本發(fā)明屬于生物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于循環(huán)酶修復(fù)介導(dǎo)的雙信號(hào)放大策略檢測(cè)胸腺嘧啶dna糖基化酶活性的方法。

背景技術(shù)：

胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)是體內(nèi)堿基切除修復(fù)(ber)路徑中非常重要的起始酶。在受損的基因組dna中，其能特異性識(shí)別鳥嘌呤/胸腺嘧啶(g/t)和鳥嘌呤/尿嘧啶(g/u)的錯(cuò)配堿基對(duì)，并切除錯(cuò)配堿基胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)。在dna脫甲基化反應(yīng)過程中，胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)同樣扮演著重要的角色。通過脫氨基-堿基切除修復(fù)反應(yīng)，胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)能高效地切除由十-十一轉(zhuǎn)位(ten–eleventranslocation，tets)酶氧化5-甲基胞嘧啶(5mc)所產(chǎn)生的5-甲?；奏?5fc)和5-羧基胞嘧啶(5cac)。另外，胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)還可以以配體依賴性方式與核受體(視黃酸受體(rar)和類視黃醇x受體(rxr))相互作用，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)的異常表達(dá)會(huì)直接擾亂基因組dna的修復(fù)、穩(wěn)定的表觀遺傳以及正常的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，從而引發(fā)包括癌癥在內(nèi)的多種疾病。因此，胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)活性的超靈敏檢測(cè)不僅對(duì)基礎(chǔ)生物化學(xué)的深入研究有很大幫助，而且對(duì)發(fā)展人類疾病新的治療策略有重大意義。

迄今為止，胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)活性的檢測(cè)方法仍然很少，其中凝膠電泳法是最普遍的方法，但是該方法存在檢測(cè)靈敏度低、放射性污染、耗時(shí)較長(zhǎng)等缺點(diǎn)。近年來，發(fā)展出了一些新的檢測(cè)方法如熒光分析法和電化學(xué)分析法。通常在熒光分析法中，設(shè)計(jì)一對(duì)相距很近的熒光和淬滅分子，當(dāng)胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)存在時(shí)，淬滅分子被釋放，導(dǎo)致熒光分子發(fā)出熒光，最終通過檢測(cè)熒光信號(hào)對(duì)酶活性進(jìn)行定量分析；在電化學(xué)分析法中，有報(bào)道指出由dna-量子點(diǎn)(qds)聚合物超晶格結(jié)構(gòu)的協(xié)助可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)檢測(cè)物的三步信號(hào)放大，然而上述方法均存在靈敏度提高有限的問題。因此，發(fā)展一種新的方法用于快速、靈敏、特異性檢測(cè)胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)活性是目前亟待解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提出一種檢測(cè)胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)活性的方法，該方法采用循環(huán)酶修復(fù)介導(dǎo)的雙信號(hào)放大策略，具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)。

具體的，本發(fā)明涉及以下技術(shù)方案：

首先，本發(fā)明提供一種基于循環(huán)酶修復(fù)介導(dǎo)的雙信號(hào)放大策略檢測(cè)胸腺嘧啶dna糖基化酶活性的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)待測(cè)胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)誘導(dǎo)的胸腺嘧啶切除修復(fù)：雙鏈dna底物中加入待測(cè)胸腺嘧啶dna糖基化酶、核酸內(nèi)切酶iv(endoiv)、尿嘧啶dna糖基化酶、脫氧腺苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷酸、脫氧胞苷三磷酸、脫氧尿苷三磷酸和dna聚合酶；所述雙鏈dna其中一條為環(huán)形模板dna，另一條為線性探針，所述環(huán)形模板dna與線性探針的部分序列雜交形成胸腺嘧啶dna糖基化酶的雙鏈dna底物；雜交區(qū)域內(nèi)線性探針上設(shè)計(jì)有且僅有一個(gè)錯(cuò)配的胸腺嘧啶；通過胸腺嘧啶dna糖基化酶特異性地切割脫氧核糖和胸腺嘧啶之間的n-糖苷鍵，從而剪切掉線性dna探針上錯(cuò)配的胸腺嘧啶，產(chǎn)生一個(gè)脫堿基(ap)位點(diǎn)；然后核酸內(nèi)切酶ⅳ(endoiv)將對(duì)脫堿基(ap)位點(diǎn)進(jìn)行剪切，從而導(dǎo)致線性探針3’端部分序列的斷裂；

(2)尿嘧啶切除輔助的循環(huán)滾環(huán)擴(kuò)增：在四種核苷酸(脫氧腺苷三磷酸，脫氧鳥苷三磷酸，脫氧胞苷三磷酸和脫氧尿苷三磷酸)和聚合酶存在條件下，被切斷的線性探針作為引物引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生包含尿嘧啶(u)核苷酸的長(zhǎng)片段重復(fù)序列；而后在尿嘧啶dna糖基化酶(udg)和核酸內(nèi)切酶ⅳ(endoiv)協(xié)助下，尿嘧啶被特異性切除，同時(shí)產(chǎn)生一個(gè)帶羥基的3’末端以確保新的聚合延伸的循環(huán)；持續(xù)的聚合和尿嘧啶切除過程導(dǎo)致大量報(bào)告序列的生成；產(chǎn)生的報(bào)告序列隨后與剩余的環(huán)形模板dna結(jié)合以引發(fā)新一輪的聚合和尿嘧啶切除反應(yīng)循環(huán)，最終生成大量的報(bào)告序列；

(3)核酸內(nèi)切酶ⅳ(endoiv)介導(dǎo)的信號(hào)探針循環(huán)切割以及熒光分子的釋放：加入信號(hào)探針，所述信號(hào)探針為熒光標(biāo)記探針，所述信號(hào)探針上設(shè)計(jì)有且僅有一個(gè)四氫呋喃的無嘧啶(tap)位點(diǎn)，所述信號(hào)探針與報(bào)告序列結(jié)合，引發(fā)核酸內(nèi)切酶ⅳ(endoiv)介導(dǎo)的信號(hào)探針上的四氫呋喃的無嘧啶(tap)位點(diǎn)的循環(huán)切割，最終產(chǎn)生放大的熒光信號(hào)，對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，定量分析胸腺嘧啶dna糖基化酶活性。

本發(fā)明所述檢測(cè)方法的原理為：本方法是基于循環(huán)酶修復(fù)介導(dǎo)的雙信號(hào)放大實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)胸腺嘧啶dna糖基化酶活性的熒光方法，首先線性探針與環(huán)形模板雜交形成胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)的底物，當(dāng)胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)存在時(shí)，其將特異性地切割脫氧核糖和胸腺嘧啶之間的n-糖苷鍵，從而剪切掉線性探針上錯(cuò)配的胸腺嘧啶，產(chǎn)生一個(gè)脫堿基(ap)位點(diǎn)。然后核酸內(nèi)切酶ⅳ(endoiv)將對(duì)脫堿基(ap)位點(diǎn)進(jìn)行剪切，從而導(dǎo)致線性探針3’端部分序列的斷裂。在四種核苷酸(脫氧腺苷三磷酸，脫氧鳥苷三磷酸，脫氧胞苷三磷酸和脫氧尿苷三磷酸)和聚合酶存在下，切斷的線性探針作為引物引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，生成包含尿嘧啶(u)核苷酸的長(zhǎng)片段重復(fù)序列。在尿嘧啶dna糖基化酶(udg)和核酸內(nèi)切酶ⅳ(endoiv)合作下，長(zhǎng)片段重復(fù)序列上的尿嘧啶被切除，并生成帶羥基的3’末端，以進(jìn)行新的聚合延伸反應(yīng)。持續(xù)的聚合和尿嘧啶的修復(fù)導(dǎo)致產(chǎn)物報(bào)告序列的線性擴(kuò)增。新生成的報(bào)告序列隨后又可以與剩余的環(huán)形模板結(jié)合引發(fā)新的聚合和尿嘧啶切除反應(yīng)的循環(huán)，最終生成大量的報(bào)告序列。加入信號(hào)探針，其與報(bào)告序列結(jié)合，在核酸內(nèi)切酶ⅳ(endoiv)作用下，對(duì)信號(hào)探針上的四氫呋喃的無嘧啶(tap)位點(diǎn)進(jìn)行循環(huán)切割，最終產(chǎn)生擴(kuò)大的熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)胸腺嘧啶dna糖基化酶活性的定量分析。

其中，本發(fā)明所述線性探針的長(zhǎng)度為32nt，所述線性探針的堿基序列為5’-gaaggcgggcgacagtgcaacgaagaaaaaax-3’，其中t為所述線性探針中的錯(cuò)配堿基胸腺嘧啶；x為2'，3'-二脫氧胞苷，用于抑制非特異性擴(kuò)增；

所述環(huán)形模板dna由線性鎖式探針和連接探針經(jīng)過連接酶連接，外切酶消化，純化后所得；

具體的，所述線性鎖式探針的長(zhǎng)度為57nt，所述線性鎖式探針的堿基序列為5’-p-ctgtcgcgttgcttcgattgctgcgtcccttcccgccctgcccttctcttccgcccg-3’；其中5’端的p為修飾的磷酸基團(tuán)；

所述連接探針的長(zhǎng)度為17nt，所述連接探針的堿基序列為5’-gaaggcgggcgacagcg-3’；

所述信號(hào)探針的長(zhǎng)度為26nt，所述信號(hào)探針的堿基序?yàn)?’-tgctgcgtccct-fam-tcccxccct-bhq1-gccct-3’，其中fam為熒光報(bào)告基團(tuán)，bhq1為熒光淬滅基團(tuán)；x代表四氫呋喃無堿基位點(diǎn)；

優(yōu)選的，所述dna聚合酶為bstdna聚合酶，bstdna聚合酶具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和鏈置換活性，是進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增的良好酶源選擇；

優(yōu)選的，采用熒光分光光度計(jì)對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)分析。

本發(fā)明所述檢測(cè)方法，對(duì)胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)的檢測(cè)下限可達(dá)5.6×10^-7u/μl，所述靈敏度是通過該方法各個(gè)步驟和過程逐漸累積和配合達(dá)到的。

其次，本發(fā)明還提供一種基于循環(huán)酶修復(fù)介導(dǎo)的雙信號(hào)放大策略檢測(cè)胸腺嘧啶dna糖基化酶活性的試劑盒，所述試劑盒包括：雙鏈dna底物，核酸內(nèi)切酶iv(endoiv)、尿嘧啶dna糖基化酶、脫氧腺苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷酸、脫氧胞苷三磷酸、脫氧尿苷三磷酸、dna聚合酶、信號(hào)探針，其中所述雙鏈dna其中一條為環(huán)形模板dna，另一條為線性探針，所述環(huán)形模板dna與線性探針的部分序列雜交形成胸腺嘧啶dna糖基化酶的雙鏈dna底物；雜交區(qū)域內(nèi)線性探針上設(shè)計(jì)有且僅有一個(gè)錯(cuò)配的胸腺嘧啶；

其中，本發(fā)明所述線性探針的長(zhǎng)度為32nt，所述線性探針的堿基序列為5’-gaaggcgggcgacagtgcaacgaagaaaaaax-3’，其中t為所述線性探針中的錯(cuò)配堿基胸腺嘧啶；x為2'，3'-二脫氧胞苷，用于抑制非特異性擴(kuò)增；

所述環(huán)形模板dna由線性鎖式探針和連接探針經(jīng)過連接酶連接，外切酶消化，純化后所得；

具體的，所述線性鎖式探針的長(zhǎng)度為57nt，所述線性鎖式探針的堿基序列為5’-p-ctgtcgcgttgcttcgattgctgcgtcccttcccgccctgcccttctcttccgcccg-3’；其中5’端的p為修飾的磷酸基團(tuán)；

所述連接探針的長(zhǎng)度為17nt，所述連接探針的堿基序列為5’-gaaggcgggcgacagcg-3’；

所述信號(hào)探針的長(zhǎng)度為26nt，所述信號(hào)探針的堿基序?yàn)?’-tgctgcgtccct-fam-tcccxccct-bhq1-gccct-3’，其中fam為熒光報(bào)告基團(tuán)，bhq1為熒光淬滅基團(tuán)；x代表四氫呋喃無堿基位點(diǎn)；

優(yōu)選的，所述dna聚合酶為bstdna聚合酶；

優(yōu)選的，所述試劑盒還包括細(xì)胞裂解緩沖液，所述細(xì)胞裂解緩沖液包括10毫摩爾每升的三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸(tris-hcl)(ph8.0)，150毫摩爾每升的氯化鈉，1％(質(zhì)量/體積)的乙基苯基聚乙二醇(np-40)，0.25毫摩爾每升的脫氧膽酸鈉，1％(質(zhì)量/體積)的甘油，0.1毫摩爾每升的4-(2-氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽；

優(yōu)選的，所述試劑盒還包括所述胸腺嘧啶dna糖基化酶、尿嘧啶dna糖基化酶(udg)、核酸內(nèi)切酶iv和dna聚合酶的緩沖體系；

此外，所述試劑盒在檢測(cè)胸腺嘧啶dna糖基化酶中的用途也是本發(fā)明的目的之一。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種新的設(shè)計(jì)思路用于檢測(cè)胸腺嘧啶dna糖基化酶活性的方法，通過由胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)引發(fā)、酶修復(fù)輔助的循環(huán)滾環(huán)指數(shù)擴(kuò)增和核酸內(nèi)切酶ⅳ(endoiv)催化介導(dǎo)的循環(huán)切割實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)活性的熒光方法；由于尿嘧啶切除輔助的循環(huán)滾環(huán)擴(kuò)增和基于核酸內(nèi)切酶ⅳ(endoiv)的循環(huán)切割效率都很高，且尿嘧啶介導(dǎo)的指數(shù)擴(kuò)增能極大地抑制非特異性擴(kuò)增，因此該方法的檢測(cè)靈敏度很高，經(jīng)檢測(cè)，所述方法對(duì)胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)的檢測(cè)下限可達(dá)5.6×10^-7u/μl；同時(shí)，本發(fā)明利用胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)和尿嘧啶dna糖基化酶(udg)的自身修復(fù)特性，使整個(gè)修復(fù)反應(yīng)嚴(yán)格按照自然修復(fù)機(jī)制進(jìn)行，因此本方案的特異性很高。另外，我們對(duì)本方案中的各反應(yīng)條件也都進(jìn)行了細(xì)致優(yōu)化，因此在修復(fù)反應(yīng)過程中，大大降低了非特異性反應(yīng)。因此，本發(fā)明技術(shù)方案極具推廣應(yīng)用之價(jià)值。

附圖說明

圖1：本發(fā)明基于循環(huán)酶修復(fù)介導(dǎo)的雙信號(hào)放大策略檢測(cè)胸腺嘧啶dna糖基化酶活性的方法原理。

圖2：體外胸腺嘧啶dna糖基化酶介導(dǎo)的堿基切除修復(fù)過程的驗(yàn)證；其中，圖2(a)為反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析，其中泳道m(xù)是dnamarker標(biāo)記；泳道1和2分別代表存在和不存在胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)時(shí)的擴(kuò)增產(chǎn)物；圖2(b)為實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)酶修復(fù)介導(dǎo)的循環(huán)雙信號(hào)放大反應(yīng)，在存在和不存在胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)時(shí)分別得到的曲線圖；其中胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)濃度是0.01單位每微升。

圖3：(a)針對(duì)不同胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)濃度的實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度檢測(cè)；(b)不同胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)濃度下熒光強(qiáng)度的變化；插圖表示熒光強(qiáng)度和胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)濃度對(duì)數(shù)值之間的線性關(guān)系。誤差線代表三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖4：針對(duì)對(duì)照組(反應(yīng)溶液)，0.01克每升牛血清白蛋白(bsa)、0.01單位每微升人類8-羥基脫氧鳥嘌呤-dna糖基化酶(hogg1)和0.01單位每微升胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)條件下熒光強(qiáng)度的變化圖；誤差線表示三組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

具體實(shí)施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說明都是例示性的，旨在對(duì)本申請(qǐng)?zhí)峁┻M(jìn)一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本申請(qǐng)所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請(qǐng)的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。

正如背景技術(shù)所介紹的，現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)檢測(cè)胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)活性的方法普遍存在檢測(cè)靈敏度低、放射性污染、耗時(shí)較長(zhǎng)等缺點(diǎn)。

有鑒于此，本發(fā)明的一個(gè)典型實(shí)施方式中，提供一種基于循環(huán)酶修復(fù)介導(dǎo)的雙信號(hào)放大策略檢測(cè)胸腺嘧啶dna糖基化酶活性的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)待測(cè)胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)誘導(dǎo)的胸腺嘧啶切除修復(fù)：雙鏈dna底物中加入待測(cè)胸腺嘧啶dna糖基化酶、核酸內(nèi)切酶iv(endoiv)、尿嘧啶dna糖基化酶、脫氧腺苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷酸、脫氧胞苷三磷酸、脫氧尿苷三磷酸和dna聚合酶；所述雙鏈dna其中一條為環(huán)形模板dna，另一條為線性探針，所述環(huán)形模板dna與線性探針的部分序列雜交形成胸腺嘧啶dna糖基化酶的雙鏈dna底物；雜交區(qū)域內(nèi)線性探針上設(shè)計(jì)有且僅有一個(gè)錯(cuò)配的胸腺嘧啶；通過胸腺嘧啶dna糖基化酶特異性地切割脫氧核糖和胸腺嘧啶之間的n-糖苷鍵，從而剪切掉線性dna探針上錯(cuò)配的胸腺嘧啶，產(chǎn)生一個(gè)脫堿基(ap)位點(diǎn)；然后核酸內(nèi)切酶ⅳ(endoiv)將對(duì)脫堿基(ap)位點(diǎn)進(jìn)行剪切，從而導(dǎo)致線性探針3’端部分序列的斷裂；

(2)尿嘧啶切除輔助的循環(huán)滾環(huán)擴(kuò)增：在四種核苷酸(脫氧腺苷三磷酸，脫氧鳥苷三磷酸，脫氧胞苷三磷酸和脫氧尿苷三磷酸)和聚合酶存在條件下，被切斷的線性探針作為引物引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生包含尿嘧啶(u)核苷酸的長(zhǎng)片段重復(fù)序列；而后在尿嘧啶dna糖基化酶(udg)和核酸內(nèi)切酶ⅳ(endoiv)協(xié)助下，尿嘧啶被特異性切除，同時(shí)產(chǎn)生一個(gè)帶羥基的3’末端以確保新的聚合延伸的循環(huán)；持續(xù)的聚合和尿嘧啶切除過程導(dǎo)致大量報(bào)告序列的生成；產(chǎn)生的報(bào)告序列隨后與剩余的環(huán)形模板結(jié)合以引發(fā)新一輪的聚合和尿嘧啶切除反應(yīng)循環(huán)，最終生成大量的報(bào)告序列；

(3)核酸內(nèi)切酶ⅳ(endoiv)介導(dǎo)的信號(hào)探針循環(huán)切割以及熒光分子的釋放：加入信號(hào)探針，所述信號(hào)探針為熒光標(biāo)記探針，所述信號(hào)探針上設(shè)計(jì)有且僅有一個(gè)四氫呋喃的無嘧啶(tap)位點(diǎn)，所述信號(hào)探針與報(bào)告序列結(jié)合，引發(fā)核酸內(nèi)切酶ⅳ(endoiv)介導(dǎo)的信號(hào)探針上的四氫呋喃的無嘧啶(tap)位點(diǎn)的循環(huán)切割，最終產(chǎn)生放大的熒光信號(hào)，對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，定量分析胸腺嘧啶dna糖基化酶活性。

其中，本發(fā)明所述線性探針的長(zhǎng)度為32nt，所述線性探針的堿基序列為5’-gaaggcgggcgacagtgcaacgaagaaaaaax-3’，其中t為所述線性探針中的錯(cuò)配堿基胸腺嘧啶；x為2'，3'-二脫氧胞苷，用于抑制非特異性擴(kuò)增；

所述環(huán)形模板dna由線性鎖式探針和連接探針經(jīng)過連接酶連接，外切酶消化，純化后所得；

具體的，所述線性鎖式探針的長(zhǎng)度為57nt，所述線性鎖式探針的堿基序列為5’-p-ctgtcgcgttgcttcgattgctgcgtcccttcccgccctgcccttctcttccgcccg-3’；其中5’端的p為修飾的磷酸基團(tuán)；其中斜體標(biāo)記的序列即為與連接探針的互補(bǔ)結(jié)合序列；

所述連接探針的長(zhǎng)度為17nt，所述連接探針的堿基序列為5’-gaaggcgggcgacagcg-3’；

所述信號(hào)探針的長(zhǎng)度為26nt，所述信號(hào)探針的堿基序?yàn)?’-tgctgcgtccct-fam-tcccxccct-bhq1-gccct-3’，其中fam為熒光報(bào)告基團(tuán)，修飾于距離5’端第13個(gè)堿基(t堿基)上，bhq1為熒光淬滅基團(tuán)，修飾于距離3’端第6個(gè)堿基(t堿基)上；x代表四氫呋喃無堿基位點(diǎn)；

本發(fā)明的又一典型實(shí)施方式中，所述dna聚合酶為bstdna聚合酶，bstdna聚合酶具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和鏈置換活性，是進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增的良好酶源選擇；

本發(fā)明的又一典型實(shí)施方式中，采用熒光分光光度計(jì)對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)分析

本發(fā)明所述檢測(cè)方法，對(duì)胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)的檢測(cè)下限可達(dá)5.6×10^-7u/μl，所述靈敏度是通過該方法各個(gè)步驟和過程逐漸累積和配合達(dá)到的。

本發(fā)明的又一典型實(shí)施方式中，提供一種基于循環(huán)酶修復(fù)介導(dǎo)的雙信號(hào)放大策略檢測(cè)胸腺嘧啶dna糖基化酶活性的試劑盒，所述試劑盒包括：雙鏈dna底物，核酸內(nèi)切酶iv(endoiv)、尿嘧啶dna糖基化酶、脫氧腺苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷酸、脫氧胞苷三磷酸、脫氧尿苷三磷酸、dna聚合酶、信號(hào)探針，其中所述雙鏈dna其中一條為環(huán)形模板dna，另一條為線性探針，所述環(huán)形模板dna與線性探針的部分序列雜交形成胸腺嘧啶dna糖基化酶的雙鏈dna底物；雜交區(qū)域內(nèi)線性探針上設(shè)計(jì)有且僅有一個(gè)錯(cuò)配的胸腺嘧啶；

其中，本發(fā)明所述線性探針的長(zhǎng)度為32nt，所述線性探針的堿基序列為5’-gaaggcgggcgacagtgcaacgaagaaaaaax-3’，其中t為所述線性探針中的錯(cuò)配堿基胸腺嘧啶；x為2'，3'-二脫氧胞苷，用于抑制非特異性擴(kuò)增；

所述環(huán)形模板dna由線性鎖式探針和連接探針經(jīng)過連接酶連接，外切酶消化，純化后所得；

具體的，所述線性鎖式探針的長(zhǎng)度為57nt，所述線性鎖式探針的堿基序列為5’-p-ctgtcgcgttgcttcgattgctgcgtcccttcccgccctgcccttctcttccgcccg-3’；其中5’端的p為修飾的磷酸基團(tuán)；其中斜體標(biāo)記的序列即為與連接探針的互補(bǔ)結(jié)合序列；

所述連接探針的長(zhǎng)度為17nt，所述連接探針的堿基序列為5’-gaaggcgggcgacagcg-3’；

所述信號(hào)探針的長(zhǎng)度為26nt，所述信號(hào)探針的堿基序?yàn)?’-tgctgcgtccct-fam-tcccxccct-bhq1-gccct-3’，其中fam為熒光報(bào)告基團(tuán)，修飾于距離5’端第13個(gè)堿基(t堿基)上，bhq1為熒光淬滅基團(tuán)，修飾于距離3’端第6個(gè)堿基(t堿基)上；x代表四氫呋喃無堿基位點(diǎn)；

所述試劑盒還包括細(xì)胞裂解緩沖液，所述細(xì)胞裂解緩沖液包括10毫摩爾每升的三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸(tris-hcl)(ph8.0)，150毫摩爾每升的氯化鈉，1％(質(zhì)量/體積)的乙基苯基聚乙二醇(np-40)，0.25毫摩爾每升的脫氧膽酸鈉，1％(質(zhì)量/體積)的甘油，0.1毫摩爾每升的4-(2-氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽；

所述試劑盒還包括所述胸腺嘧啶dna糖基化酶、尿嘧啶dna糖基化酶(udg)、核酸內(nèi)切酶iv和dna聚合酶的緩沖體系；

本發(fā)明的又一典型實(shí)施方式中，提供所述試劑盒在檢測(cè)胸腺嘧啶dna糖基化酶中的應(yīng)用。

下面結(jié)合實(shí)施例做進(jìn)一步具體說明。

實(shí)施例1

環(huán)形模板dna的制備：將連接探針和線性鎖式探針用1×三(羥甲基)氨基甲烷-乙二胺四乙酸(tris-edta)緩沖液稀釋至10微摩爾每升，并在95攝氏度變性5分鐘。然后分別將2微升的連接探針和線性鎖式探針加入到20微升的連接緩沖液中，包括1×t4連接酶緩沖液(6.6毫摩爾每升的氯化鎂，10毫摩爾每升的二硫蘇糖醇，0.1毫摩爾每升的三磷酸腺苷，66毫摩爾每升的三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸(tris-hcl)(ph7.6))，50個(gè)單位的t4dna連接酶，在16攝氏度溫育過夜。連接反應(yīng)后，將10微升的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到10微升的消化緩沖液中，包括1毫摩爾每升的二硫蘇糖醇，6.7毫摩爾每升的氯化鎂，67毫摩爾每升的甘氨酸-氫氧化鉀(ph9.5)，10個(gè)單位的核酸外切酶i和20個(gè)單位的核酸外切酶iii，在37攝氏度溫育2小時(shí)，然后在95攝氏度滅活10分鐘，所得的消化產(chǎn)物通過來自大連寶生物公司(takarabiotechnologyco.，ltd.(dalian，china))的試劑盒(dr.gentleprecipitationcarrier9094)進(jìn)行進(jìn)一步的純化即得。

實(shí)施例2

細(xì)胞裂解緩沖液準(zhǔn)備：10毫摩爾每升的三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸(tris-hcl)(ph8.0)，150毫摩爾每升的氯化鈉，1％(質(zhì)量/體積)的乙基苯基聚乙二醇(np-40)，0.25毫摩爾每升的脫氧膽酸鈉，1％(質(zhì)量/體積)的甘油，0.1毫摩爾每升的4-(2-氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽。

細(xì)胞提取物準(zhǔn)備：人類子宮頸癌細(xì)胞(hela)和人類乳腺癌細(xì)胞(mcf-7)培養(yǎng)基為含有10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素-鏈霉素的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(dmem)，放在含有5％二氧化碳，37攝氏度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用胰酶將其消化下來，并用冰磷酸鹽緩沖液(137毫摩爾氯化鈉溶液，2.7毫摩爾氯化鉀溶液，10毫摩爾磷酸鹽緩沖液，ph7.4)洗滌兩遍，然后4攝氏度、800轉(zhuǎn)每分鐘離心。使細(xì)胞懸浮在100微升的裂解緩沖液中、于冰上裂解30分鐘并且每隔5分鐘渦旋30秒，裂解后細(xì)胞碎片在4攝氏度以12000轉(zhuǎn)每分鐘離心20分鐘。最后將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，并立即進(jìn)行胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)活性的測(cè)定。

酶修復(fù)介導(dǎo)的循環(huán)雙信號(hào)放大反應(yīng)：胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)實(shí)驗(yàn)涉及兩個(gè)連續(xù)的步驟。第一步先將線性探針稀釋到100納摩爾，隨后將2微升線性探針加到20微升切除緩沖液中，包含1×neb緩沖液4(nebuffer4)，50納摩爾的環(huán)形模板dna和2個(gè)單位胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)，將混合溶液在60攝氏度孵育50分鐘。第二步，將2微升切除產(chǎn)物加到50微升擴(kuò)增反應(yīng)混合物中，包含500微摩爾的脫氧核糖核苷酸(脫氧腺苷三磷酸,脫氧尿苷三磷酸,脫氧鳥苷三磷酸,脫氧胞苷三磷酸)，5個(gè)單位的bstdna聚合酶，10個(gè)單位尿嘧啶dna糖基化酶(udg)，20個(gè)單位內(nèi)切酶ⅳ(大腸桿菌核酸內(nèi)切酶iv)，5微升10×thermopol緩沖液，5微升10×尿嘧啶dna糖基化酶(udg)緩沖液，5微升10×neb緩沖液3(nebuffer3)，900納摩爾信號(hào)探針，將混合物在37攝氏度孵育50分鐘。

熒光光譜測(cè)量：將25微升的反應(yīng)產(chǎn)物用滅菌水稀釋至60微升，用熒光分光光度計(jì)在室溫下進(jìn)行熒光光譜的測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)原理(如圖1)：

本方案方案主要涉及三個(gè)步驟：(1)胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)誘導(dǎo)的胸腺嘧啶切除修復(fù)反應(yīng)，(2)尿嘧啶切除輔助的循環(huán)滾環(huán)擴(kuò)增過程，(3)核酸內(nèi)切酶ⅳ(endoiv)介導(dǎo)的信號(hào)探針的循環(huán)切割及熒光分子的釋放。首先，線性探針的部分序列與環(huán)形模板雜交形成胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)的dna底物。當(dāng)胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)存在時(shí)，切割脫氧核糖和胸腺嘧啶之間的n-糖苷鍵以特異性切除線性探針上錯(cuò)配的胸腺嘧啶，并同時(shí)產(chǎn)生一個(gè)脫堿基(ap)位點(diǎn)。核酸內(nèi)切酶ⅳ(endoiv)對(duì)該脫堿基(ap)位點(diǎn)進(jìn)行催化剪切，最終導(dǎo)致線性探針3’端序列的斷裂。在四種核苷酸(脫氧腺苷三磷酸，脫氧鳥苷三磷酸，脫氧胞苷三磷酸和脫氧尿苷三磷酸)和聚合酶存在條件下，被切斷的線性探針將作為引物引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生包含尿嘧啶(u)核苷酸的長(zhǎng)片段重復(fù)序列。在尿嘧啶dna糖基化酶(udg)和核酸內(nèi)切酶ⅳ(endoiv)協(xié)助下，尿嘧啶被特異性切除，同時(shí)產(chǎn)生一個(gè)帶羥基的3’末端以確保新的聚合延伸的循環(huán)。持續(xù)的聚合和尿嘧啶切除反應(yīng)將導(dǎo)致大量報(bào)告序列的生成。該報(bào)告序列與剩余的環(huán)形模板結(jié)合引發(fā)新的聚合和尿嘧啶切除反應(yīng)的循環(huán)，最終生成大量的報(bào)告序列。加入信號(hào)探針，其與報(bào)告序列雜交，引發(fā)核酸內(nèi)切酶ⅳ(endoiv)介導(dǎo)的信號(hào)探針上的四氫呋喃的無嘧啶(tap)位點(diǎn)的循環(huán)切割，最終產(chǎn)生放大的熒光信號(hào)。

實(shí)施例3

3.1原理的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

為了驗(yàn)證本方案的可行性，我們對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行了檢測(cè)分析，用以sybrgold作為指示劑的1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證分析。從圖2(a)可看出，有胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)時(shí)，可以看到反應(yīng)產(chǎn)物的特征條帶，不加胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)時(shí)，沒有特征條帶出現(xiàn)。這是因?yàn)樾叵汆奏na糖基化酶(tdg)能夠?qū)㈠e(cuò)配的胸腺嘧啶切除，并且啟動(dòng)隨后的尿嘧啶切除介導(dǎo)的循環(huán)滾環(huán)指數(shù)擴(kuò)增。為了證明酶修復(fù)介導(dǎo)的雙信號(hào)放大反應(yīng)，我們加入信號(hào)探針后實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)反應(yīng)過程。如圖2(b)所示，在胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)存在時(shí)，反應(yīng)前10分鐘熒光強(qiáng)度快速增加，超過10分鐘后到達(dá)了平臺(tái)期，展示出典型的雙曲線(黑色曲線)。結(jié)果表明胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)能夠特異性地從鳥嘌呤/胸腺嘧啶錯(cuò)配堿基對(duì)上切下胸腺嘧啶從而引起修復(fù)酶輔助的雙重?cái)U(kuò)增反應(yīng)。相反，在胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)不存在時(shí)，幾乎沒有熒光信號(hào)出現(xiàn)(灰色曲線)；這是因?yàn)椋?1)尿嘧啶能夠被尿嘧啶dna糖基化酶(udg)引發(fā)的堿基切除修復(fù)精確地切除；(2)尿嘧啶核苷酸能夠取代傳統(tǒng)的限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列而避免無模板時(shí)雙鏈dna的錯(cuò)配延伸，并且能避免由錯(cuò)配形成的非特異性擴(kuò)增。因此，以上的結(jié)果明確證實(shí)了本方案的可行性。

3.2靈敏度實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)通過監(jiān)測(cè)不同濃度下胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)熒光強(qiáng)度的變化來檢測(cè)靈敏度，圖3(a)展示的是不同濃度胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)的實(shí)時(shí)熒光曲線。在胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)濃度增加時(shí)，熒光強(qiáng)度隨著逐漸上升并在20分鐘內(nèi)達(dá)到平臺(tái)期。這結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增效率很高，并且可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大大增強(qiáng)的熒光信號(hào)。正如圖3(b)所示，胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)濃度從1×10^-6單位每微升到1×10^-3單位每微升，熒光強(qiáng)度持續(xù)增加并且和胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)濃度的對(duì)數(shù)值線性相關(guān)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差超過對(duì)照信號(hào)3倍的準(zhǔn)則，計(jì)算出檢測(cè)限是5.6×10^-7單位每微升。檢測(cè)限如此之低，說明本方法具有很高的檢測(cè)靈敏度。

3.3特異性實(shí)驗(yàn)

如圖4所示，牛血清白蛋白(bsa)和人類8-羥基脫氧鳥嘌呤-dna糖基化酶(hogg1)被用作本實(shí)驗(yàn)的干擾物質(zhì)。牛血清白蛋白(bsa)是一個(gè)與本實(shí)驗(yàn)不相關(guān)的蛋白，人類8-羥基脫氧鳥嘌呤-dna糖基化酶(hogg1)是對(duì)8-羥基脫氧鳥嘌呤存在特異性的糖基化酶，可以通過堿基切除修復(fù)過程來修復(fù)氧化的鳥嘌呤。在同一條件下，在牛血清白蛋白(bsa)和人類8-羥基脫氧鳥嘌呤-dna糖基化酶(hogg1)存在時(shí)只有很低的背景，這和只有反應(yīng)溶液的對(duì)照組很相似。相反，在胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)存在時(shí)，熒光信號(hào)值非常高，結(jié)果表明牛血清白蛋白(bsa)和人類8-羥基脫氧鳥嘌呤-dna糖基化酶(hogg1)都不能切割錯(cuò)配的胸腺嘧啶并引發(fā)酶修復(fù)介導(dǎo)的雙信號(hào)放大，不會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)。因此，本實(shí)驗(yàn)方法有很高的特異性，為在復(fù)雜樣品中進(jìn)行檢測(cè)提供了可能。

以上所述僅為本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本申請(qǐng)，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本申請(qǐng)可以有各種更改和變化。凡在本申請(qǐng)的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。