本發(fā)明屬分子病理診斷領(lǐng)域，具體涉及一種焦磷酸測序法聯(lián)合擴增阻滯技術(shù)檢測kras基因12和13密碼子低頻突變試劑盒和檢測方法。

背景技術(shù)：

kras基因是公認(rèn)的癌基因，參與egfr信號的傳導(dǎo)過程。早在2008年6月在美國腫瘤學(xué)會(asco)年會上發(fā)布了臨床研究結(jié)果，即kras基因突變型患者并不能從抗egfr治療中獲益，反而徒增不良反應(yīng)危險和治療費用；而kras野生型患者更可以從這類藥物治療中獲益。同年10月，kras基因突變檢測被寫入最新版(2008年第三版)《美國國立癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(nccn)結(jié)直腸癌臨床實踐指南》。該指南明確指出兩點，一是所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者應(yīng)檢測kras基因狀態(tài)，二是只有kras野生型患者才建議接受egfr抑制劑(如西妥昔單抗和帕尼單抗)治療。另外，《09年nccn非小細胞肺癌臨床實踐指南》明確指出：當(dāng)kras基因如果發(fā)生了突變，則不建議病人使用特羅凱/易瑞沙等進行分子靶向治療。

目前，測序方法仍然是檢測核酸序列突變的金標(biāo)準(zhǔn)，但是該方法對于所取樣本中的腫瘤細胞的比例要求較高，一般大于50％，并且突變率低于20％的核苷酸突變，不能有效檢測和判讀，因此會造成假陰性。相比于測序技術(shù)，其它分子生物學(xué)檢測方法，如熒光定量pcr，高效液相色譜技術(shù)等，存在結(jié)果不能準(zhǔn)確定量等問題，因此會導(dǎo)致假陽性或假陰性。

pyrosequencing(焦磷酸測序)技術(shù)是新一代dna序列分析技術(shù)，被廣泛用于基因型分析領(lǐng)域。該技術(shù)無須進行電泳，dna片段也無須特殊的熒光標(biāo)記，操作極為簡便。pyrosequencing技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測序反應(yīng)中，只加入一種dntp，若該dntp與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(ppi)。ppi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號，并由pyrogramtm轉(zhuǎn)化為一個峰值。每個峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種dntp，繼續(xù)dna鏈的合成。相比傳統(tǒng)測序技術(shù)和熒光定量pcr檢測方法，降低了樣本取材的要求(只需較少的腫瘤組織，低腫瘤細胞含量仍可檢測)，具有更高的靈敏度，可定量檢測低至1～5％的突變，準(zhǔn)確性高，更適合于高通量分析，結(jié)果直觀，判讀更加簡單、準(zhǔn)確、快速，具有無可比擬的優(yōu)勢。但是針對臨床上一些特殊標(biāo)本，如血漿、胸腹水等來源的標(biāo)本，5％的檢測靈敏度遠遠不夠。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種焦磷酸測序聯(lián)合阻滯技術(shù)檢測kras基因12和13密碼子低頻突變引物。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是一種焦磷酸測序聯(lián)合阻滯技術(shù)檢測kras基因12和13密碼子低頻突變試劑盒。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述試劑盒的檢測方法。

本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是焦磷酸測序聯(lián)合阻滯技術(shù)檢測kras基因12和13密碼子低頻突變引物在檢測kras基因12和13密碼子低頻突變中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種焦磷酸測序聯(lián)合擴增阻滯技術(shù)檢測kras基因12和13密碼子低頻突變引物，其特征在于，包括seqidno.：1～2所示的擴增引物、seqidno：3所示測序引物、seqidno：4所示擴增阻滯引物；

其中，seqidno：2其5’端標(biāo)記生物素；seqidno：4其3’端磷酸化處理；

以上核酸序列在一次檢測中共同使用，其中，seqidno.：1～2所示的擴增引物用于擴增kras基因12和13密碼子。

本發(fā)明中，通過引入擴增阻滯引物，降低了野生型序列的擴增，相對增加了突變基因型的擴增，結(jié)合焦磷酸測序技術(shù)大大提高了檢出靈敏度。相比于現(xiàn)在臨床上普遍采用的arms檢測kras基因12、13密碼子突變的方法(1％靈敏度)，檢測靈敏度提高至0.1％，提高了臨床標(biāo)本的陽性檢出率，可以為更多的患者提供了準(zhǔn)確的用藥參考。

一種焦磷酸測序聯(lián)合擴增阻滯技術(shù)檢測kras基因12和13密碼子低頻突變試劑盒，它包括如下試劑：

(1)dna提取試劑；

(2)pcr反應(yīng)試劑：pcr緩沖液，引物seqidno：1～4，2mmmgcl2，0.2mmdntps，2u/μltaqdna聚合酶；

(3)單鏈純化試劑：75％(v/v)乙醇溶液，0.2mnaoh，10mmph7.6三(羥甲基)氨基甲烷醋酸鹽溶液，結(jié)合緩沖液，退火緩沖液；

(4)測序試劑：dna聚合酶，atp硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物aps，熒光素和dntp。

其中，所述pcr緩沖液包括：0.1％(v/v)np-40，0.02％(v/v)明膠，0.06％(w/v)g/mlbsa，0.1％(v/v)tween-20，0.06mph8.9tricine。

其中，所述結(jié)合緩沖液包括：10mmtris-hcl，2mnacl，1mmedta，0.1％(v/v)tween-20；所述退火緩沖液包括：20mmph7.6tris-acetate，2mm醋酸鎂。

一種焦磷酸測序聯(lián)合擴增阻滯技術(shù)檢測kras基因12和13密碼子低頻突變的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提取石蠟活檢標(biāo)本組織中的基因組dna；

(2)以步驟(1)中所得基因組dna為模板，pcr擴增包含kras基因12和13密碼子核酸序列片段；

(3)將步驟(2)得到的pcr擴增產(chǎn)物與親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合進行單鏈純化；

(4)將步驟(3)得到的單鏈純化產(chǎn)物進行焦磷酸測序；

(5)測序得到snp突變頻率。

步驟(2)中，

pcr擴增的體系為：10×pcr緩沖液5μl，seqidno：10.5μl，seqidno：20.5μl，seqidno：45ul，模板dna3μl，0.2mμdntps，2mmmgcl2，taqdna聚合酶2u，加無菌水補足至50μl；

pcr擴增條件為：94℃5min；50個循環(huán)，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min，16℃終止反應(yīng)。

上述焦磷酸測序聯(lián)合擴增阻滯技術(shù)檢測kras基因12和13密碼子低頻突變引物在檢測kras基因12和13密碼子低頻突變中的應(yīng)用在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

本發(fā)明設(shè)計了包含kras基因12、13密碼子的引物，聯(lián)合擴增阻滯技術(shù)和焦磷酸測序技術(shù)，進行kras基因12、13密碼子低頻突變的方法和試劑盒。該方法可快速準(zhǔn)確的檢測低至0.1％的突變。其重要意義在于：(1)指導(dǎo)肺癌患者有針對性用藥，避免無效用藥；(2)改善預(yù)后；(3)避免獲得耐藥；(4)降低對樣本組織的取材要求；(5)減少醫(yī)療費用。

有益效果：本發(fā)明的焦磷酸測序聯(lián)合阻滯技術(shù)檢測kras基因12和13密碼子低頻突變的方法和試劑盒，可以準(zhǔn)確檢測kras基因12和13密碼子低頻突變。本發(fā)明方法操作簡單，敏感性高，降低了樣本取材要求，結(jié)果易于判讀，大大降低了檢測結(jié)果的假陽性或者假陰性率，為患者避免無效靶向藥物的使用，節(jié)省寶貴的治療時間。

附圖說明

圖1為1例石蠟組織標(biāo)本經(jīng)該方法和試劑盒檢測后，未發(fā)現(xiàn)突變。

圖2為突變頻率為0.2％的標(biāo)準(zhǔn)品(12密碼子ggt>gat)，經(jīng)本方法檢測后，突變頻率變?yōu)?.5％

圖3為突變頻率為2％的標(biāo)準(zhǔn)品(12密碼子ggt>gat)，經(jīng)本方法檢測后，突變頻率變?yōu)?1.1％。

圖4為突變頻率為10％的標(biāo)準(zhǔn)品(12密碼子ggt>gat)，經(jīng)本方法檢測后，突變頻率變?yōu)?5.5％。

具體實施方式

根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。

實施例1：試劑。

(1)dna提取試劑：

購自qiagen公司。

(2)反應(yīng)液：

pcrbuffer：購自美國fermentas公司；

引物seqidno：1～4，由上海英俊生物科技有限公司合成；

mgcl2：購自美國fermentas公司；

0.2mmdntps：購自美國fermentas公司；

2u/μltaqdna聚合酶：購自美國fermentas公司。

(3)單鏈純化試劑：

75％(v/v)乙醇溶液：購于杭州長征化學(xué)試劑有限公司；

0.2mnaoh：購于上海試四赫維化工有限公司；

10mmtris-acetate(ph7.6)：tris-base購于美國sigma公司，無水乙酸購于杭州化學(xué)試劑有限公司；

結(jié)合緩沖液：由10mmtris-hcl(tris-base購于美國sigma公司，鹽酸購于杭州化學(xué)試劑有限公司),2mnacl(購于上海試四赫維化工有限公司)，1mmedta(購于杭州化學(xué)試劑有限公司)，0.1％(v/v)tween20(購于美國sigma公司)組成；

退火緩沖液：由20mmtris-acetate(ph7.6)(tris-base購于美國sigma公司，無水乙酸購于杭州化學(xué)試劑有限公司)，2mm醋酸鎂(購于上海試四赫維化工有限公司)組成；

親和素標(biāo)記的磁珠(購于gehealthcarebioscienceab)。

(4)測序試劑：

dna聚合酶、atp硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶：購于qiagen公司；

底物aps和熒光素：購于qiagen公司；

四種dntp(datps，dttp，dctp，dgtp)：購于qiagen公司。

實施例2：檢測方法。

儀器：bio-rads1000pcr儀，beckmanmicrofuge22r臺式微量冷凍離心機，北京六一瓊脂糖凝膠電泳儀、上海培清凝膠成像系統(tǒng)，qiagenpyromarkq96id測序儀。

(1)提取石蠟標(biāo)本組織dna，具體步驟如下：將石蠟標(biāo)本置于二甲苯中，去除石蠟；加入裂解緩沖液和蛋白酶k，在變性條件下消化組織，裂解細胞；置于90℃孵育，逆轉(zhuǎn)福爾馬林交聯(lián)；將裂解液通過硅膠膜使dna吸附到硅膠膜上，加入漂洗液洗滌雜質(zhì)，最后將高純、濃縮的dna從硅膠膜上洗脫，得到基因組dna收集液。

(2)以步驟(1)所得dna為模板，利用kras基因12/13密碼子特異性引物進行pcr擴增；其中，所述的pcr擴增體系為：10×pcrbuffer5μl，seqidno：10.5μl，seqidno：20.5μl，seqidno：45ul，templatedna3μl，0.2mμdntps，2mmmgcl2，taqdna聚合酶2u，加無菌水補足至50μl；pcr擴增條件為：94℃5min；50個循環(huán)，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min，16℃終止反應(yīng)。(3)將步驟(2)得到的pcr擴增產(chǎn)物與親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合進行單鏈純化：

(a)在使用前，保證所有溶液都達到室溫；

(b)在psq96板中加入45μlannealingbuffer，然后每孔加入seqidno：3測序引物(10um)1ul；

(c)使用vertex混勻sepharosebeads,將需要使用的sepharoebeads總量(每樣本3μl)轉(zhuǎn)移到一個eppendorf管中，在sepharosebead中加入bindingbuffer，使得平均每個樣品約有50μl的體積，將混合物混勻；

(d)將以上混合物加入pcr產(chǎn)物(50μl反應(yīng)體積)中，每樣本50μl，將pcr產(chǎn)物在常溫下混勻10分鐘，使得beads與生物素結(jié)合；

(e)在vacuumprepworkstation中，四個樣品板中依次加入180ml高純水、70％乙醇、washingbuffer和120mldenaturationbuffer；

(f)打開vacuumprepworkstation的泵，將vacuumpreptool在高純水中清洗30秒,然后將vacuumpreptool移到pcr板中，抓取sepharosebeads，將vacuumpreptool放入70％乙醇中5秒，然后移到denatureationbuffer中5秒，再移到washingbuffer中清洗10秒，把吸頭放在相應(yīng)含有測序引物的板孔的上方，不要接觸液面，關(guān)掉泵，將vacuumpreptool放入含有測序引物的板中，搖動，釋放sepharosebeads；

(g)使用高純水清洗vacuumpreptool。

將放有樣品的psq96板放在thermoplate上加熱到80℃2分鐘，再冷卻到室溫后放入測序儀中。

(4)將步驟(3)得到的單鏈純化產(chǎn)物進行焦磷酸測序；

(5)讀取測序結(jié)果。

將本發(fā)明方法用于1例臨床石蠟組織標(biāo)本的檢測，測序結(jié)果如圖1所示。

sequencelisting

<110>杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司

<120>焦磷酸測序聯(lián)合擴增阻滯技術(shù)檢測kras基因12和13密碼子低頻突變引物及其

應(yīng)用

<130>sg20151208001

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<223>kras基因12/13密碼子上游引物

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<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴增kras基因12和13密碼子的下游引物

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tcatattcgtccacaaaatgattc24

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<211>19

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>測序引物

<400>3

acttgtggtagttggagct19

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴增阻滯引物

<400>4

gagctggtggcgtaggca18