá)。分別將CD3及CD4陽性細(xì)胞(以下，也稱CD3+CD4+細(xì)胞；主要是輔助T細(xì)胞)對于全部淋巴細(xì)胞的比例(％)，與標(biāo)準(zhǔn)誤差一起表示在圖19中；將CD3及CD8a陽性細(xì)胞(以下，也稱CD3+CD8a+細(xì)胞；主要是抑制性T細(xì)胞及細(xì)胞毒性T細(xì)胞)的比例(％)與標(biāo)準(zhǔn)誤差一起表示在圖20中；另外將CD3及B220陽性細(xì)胞(以下，也稱CD3+B220+細(xì)胞；雖然是T細(xì)胞，但又具有B細(xì)胞表面抗原的異常細(xì)胞)的比例(％)與標(biāo)準(zhǔn)誤差一起，表示在圖21中。另外，圖中*表示在P＜0.05(P是Pyan多重比較檢定的顯著性)下具有顯著性差異。另外，所用的小鼠，每組都是7只。圖19表明，在硫酸角質(zhì)素二糖(III)的10mg/kg給藥組中，看到了相對于對照組、2.5mg/kg給藥組及5mg/kg給藥組的CD3+CD4+細(xì)胞明顯地增加。這表示無標(biāo)志的淋巴細(xì)胞，通過相當(dāng)量的硫酸角質(zhì)素二糖(III)的給藥，分化成CD3+CD4+細(xì)胞。從圖20表明，在硫酸角質(zhì)素二糖(III)的10mg/kg給藥組中，對于對照組、2.5mg/kg給藥組及5mg/kg給藥組，看到了CD3+CD8a+細(xì)胞的增加。這表明通過相當(dāng)量的硫酸角質(zhì)素二糖(III)的給藥無標(biāo)志的淋巴細(xì)胞分化成CD3+CD8a+細(xì)胞。從圖21表明，在硫酸角質(zhì)素二糖(III)的10mg/kg給藥組中，看到了對于對照組、2.5mg/kg給藥組及5mg/kg給藥組的CD3+B220+細(xì)胞減少。這表示通過相當(dāng)量的硫酸角質(zhì)素二糖(III)的給藥，所謂的CD3+B220+細(xì)胞的異常細(xì)胞減少，支持向正常淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)分化的結(jié)果。從以上結(jié)果看，硫酸角質(zhì)素二糖(III)具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化的作用。(3)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用對于MRL-1pr/1pr小鼠，分別以7次/周，4周時(shí)間，將由實(shí)施例1制備的純化硫酸角質(zhì)素二糖(III)的PBS溶液，1次1mg/kg體重、5mg/kg體重或25mg/kg體重，注射到大腿肌肉內(nèi)(以下，分別稱為1mg/kg給藥組、5mg/kg給藥組、25mg/kg給藥組)，另外，作為對照，將PBS(以下，稱對照組)，注射到大腿肌肉內(nèi)。然后，解剖小鼠，制作頜下淋巴結(jié)的切片標(biāo)本(用Gavvieli的等方法，染色，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺刻標(biāo)記方法細(xì)胞生物學(xué)雜志。)119，493-501(1992)。該染色方法，是通過檢出斷片化的DNA的末端，檢出能引起細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的方法。用光學(xué)顯微鏡觀察該標(biāo)本，測定每單位面積的染色細(xì)胞數(shù)(引起細(xì)胞凋亡的細(xì)胞。以下，簡稱細(xì)胞凋亡細(xì)胞)。其結(jié)果，與標(biāo)準(zhǔn)誤差一起表示在圖22中。另外，圖中*表示在P＜0.05下、**表示在P＜0.01(P是Bonferroni多重比較檢定的顯著性)下有明顯差異。另外，所用的小鼠各組都是6只。從該結(jié)果表明，在任何給藥量的硫酸角質(zhì)素二糖(III)給藥組中，都可看到細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)增加，特別是5mg/kg給藥組中，對于對照組，明顯增加細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)。另外，也制作上述各組小鼠的頜下淋巴結(jié)的切片標(biāo)本(HE染色)，用光學(xué)顯微鏡觀察有無細(xì)胞凋亡小體(apopticbody)。其結(jié)果表明，對于任何一種給藥量的硫酸角質(zhì)素二糖(III)給藥組都散在有細(xì)胞凋亡小體。從這些結(jié)果可表明，硫酸角質(zhì)素二糖(III)具有細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。從以上結(jié)果確認(rèn)，硫酸角質(zhì)素寡聚糖的免疫調(diào)節(jié)作用、細(xì)胞分化誘導(dǎo)作用及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。實(shí)施例3軟膏在用根據(jù)日本藥典的常規(guī)方法制備的軟膏中，以10mg/ml的濃度，溶解由實(shí)施例1制備的純化硫酸角質(zhì)素四糖(I)；制成軟膏。本軟膏，也可用作抗炎癥劑、抗過敏劑中的任何一種。實(shí)施例4點(diǎn)眼藥在用常規(guī)方法，用磷酸鹽調(diào)節(jié)成pH6.8-7.6的生理鹽水中，以10mg/ml的濃度溶解由實(shí)施例1制備的純化硫酸角質(zhì)素四糖(I)，另外，以2mg/ml的濃度溶解透明質(zhì)酸鈉，制成點(diǎn)眼劑。本點(diǎn)眼劑也可用作抗炎癥劑、抗過敏劑中的任何一種。實(shí)施例5脂質(zhì)體包涵體在含有卵磷脂的脂質(zhì)化劑(AquasomeLA、日光化學(xué)株式會(huì)社)中，以10mg/ml的濃度溶解由實(shí)施例1制備的純化硫酸角質(zhì)素四糖(I)，通過超聲波處理，進(jìn)行包合作用。本脂質(zhì)體包涵體也可用作抗炎癥劑、抗過敏劑、免疫調(diào)節(jié)劑、分化誘導(dǎo)劑、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑中的任何一種。實(shí)施例6注射劑在用常規(guī)方法，用磷酸鹽調(diào)節(jié)成pH6.8-7.6的生理鹽水中，以10mg/ml的濃度，溶解由實(shí)施例1制備的純化硫酸角質(zhì)素二糖(III)，用0.22μm的過濾器，通過無菌過濾，制備注射劑。本注射劑也可用作抗炎癥劑、抗過敏劑、免疫調(diào)節(jié)劑、分化誘導(dǎo)劑、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑中的任何一種。產(chǎn)業(yè)上的利用性本發(fā)明的純化高硫酸化硫酸角質(zhì)素寡聚糖級(jí)分的純度極高，基本上不含內(nèi)毒素、核酸、蛋白質(zhì)、蛋白酶，及上述寡聚糖以外的葡萄糖胺聚糖類等，所以可作為新的抗炎癥劑等的醫(yī)療品使用。權(quán)利要求1.抗炎癥劑，作為有效成分，其含有硫酸角質(zhì)素寡聚糖和/或其藥學(xué)上可接受的鹽。2.抗炎癥劑，其含有唾液酸和/或巖藻糖的硫酸化了的N-乙?；樘前穯卧牧蛩峤琴|(zhì)素寡聚糖和/或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分。3.權(quán)利要求1或2所述的抗炎癥劑，其中，上述硫酸角質(zhì)素寡聚糖是在還原末端上，具有硫酸化的N-乙?；咸烟前返?～5糖單元的寡聚糖，且在1個(gè)分子中，至少2處的羥基被硫酸化的硫酸角質(zhì)素寡聚糖。4.權(quán)利要求1～3中任何一項(xiàng)所述的抗炎癥劑，其特征是上述硫酸角質(zhì)素寡聚糖至少含有用下式表示的二糖作為構(gòu)成成分，Gal(6S)-GlcNAc(6S)(式中，Gal表示半乳糖、GlcN表示葡萄糖胺、Ac表示乙?；?、6S表示6-0-硫酸酯)。5.權(quán)利要求4所述的抗炎癥劑，其特征是上述硫酸角質(zhì)素寡聚糖選自式(I)表示的四硫酸化N-乙?；樘前匪奶恰⒂檬?II)表示的三硫酸化N-乙?；樘前肺逄?、用式(III)表示的二硫酸化N-乙?；樘前范?，Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(I)NeuAc～Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(II)Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(III)(式中，Gal表示半乳糖、GlcN表示葡萄糖胺、Neu表示神經(jīng)氨酸、Ac表示乙?；?、6S表示6-0-硫酸酯。另外，～表示α2，3鍵或α2，6鍵)。6.抗過敏劑，其含有硫酸角質(zhì)素寡聚糖和/或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分。7.抗過敏劑，其含有唾液酸和/或巖藻糖的硫酸化的N-乙?；樘前穯卧牧蛩峤琴|(zhì)素寡聚糖和/或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分。8.權(quán)利要求6或7所述的抗過敏劑，上述硫酸角質(zhì)素寡聚糖是在還原末端上，具有硫酸化的N-乙?；咸烟前返?-5糖單元的寡聚糖，且在1個(gè)分子中至少2處的羥基被硫酸化的硫酸角質(zhì)素寡聚糖。9.權(quán)利要求6～8中任何一項(xiàng)所述的抗過敏劑，其特征是上述硫酸角質(zhì)素寡聚糖，至少含有用下式表示的二糖，作為構(gòu)成成分，Gal(6S)-GlcNAc(6S)(式中，Gal表示半乳糖、GlcN表示葡萄糖胺、Ac表示乙?；?S表示6-0-硫酸酯)。10.權(quán)利要求9所述的抗過敏劑，其特征是上述硫酸角質(zhì)素寡聚糖選自用式(I)表示的四硫酸化-乙?；樘前匪奶?、用式(II)表示的三硫酸化N-乙?；樘前肺逄?、用式(III)表示的二硫酸化N-乙?；樘前范牵珿al(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(I)NeuAc～Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(II)Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(III)(式中，Gal表示半乳糖、GlcN表示葡萄糖胺、Neu表示神經(jīng)氨酸、Ac表示乙?；?、6S表示6-0-硫酸酯。另外，～表示α2，3鍵或α2，6鍵)。11.免疫調(diào)節(jié)劑，其含有硫酸角質(zhì)素寡聚糖和/或其藥學(xué)上可接受的鹽，作為有效成分。12.免疫調(diào)節(jié)劑，其含有唾液酸和/或巖藻糖的硫酸化的N-乙酰基乳糖胺單元的硫酸角質(zhì)素寡聚糖和/或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分。13.權(quán)利要求11或12所述的免疫調(diào)節(jié)劑，上述硫酸角質(zhì)素寡聚糖是在還原末端上具有硫酸化的N-乙酰基葡萄糖胺的2～5糖單元的寡聚糖，是在1個(gè)分子中至少2處的羥基硫酸化的硫酸角質(zhì)素寡聚糖。14.權(quán)利要求11～13中的任何一項(xiàng)所述的免疫調(diào)節(jié)劑，其特征是上述硫酸角質(zhì)素寡聚糖，含有至少用下式表示的二糖，作為構(gòu)成成分，Gal(6S)-GlcNAc(6S)(式中，Gal表示半乳糖、GlcN表示葡萄糖胺、Ac表示乙?；?、6S表示6-0-硫酸酯)。15.權(quán)利要求14所述的免疫調(diào)節(jié)劑，其特征是上述硫酸角質(zhì)素寡聚糖選自用式(I)表示的四硫酸化N-乙酰基乳糖胺四糖、用式(II)表示的三硫酸化N-乙?；樘前肺逄恰⒂檬?III)表示的二硫酸化N-乙?；樘前范?，Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(I)NeuAc～Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(II)Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(III)(式中，Gal表示半乳糖、GlcN表示葡萄糖胺、Neu表示神經(jīng)氨酸、Ac表示乙?；?、6S表示6-0-硫酸酯。另外，～表示α2，3鍵或α2，6鍵)。16.細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑，其含有硫酸角質(zhì)素寡聚糖和/或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分。17.細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑，其包括唾液酸和/或巖藻糖的硫酸化的N-乙?；樘前穯卧牧蛩峤琴|(zhì)素寡聚糖和/或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分。18.權(quán)利要求16或17所述的細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑，上述硫酸角質(zhì)素寡聚糖是在還原末端上，具有硫酸化的N-乙酰基葡萄糖胺的2～5糖單元的寡聚糖，且在1個(gè)分子中，至少2處的羥基被硫酸化的硫酸角質(zhì)素寡聚糖。19.權(quán)利要求16～18中的任何一項(xiàng)所述的細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑，其特征是上述硫酸角質(zhì)素寡聚糖，至少含有用下式表示的二糖，作為構(gòu)成成分，Gal(6S)-GlcNAc(6S)(式中，Gal表示半乳糖、GlcN表示葡萄糖胺、Ac表示乙?；?S表示6-0-硫酸酯)。20.權(quán)利要求19所述的細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑，其特征是，上述硫酸角質(zhì)素寡聚糖選自用式(I)表示的四硫酸化N-乙?；樘前匪奶恰⒂檬?II)表示的三硫酸化N-乙?；樘前肺逄?、用式(III)表示的二硫酸化N-乙?；樘前范?，Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(I)NeuAc～Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(II)Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(III)(式中，Gal表示半乳糖、GlcN表示葡萄糖胺、Neu表示神經(jīng)氨酸、Ac表示乙?；?、6S表示6-0-硫酸酯；另外，～表示α2，3鍵或α2，6鍵)。21.細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，其含有硫酸角質(zhì)素寡聚糖和/或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分。22.細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，其含有唾液酸和/或巖藻糖的硫酸化的N-乙酰基乳糖胺單元的硫酸角質(zhì)素寡聚糖和/或其藥學(xué)上可接受的鹽，作為有效成分。23.權(quán)利要求21或22所述的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，其中，上述硫酸角質(zhì)素寡聚糖是在還原末端，具有硫酸化的N-乙?；咸烟前返?～5糖單元的寡聚糖，且是在1個(gè)分子中，至少2處的羥基被硫酸化的硫酸角質(zhì)素寡聚糖。24.權(quán)利要求21～23中任何一項(xiàng)所述的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，其特征是上述硫酸角質(zhì)素寡聚糖，至少含有用下式表示的二糖作為構(gòu)成成分，Gal(6S)-GlcNAc(6S)(式中，Gal表示半乳糖、GlcN表示葡萄糖胺、Ac表示乙?；?、6S表示6-0-硫酸酯)。25.權(quán)利要求24所述的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，其特征是上述硫酸角質(zhì)素寡聚糖選自用式(I)表示的四硫酸化N-乙酰基乳糖胺四糖、用式(II)表示的三硫酸化N-乙?；樘前肺逄?、用式(III)表示的二硫酸化N-乙?；樘前范牵珿al(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(I)NeuAc～Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(II)Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(III)(式中，Gal表示半乳糖、GlcN表示葡萄糖胺、Neu表示神經(jīng)氨酸、Ac表示乙?；?S表示6-0-硫酸酯。另外，～表示α2，3鍵或α2，6鍵)。26.硫酸角質(zhì)素寡聚糖級(jí)分，是在還原末端上具有硫酸化的N-乙?；咸烟前返?～5糖單元的寡聚糖，其含有99％以上的，在1個(gè)分子中，至少有2處的羥基被硫酸化的硫酸角質(zhì)素寡聚糖，具有如下特性；(a)基本上不含內(nèi)毒素，另外，核酸、蛋白質(zhì)、蛋白酶的含量在檢出界限以下，(b)基本上不含透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸類肝素及硫酸角質(zhì)素。27.硫酸角質(zhì)素寡聚糖級(jí)分，其含有99％以上的，以至少用下式表示的二糖作為構(gòu)成成分的硫酸角質(zhì)素寡聚糖，其具有如下特性，Gal(6S)-G1cNAc(6S)(式中，Gal表示半乳糖、GlcN表示葡萄糖胺、Ac表示乙?；?、6S表示6-0-硫酸酯)。(a)基本上不含內(nèi)毒素，另外，核酸、蛋白質(zhì)、蛋白酶的含量在檢出界限以下。(b)基本上不含透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸類肝素及硫酸角質(zhì)素。28.權(quán)利要求26或27所述的硫酸角質(zhì)素寡聚糖級(jí)分，其特征是，上述硫酸角質(zhì)素寡聚糖選自用式(I)表示的四硫酸化N-乙?；樘前匪奶?、用式(II)表示的三硫酸化N-乙酰基乳糖胺五糖、用式(III)表示的二硫酸化N-乙?；樘前范?，Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(I)NeuAc～Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(II)Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(III)(式中，Gal表示半乳糖、GlcN表示葡萄糖胺、Neu表示神經(jīng)氨酸、Ac表示乙酰基、6S表示6-0-硫酸酯。另外，～表示α2，3鍵或α2，6鍵)。29.權(quán)利要求26～28中任何一項(xiàng)所述的硫酸角質(zhì)素寡聚糖級(jí)分，其是用內(nèi)-β-N-乙?；咸烟前访感土蛩峤琴|(zhì)素降解酶將來自軟骨魚類的高硫酸化硫酸角質(zhì)素進(jìn)行降解后，分級(jí)得到的。30.硫酸角質(zhì)素寡聚糖級(jí)分的制備方法，其包括如下兩個(gè)步驟，即通過具有下述理化性質(zhì)的硫酸角質(zhì)素降解酶將硫酸角質(zhì)素降解的步驟，①作用與硫酸角質(zhì)素作用，將其N-乙?；被咸烟擒真I進(jìn)行水解；②基質(zhì)特異性與硫酸角質(zhì)素I、硫酸角質(zhì)素II及多硫酸角質(zhì)素作用，作為主要降解物，生成硫酸化硫酸角質(zhì)素二糖及硫酸化硫酸角質(zhì)素四糖；和，從該降解生成物，分流出具有下述性質(zhì)的硫酸角質(zhì)素寡聚糖步驟，(A)以硫酸化N-乙酰基乳糖胺作為基本骨架的硫酸角質(zhì)素寡聚糖為主要成分；(B)基本上不含內(nèi)毒素、而核酸、蛋白質(zhì)及蛋白酶的含量是微量或檢出界限以下；(C)基本上不含透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素B、硫酸類肝素及硫酸角質(zhì)素。31.權(quán)利要求30所述的硫酸角質(zhì)素寡聚糖級(jí)分的制備法，其特征是在通過上述硫酸角質(zhì)素降解酶進(jìn)行降解的步驟中，除了利用權(quán)利要求30所述的理化性質(zhì)之外，還使用具有下述理化性質(zhì)的硫酸角質(zhì)素降解酶，①最適反應(yīng)pH4.5～6(0.1M醋酸緩沖液及10mMTris醋酸緩沖液中，37℃)；②pH穩(wěn)定性6～7(0.1M醋酸緩沖液及10mMTris醋酸緩沖液中，在37℃下、放置1小時(shí))；③最適反應(yīng)溫度50～60℃(0.1M醋酸緩沖液、pH6.0、反應(yīng)10分鐘)；④熱穩(wěn)定性至少在45℃以下穩(wěn)定(0.1M醋酸緩中液、pH6.0、放置1小時(shí))。32.權(quán)利要求30或31所述的硫酸角質(zhì)素寡聚糖級(jí)分的制備方法，上述硫酸角質(zhì)素是高硫酸化硫酸角質(zhì)素，硫酸角質(zhì)素寡聚糖是用式(I)表示的四硫酸化N-乙酰乳糖胺四糖、用式(II)表示的三硫酸化N-乙酰乳糖胺五糖、用式(III)表示的二硫酸化N-乙酰乳糖胺二糖中任何一種，Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(I)NeuAc～Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(II)Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)…(III)(式中，Gal表示半乳糖、GlcN表示葡萄糖胺、Neu表示神經(jīng)氨酸、Ac表示乙酰基、6S表示6-0-硫酸酯。另外，～表示α2，3鍵或α2，6鍵)。全文摘要是在還原末端具有硫酸化的N－乙?；咸烟前返?～5糖單元的寡聚糖,是以1個(gè)分子中至少有2處的羥基被硫酸化的硫酸角質(zhì)素寡聚糖,優(yōu)選的是作為其構(gòu)成成分,含有用Gal(6S)－G1cNAc(6S)(其中,Ga1表示半乳糖、G1cN表示葡萄糖胺、Ac表示乙?；?、6S表示6—0－硫酸酯)表示的二糖的硫酸角質(zhì)素寡聚糖和/或其藥學(xué)上可接受的鹽作為抗炎癥劑、抗過敏劑、免疫調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的有效成分。文檔編號(hào)C07H13/04GK1174557SQ9519749公開日1998年2月25日申請日期1995年11月22日優(yōu)先權(quán)日1994年12月1日發(fā)明者丸山浩,森川清志,多和田明,宮內(nèi)聰,吉田圭一,淺利晃申請人:生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社