專利名稱：一種鼠李聚糖硫酸酯及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鼠李聚糖硫酸酯及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血栓栓塞性疾病是現(xiàn)代社會(huì)主要的致死性疾病之一，且隨著人類飲食結(jié)構(gòu)
的變化有逐年上升的趨勢(shì)。目前，每年抗凝血藥物的全球市值約為40億美元， 并以13%的速度逐年遞增；抗血栓藥物的全球市值約為120億美元，每年以15 %的速度遞增。因此，現(xiàn)有抗凝血和抗血栓藥物遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足日益增長(zhǎng)的臨 床需要。而且，研究發(fā)現(xiàn)作為抗凝血藥物已經(jīng)廣泛應(yīng)用了70多年的肝素具有多 種副作用，如誘發(fā)血小板減少癥、出血作用、對(duì)先天性凝血酶缺乏無(wú)效、無(wú)抑 制凝血酶與纖維蛋白結(jié)合的能力。此外，制備肝素的主要原料中肝素濃度低， 與牛相關(guān)的"瘋牛病"的發(fā)生，迫切需要尋找抗凝血藥物的可替代資源。近 年來(lái)人們除繼續(xù)研究開(kāi)發(fā)低分子量肝素，如依諾肝素、那屈肝素鈣、達(dá)肝素鈉 和亭扎肝素鈉外，還根據(jù)肝素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行天然高分子的結(jié)構(gòu)改造，如纖維 硫酸酯、果膠、甲殼質(zhì)、軟骨素以及這些多糖衍生物的硫酸酯。實(shí)驗(yàn)證明，這 些肝素類物質(zhì)都具有一定的抗凝血活性，但都有一定的毒性。海藻是抗凝血多 糖的一個(gè)天然豐富來(lái)源。目前海藻多糖的研發(fā)主要集中于紅藻多糖和褐藻多 糖。如藻酸雙酯鈉及甘糖酯，是以褐藻酸為原料，經(jīng)過(guò)分子修飾而制備的具有 抗血栓作用藥物；另外，研究比較多的則是褐藻巖藻聚糖硫酸酯，其具有抗血 栓形成和溶解血栓的雙重作用。但是，目前有關(guān)綠藻多糖的研發(fā)很少。綠藻多 糖主要存在于綠藻細(xì)胞間質(zhì)中，多為水溶性硫酸多糖，它也存在于綠藻細(xì)胞壁
之中，綠藻細(xì)胞壁微纖維主要由木聚糖或甘露聚糖構(gòu)成，另外，綠藻細(xì)胞質(zhì)內(nèi) 尚有少量的多糖存在。水溶性硫酸多糖是綠藻多糖的主要成分，其組成和結(jié)構(gòu) 隨綠藻種類的不同而不同。目前，有關(guān)鼠李聚糖硫酸酯未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鼠李聚糖硫酸酯及其制備方法和應(yīng)用，它能彌補(bǔ) 現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。
一種鼠李聚糖硫酸酯，其特征在于該鼠李聚糖硫酸酯是鼠李糖構(gòu)成的長(zhǎng)鏈
多糖，同時(shí)在鼠李糖基上連接著硫酸酯基，硫酸酯基的取代度為0.4 2，鼠李 聚糖硫酸酯的重均分子量為150000 400000道爾頓，分子式為(C6H704R2) n， 結(jié)構(gòu)式如下所示
其中n=500~1800， R=H或S03—。
上述鼠李聚糖硫酸酯的制備方法，其特征在于將海藻藻體加水浸泡勻 漿，室溫提取，分離出沉淀物，再向沉淀物加水，加熱提取，分離出清液， 將所得清液濃縮，脫鹽，再將脫鹽后的溶液濃縮，然后依次通過(guò)離子交換色 譜柱分離、凝膠色譜柱分離，將得到的多糖溶液濃縮，干燥。 上述鼠李聚糖硫酸酯在制備抗凝血藥物或抗栓藥物中的應(yīng)用。 本發(fā)明的鼠李聚糖硫酸酯是一種具有強(qiáng)聚陰離子性質(zhì)的硫酸多糖類化合 物，來(lái)源于天然海藻，有望成為一種新型的抗凝血藥物或抗栓藥物，將具有 良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
稱取干燥的海藻藻體加入海藻重量10 60倍的水浸泡勻漿，室溫下攪拌
提取0.1 2小時(shí)，離心棄去清液，取含海藻藻體的沉淀物，再加海藻重量 10 60倍的水，在60 100。C水浴中攪拌提取1~10小時(shí)，離心棄去雜質(zhì)，取 清液，將所得清液減壓濃縮，然后進(jìn)行透析或超濾去除鹽，將除去鹽后的多 糖溶液減壓濃縮后，通過(guò)離子交換色譜柱Q-Sepharose Fast Flow分離，依次 以蒸餾水、0.01 5.0 mol/L氯化鈉水溶液洗脫，收集多糖溶液，將該多糖溶 液減壓濃縮，再通過(guò)凝膠色譜柱SephacryalS-400HR進(jìn)一步分離，以蒸餾水 洗脫，收集多糖溶液，將所得多糖溶液減壓濃縮，冷凍干燥即得本發(fā)明的鼠 李聚糖硫酸酯。
本實(shí)施例中所述的海藻藻體可為礁膜、寬礁膜、袋礁膜、囊礁膜、北極 礁膜、破礁膜、厚礁膜、皺礁膜、褐色礁膜、尖種礁膜、孔石莼、石莼、長(zhǎng) 石莼、硬石莼或花石莼；所述的海藻藻體加水浸泡勻漿，也可為將海藻碾碎、 切細(xì)、剁碎、研磨或絞碎與水混合形成海藻勻漿，或?qū)⒑Ｔ寮庸こ筛稍锓勰?與水混合形成海藻勻漿；所述的離子交換色譜柱Q-Sepharose Fast Flow還 可改用DEAE Sepharose、DEAE Cellulose、DEAE Sephadex、 Q-Sepharose XL、 Q Sepharose、 Q Sepharose 4 Fast Flow、 QAE Sephadex或Dowex;所述的用 蒸餾水、0.01 5.0mol/L氯化鈉水溶液洗脫也可改用蒸餾水、0.01 5.0mo}/L 氯化鉀水溶液洗脫；所述的凝膠色譜柱Sephacryal S-400 HR還可改用 Sephacryal S-300 HR、 Sephacryal S-200 HR、 Sephacryal S-100 HR、 Sephacryal S-500HR、 Sephacryal S-1000 SF、 Toyopearl HW-65、 Superdex200、 Superose 6、 Superose 12、 Sepharose 6 Fast Flow、 Sepharose 4 Fast Flow、 Sepharose 2B、
Sepharose 4B、 Sepharose 6B、 Sepharose CL-2B、 Sepharose CL-4I3或Sepharose CL-6B;所述的用蒸餾水洗脫也可改用0.01 1.0 mol/L醋酸鈉水溶液、 0.01 1.0mol/L氯化鈉水溶液、0.01 1.0mol/L氯化鉀水溶液或0.01-1.0 mol/L
碳酸氫銨水溶液洗脫。
本發(fā)明的鼠李聚糖硫酸酯為白色或類白色無(wú)定形粉末，略有淡咸味。用氣 相色譜法測(cè)定多次制得的鼠李聚糖硫酸酯的單糖組成，用高碘酸氧化、 Smith(史密斯)降解和甲基化分析測(cè)定糖苷鍵連接位置、用硫酸鋇-明膠比濁法 測(cè)定硫酸酯基含量并計(jì)算硫酸酯基取代度、用高效凝膠滲透色譜法測(cè)定分子 量。通過(guò)分析確定，本發(fā)明的鼠李聚糖硫酸酯是鼠李糖構(gòu)成的長(zhǎng)鏈多糖，同時(shí) 在鼠李糖基上連接著硫酸酯基，硫酸酯基的取代度為0.4~2，鼠李聚糖硫酸酯 的重均分子量為150000 400000道爾頓，分子式為(C6H704R2) n，結(jié)構(gòu)式如
下所示
其中n=500 1800, R=H或SCV。
下面是鼠李聚糖硫酸酯的抗凝血作用和抗栓作用評(píng)價(jià)結(jié)果。
鼠李聚糖硫酸酯的抗凝血作用是通過(guò)活化部分凝血活酶時(shí)間、凝血酶時(shí)間 和凝血酶原時(shí)間進(jìn)行評(píng)價(jià)的，鼠李聚糖硫酸酯的抗栓作用是通過(guò)對(duì)大鼠體內(nèi)、 體外試驗(yàn)性血栓形成的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)的。
1.鼠李聚糖硫酸酯對(duì)活化部分凝血活酶時(shí)間的影響取健康人靜脈血，置于 含有1/10(血液與抗凝劑體積比為9: l)體積重量百分濃度為3.3%的枸櫞
酸鈉抗凝液的塑料管中，輕輕顛倒混勻，以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15min，收 集上層血漿，備用。取待測(cè)血漿卯pL，分別加入5， 15， 50， 100， 200， 300， 500嗎/mL的鼠李聚糖硫酸酯水溶液10iiL， 37。C孵育lmin，加入活 化部分凝血活酶時(shí)間試劑100|iL, 37。C孵育2 min，加入37。C預(yù)熱 0.025mol/L CaCb溶液100pL，記錄凝固時(shí)間，即為活化部分凝血活酶時(shí) 間值。對(duì)照組加入生理鹽水l(VL，按上述方法測(cè)定活化部分凝血活酶時(shí) 間值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鼠李聚糖硫酸酯可明顯延長(zhǎng)活化部分凝血活酶活化 時(shí)間，與對(duì)照組比較有顯著性差異(PO.OOl)，表明鼠李聚糖硫酸酯能抑制 內(nèi)源性凝血途徑或共有凝血途徑。不同濃度鼠李聚糖硫酸酯對(duì)活化部分凝 血活酶時(shí)間的影響表現(xiàn)為濃度愈大，凝固時(shí)間愈長(zhǎng)，表明鼠李聚糖硫酸酯 的抗凝作用與濃度呈線性關(guān)系，
2. 鼠李聚糖硫酸酯對(duì)凝血酶時(shí)間的影響血漿的分離如上所述。取待測(cè)血漿 90nL,分別加入5， 15， 50， 100， 200， 300， 500(ig/mL的鼠李聚糖硫酸 酯水溶液10(aL，37。C孵育lmin，加入37。C預(yù)熱凝凝血酶時(shí)間試劑200 pL， 記錄凝固時(shí)間，即為凝血酶時(shí)間值。對(duì)照組加入生理鹽水10pL，按上述 方法測(cè)定凝血酶時(shí)間值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鼠李聚糖硫酸酯可明顯延長(zhǎng)血漿 凝血酶時(shí)間，與對(duì)照組比較有顯著性差異(PO.OOl)，說(shuō)明鼠李聚糖硫酸酯 能抑制凝血酶活性或抑制纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白。不同濃度鼠李聚糖 硫酸酯對(duì)凝血酶時(shí)間的影響表現(xiàn)為濃度愈大，凝固時(shí)間愈長(zhǎng)，表明鼠李聚 糖硫酸酯的抗凝作用與濃度呈線性關(guān)系。
3. 鼠李聚糖硫酸酯對(duì)凝血酶原時(shí)間的影響血漿的分離如上所述。取待測(cè)血 漿90pL,分別加入5， 15， 50， 100， 200， 300， 500嗎/mL的鼠李聚糖硫
酸酯水溶液10pL， 37。C孵育lmiii，加入37。C預(yù)熱凝血酶原時(shí)間試劑200 (iL，記錄凝固時(shí)間，即為凝血酶原時(shí)間值。對(duì)照組加入生理鹽水lO(iL， 按上述方法測(cè)定凝血酶原時(shí)間值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鼠李聚糖硫酸酯對(duì)血漿 凝血酶原時(shí)間影響不明顯，與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(PX).05)，表明鼠
李聚糖硫酸酯對(duì)外源性凝血途徑?jīng)]有影響。
4. 鼠李聚糖硫酸酯對(duì)大鼠體內(nèi)試驗(yàn)性血栓形成的影響取體重200~250克的 健康雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為生理鹽水組、16mg/kg鼠李聚糖硫酸酯 組、8mg/kg鼠李聚糖硫酸酯組、4mg/kg鼠李聚糖硫酸酯組和4mg/kg肝 素組，每日分早晚2次灌胃，每次灌胃0.4mL，生理鹽水組灌以生理鹽水 0.4mL。于第11天按每日總量灌胃后20分鐘，用戊巴比妥鈉腹腔注射麻 醉大鼠(40mg/kg)，剝離右側(cè)頸總動(dòng)脈15mm長(zhǎng)，用體內(nèi)血栓形成儀的 刺激電極將動(dòng)脈近心端輕輕挑起，用測(cè)溫探頭挑起動(dòng)脈遠(yuǎn)心端。藥后30 分鐘用1.6mA直流電流持續(xù)刺激7分鐘，當(dāng)動(dòng)脈內(nèi)因血栓形成阻塞血流 時(shí)，血管表面溫度突降。從刺激開(kāi)始到溫度突降所需時(shí)間稱阻塞時(shí)間 (Ocelusiontime,簡(jiǎn)稱OT)，以O(shè)T長(zhǎng)短作為藥效指標(biāo)。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均 數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間差異的顯著性檢驗(yàn)用t檢驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鼠李聚糖硫酸酯有明顯的抗動(dòng)脈血栓作用，劑量增加則作 用增強(qiáng)，而且鼠李聚糖硫酸酯比肝素有明顯抗動(dòng)脈血栓作用(P<0.001)。
5. 鼠李聚糖硫酸酯對(duì)大鼠體外試驗(yàn)性血栓形成的影響藥物分組對(duì)照組(生 理鹽水組)、8mg/kg鼠李聚糖硫酸酯組、4mg/kg鼠李聚糖硫酸酯組、2 mg/kg鼠李聚糖硫酸酯組和2 mg/kg肝素組。取健康雄性Wistar大鼠，以 戊巴比妥鈉靜脈麻醉大鼠(40 mg/kg)，分離頸總動(dòng)脈，以干燥的玻璃 射器自頸總動(dòng)脈取血2mL，均分于兩個(gè)硅化聚乙烯管環(huán)內(nèi)，血液在37。C 環(huán)境中，以17轉(zhuǎn)Z分鐘轉(zhuǎn)動(dòng)30分鐘后停止，按拉丁方設(shè)計(jì)的給藥順序分 別向每根管環(huán)的兩端各加藥O.lmL，轉(zhuǎn)動(dòng)60分鐘，自聚乙烯管環(huán)內(nèi)傾出 血栓，立即稱重，測(cè)量血栓長(zhǎng)度，置6(TC恒溫干燥箱中烘干，并稱其干 重，按上述步驟再取血做其余四組，然后再取5只大鼠重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，按 以下公式計(jì)算各藥物組的溶栓率。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示， 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間差異的顯著性檢驗(yàn)用t檢驗(yàn)。
對(duì)照組血栓濕重一給藥組血栓濕重 溶栓率(％) = -^- x 100%
對(duì)照組血栓濕重
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，8mg/kg鼠李聚糖硫酸酯、4mg/kg鼠李聚糖硫酸酯組和2 mg/kg鼠李聚糖硫酸酯組濕重、干重及長(zhǎng)度與生理鹽水組比較均明顯減小
(PO.OOl)，表明鼠李聚糖硫酸酯具有體外溶栓作用，而且8mg/kg鼠李聚 糖硫酸酯組和4 mg/kg鼠李聚糖硫酸酯組比2 mg/kg肝素組有明顯溶栓作用
(P<G.001)，肝素組與生理鹽水組比較，血栓濕重、干重及長(zhǎng)度均無(wú)明顯差 別(P〉0.05)。
權(quán)利要求
1.一種鼠李聚糖硫酸酯，其特征在于該鼠李聚糖硫酸酯是鼠李糖構(gòu)成的長(zhǎng)鏈多糖，同時(shí)在鼠李糖基上連接著硫酸酯基，硫酸酯基的取代度為0.4～2，鼠李聚糖硫酸酯的重均分子量為150000～400000道爾頓，分子式為(C6H7O4R2)n，結(jié)構(gòu)式如下所示其中n＝500～1800，R＝H或SO3-。
2. 權(quán)利要求1所述的鼠李聚糖硫酸酯的制備方法，其特征在于將海藻藻 體加水浸泡勻漿，室溫提取，分離出沉淀物，再向沉淀物加水，加熱提 取，分離出清液，將所得清液濃縮，脫鹽，再將脫鹽后的溶液濃縮，然 后依次通過(guò)離子交換色譜柱分離、凝膠色譜柱分離，將得到的多糖溶液 濃縮，干燥。
3. 權(quán)利要求1所述的鼠李聚糖硫酸酯在制備抗凝血藥物或抗栓藥物中的 應(yīng)用。
4. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的海藻藻體為礁膜、 寬礁膜、袋礁膜、囊礁膜、北極礁膜、破礁膜、厚礁膜、皺礁膜、褐色 礁膜、尖種礁膜、孔石莼、石藥、長(zhǎng)石莼、硬石莼或花石莼。
5. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的海藻藻體加水浸泡 勻漿為將海藻藻體直接浸泡于水中然后勻漿，或?qū)⒑Ｔ迥胨?、切?xì)、剁 碎、研磨或絞碎后與水混合形成海藻勻漿，或?qū)⒑Ｔ寮庸こ筛稍锓勰┡c 水混合形成海藻勻漿。
6. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的離子交換色譜柱分離為用色譜柱Q-Sepharose Fast Flow、 DEAE Sepharose、 DEAE Cellulose、 DEAE Sephadex、 Q-Sepharose XL、 Q Sepharose、 Q Sepharose 4FastFlow、 QAE Sephadex或Dowex分離，所用的洗脫液為水溶液、 0.01~5.0 mol/L氯化鈉水溶液或0.01~5.0 mol/L氯化鉀水溶液。 7.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的凝膠色譜柱分離為 用色譜柱Sephacryal S-400 HR、 Sephacryal S-300 HR、 Sephacryal S-200 HR、 Sephacryal S-100 HR、 Sephacryal S-500 HR、S印hacryal S-1000 SF、 Toyopearl HW-65、 Superdex 200、 Superose 6、 Superose 12、 Sepharose 6 Fast Flow、 Sepharose 4 Fast Flow、 Sepharose 2B、 Sepharose 4B、 Sepharose 6B、 Sepharose CL-2B、 Sepharose CL-4B或Sepharose CL-6B 分離，所用的洗脫液為水溶液、0.01~1.0mol/L醋酸鈉水溶液、 0.01 1.0mol/L氯化鈉水溶液、0.01~1.0mol/L氯化鉀水溶液或 0.01~1.0mol/L碳酸氫銨水溶液。
全文摘要
一種鼠李聚糖硫酸酯，其特征在于該鼠李聚糖硫酸酯是鼠李糖構(gòu)成的長(zhǎng)鏈硫酸多糖，分子式為(C₆H₇O₄R₂)_n，制備時(shí)將海藻藻體加水浸泡勻漿，室溫提取，分離出沉淀物，再向沉淀物加水，加熱提取，分離出清液，將所得清液濃縮，脫鹽，再將脫鹽后的溶液濃縮，然后依次通過(guò)離子交換色譜柱分離、凝膠色譜柱分離，將得到的多糖溶液濃縮，干燥。本發(fā)明的鼠李聚糖硫酸酯是一種具有強(qiáng)聚陰離子性質(zhì)的硫酸多糖類化合物，可用于制備一種新型的抗凝血藥物或抗栓藥物，具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P7/02GK101104650SQ20071001632
公開(kāi)日2008年1月16日 申請(qǐng)日期2007年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月23日
發(fā)明者毛文君 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)