專利名稱：一種巖藻聚糖硫酸酯酶的生產菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于海洋微生物技術領域，具體涉及一種巖藻聚糖硫酸酯酶的生產菌株及其應用。
背景技術：
巖藻聚糖硫酸酯(Fucoidan)是廣泛存在于褐藻中的一種高分子量的硫酸雜多糖，主要由L-巖藻糖及硫酸酯基團組成，另外還含有半乳糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、糖醛酸等。研究發(fā)現(xiàn)它具有多種生理活性，包括抗凝血、抗腫瘤、抗炎、抗血栓、提高免疫力、抗氧化、抗感染等，因此巖藻聚糖硫酸酯成為當今天然海洋活性物質的主攻重點。但由于巖藻聚糖硫酸酯的分子量巨大，從幾萬到幾十萬都有，嚴重影響了它的吸收效率，同時巖藻聚糖硫酸酯通常具有一定的粘性，也大大阻礙了它作為藥物的應用。將大分子量的巖藻聚糖硫酸酯降解為小分子量的低聚糖，可以解決上述的應用難題，同時也是目前進行巖藻聚糖硫酸酯構效研究的重要手段。目前，降解巖藻聚糖硫酸酯的方法主要有化學降解法、物理降解法和酶降解法?；瘜W降解法是非特異性降解，反應條件苛刻，水解較難控制，而且產物轉化率低，功能性低。物理降解法雖然操作簡單可控性好，但其降解效率普遍較低，很難得到符合一定分子量范圍的產品。最好的方法就是酶解法，可以特異性地、選擇性地切斷巖藻聚糖鏈，反應過程容易控制，易于得到所需分子量范圍的低聚糖產品，產物含量高，功能性強。目前，國內外關于巖藻聚糖硫酸酯酶已有一些報道，但是商品化的酶制劑十分緊缺。主要由于產酶微生物的產酶能力滿足不了商業(yè)化的要求，因此，尋找酶的高產菌株是解決巖藻聚糖硫酸酯應用問題的重要途徑。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種巖藻聚糖硫酸酯酶的生產菌及其應用，本發(fā)明提供的菌能夠高效的生產巖藻聚糖硫酸酯酶，從而有效降解巖藻聚糖硫酸酯，為巖藻聚糖硫酸酯的應用和構效研究提供了有效方法。本發(fā)明篩選的巖藻聚糖硫酸酯酶生產菌LHD4 (Algibacter sp.)，已于2013年01月06日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號=CGMCC N0.7089。本發(fā)明篩選的菌可用于降解巖藻聚糖硫酸酯。本發(fā)明的細菌LHD4的活菌用于制備菌液；所制得的菌液可以用于提取胞內酶，從而用于降解巖藻聚糖硫酸酯。本發(fā)明所篩選的細菌用于制備巖藻聚糖硫酸酯酶。本發(fā)明篩選的具有巖藻聚糖硫酸酯酶生產能力的細菌，該菌株產酶活力高，達到230U/mL,具有在工業(yè)生產中的應用價值。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明進行詳細的描述?！?、菌株LHD4的篩選對海帶樣品進行微生物富集、初篩、復篩，獲得產酶菌。對產酶菌進行液體培養(yǎng)，提取胞內產物，獲得巖藻聚糖硫酸酯酶。具體技術方案如下:(I)微生物富集培養(yǎng):無菌條件下取適量海帶樣品，加入無菌海水搗碎，取樣品
2.5mL接入50mL富集培養(yǎng)基(Fucoidan0.2%,蛋白胨1%,硝酸銨1.6mg/mL,磷酸氫二鈉8mg/mL，用過膜海水配制，pH自然。)進行培養(yǎng)，在25°C，150rpm的恒溫培養(yǎng)搖床培養(yǎng)5天。培養(yǎng)結束后，取上述富集液2.5mL接入富集培養(yǎng)基重復富集兩次。(2)產酶微生物初篩:將富集培養(yǎng)液適當稀釋后，涂布于選擇性培養(yǎng)基(Fucoidan0.2%，蛋白胨0.2%，硝酸銨5mg/mL，瓊脂2%，用過膜海水配制，pH自然)平板上，在25°C培養(yǎng)5天。將平板中所有形態(tài)不同的單菌落，進行純化培養(yǎng)，再接入2216E瓊脂斜面培養(yǎng)基，于25°C培養(yǎng)至長滿斜面,置于4°C冰箱保存。(3)產酶微生物復篩:將上述斜面菌種分別接種至15mL液體培養(yǎng)基(Fucoidan0.2%,蛋白胨1%,硝酸銨5mg/mL,用過膜海水配制，pH自然)，于25°C,180rpm搖床培養(yǎng)，用次甲基藍法測定Fucoidan含量。結果獲得一株菌LHD4,培養(yǎng)48小時后巖藻聚糖硫酸酯含量下降最大，達到70%。(4)產酶菌LHD4的形態(tài)、生理生化和分子生物學鑒定:將產酶菌劃線接種于2216E瓊脂平板，光學顯微鏡觀察細菌形態(tài)和生理生化鑒定菌落特征為菌落呈深黃色，圓形隆起狀，邊緣整齊，有鞭毛，有運動性，細胞革蘭氏染色陰性，接觸酶陽性，氧化酶陽性，葡萄糖發(fā)酵產酸屬發(fā)酵型，無鹽 條件下不生長，l%、3%、5%NaCl胨水刺激其生長，在海水中生長。16SrDNA分子生物學鑒定屬于黃桿菌科(Flavobacteriaceae), Algibacter屬，經過與黃桿菌科細菌RC2-3 (保藏編號:CGMCC N0.6932)的16SrDNA進行比對，二者相似度僅為89%，說明LHD4與RC2-3為不同屬的細菌。菌株LHD4在2216E瓊脂平板上25°C培養(yǎng)24h后，菌落呈深黃色，圓形隆起狀，邊緣整齊，有鞭毛，有運動性，細胞革蘭氏染色陰性，接觸酶陽性，氧化酶陽性，葡萄糖發(fā)酵產酸屬發(fā)酵型，無鹽條件下不生長，l%、3%、5%NaCl胨水刺激其生長，在海水中生長。該菌株已于2013年01月06日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCN0.7089。二、LHD4菌液的制備將保藏編號為CGMCC N0.7089的細菌LHD4接種于液體培養(yǎng)基(Fucoidan 0.2%，牛肉膏1%，用過膜海水配制，pH自然)中，25°C、180rpm條件下培養(yǎng)12h，獲得種子培養(yǎng)液，將種子培養(yǎng)液按10%接種量接種于新鮮的液體培養(yǎng)基，于25°C、150rpm條件下培養(yǎng)48h，即制得菌液。三、LHD4胞內酶的信息1、產酶菌LHD4胞內酶的制備將LHD4的菌液于4°C、IOOOOg離心5_10分鐘，棄上清，取沉淀，用少量海水溶解沉淀，在冰浴保護下，500w條件進行超聲波破碎細胞15min，于4°C離心lOmin，棄沉淀，上清液即為胞內酶。
2、LHD4產酶能力檢測取胞內酶與0.2%的Fucoidan (pH8.0、20mM的Tris-HCl溶解)等體積混合，于25° C、120rpm搖床振蕩培養(yǎng)2小時，以Somogy1-Nelson法測定還原糖含量。I個酶活力單位定義為25° C、pH8.0條件下，每小時產生的I納摩爾還原糖需要的酶量。經測定，菌株LHD4培養(yǎng)48h后的菌液產胞內酶活力達到230U/mL。上述的實驗結果表明，本發(fā)明篩選得到的產酶菌具有很高的產酶能力，所生成的酶能有效降解高分子量的巖藻 聚糖硫酸酯，具有良好的市場推廣前景。
權利要求
1.一種巖藻聚糖硫酸酯酶的生產菌株，其保藏編號為CGMCC N0.7089。
2.權利要求1所述的巖藻聚糖硫酸酯酶的生產菌株在降解巖藻聚糖硫酸酯中的應用。
3.一種菌液，所述的菌液是用權利要求1所述的巖藻聚糖硫酸酯酶的生產菌株擴大培養(yǎng)制備的。
4.權利要求3所述菌 液在制備用于降解巖藻聚糖硫酸酯的胞內酶中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種巖藻聚糖硫酸酯酶的生產菌株，所述的菌株的保藏編號為CGMCC No.7089。本發(fā)明篩選的菌可用于降解巖藻聚糖硫酸酯。本發(fā)明篩選的具有巖藻聚糖硫酸酯酶生產能力的細菌，該菌株產酶活力高，達到230U/mL，具有在工業(yè)生產中的應用價值。
文檔編號C12N1/20GK103114063SQ201310044510
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月3日 優(yōu)先權日2013年2月3日
發(fā)明者李八方, 王瑩, 趙雪 申請人:中國海洋大學