Dhplc檢測并定量線粒體dna1555a>g的異質(zhì)性突變的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了DHPLC檢測并定量線粒體DNA1555A>G的異質(zhì)性突變，包括提取樣本、引物設(shè)計、PCR反應(yīng)及DHPLC檢測等步驟，其中目的片段長度為339bp，DHPLC檢測柱溫為59.5℃。本發(fā)明不僅能檢測出突變型和野生型個體，還能準確檢測到低水平或高水平的異質(zhì)性突變個體，并能精確定量其突變負荷，從而可以較好地解釋臨床表型多樣化的原因，有助于進一步研究線粒體耳聾的分子遺傳學(xué)機制，本發(fā)明的最低檢測水平可達到5%，靈敏度較高。
【專利說明】DHPLC檢測并定量線粒體DNA1555A>G的異質(zhì)性突變
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及DNA檢測領(lǐng)域，尤其涉及檢測線粒體DNA 1555AG突變及其定量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人類線粒體DNA(mitochondrial DNA, mt DNA)是唯一分布于細胞核外的人類遺傳物質(zhì)，又被稱為人類的第25號染色體，呈雙鏈環(huán)狀。1981年Anderson完成了人類整個線粒體DNA 16569bp的測序工作，并將線粒體DNA分成編碼區(qū)和控制區(qū)。線粒體基因組的遺傳特點是母系遺傳與異質(zhì)性(heteroplasmy)。即在同一個體中會出現(xiàn)兩種或兩種以上類型的mtDNA，突變型線粒體DNA占全體線粒體DNA的百分比稱為突變負荷，異質(zhì)性線粒體DNA的突變負荷可以 介于0到100%之間，線粒體DNA疾病的發(fā)生及其臨床表型往往取決于突變負荷的高低，當線粒體DNA突變體的突變負荷較低時，共存的野生型線粒體DNA會發(fā)揮保護和補償作用；然而，當突變水平超過一定的閾值，野生型線粒體DNA不能補償同時存在的突變DNA所產(chǎn)生的缺陷，不足以維持正常功能時，組織或器官就會出現(xiàn)功能異常。
[0003]1993 年，Prezant TR 等首次發(fā)現(xiàn)線粒體 DNA (mitochondrial DNA, mtDNA) 12SrRNA基因的1555A>G突變與氨基糖甙類藥物性耳聾有關(guān)，且研究報道大都為同質(zhì)性突變。由于線粒體DNA 1555A>G突變致聾的不同家系或同一家系的不同成員在臨床表型及外顯率方面顯示出較大差異，主要表現(xiàn)在氨基糖甙類藥物致聾影響程度多樣化、發(fā)病年齡多樣化、表現(xiàn)度多樣化、不同種族不同地域間發(fā)生率多樣化等方面。而同質(zhì)性的mtDNA1555A>G突變始終無法從分子水平上給予臨床表型多樣化的分子基礎(chǔ)一個合適的解釋。該部位突變是否存在異質(zhì)性？其異質(zhì)性水平是否與臨床表型之間存在著一定的關(guān)系？目前傳統(tǒng)檢測技術(shù)在檢測mtDNA1555A>G異質(zhì)性上有一定的局限性，常采用PCR-RFLP和直接測序法對mtDNA1555A>G的異質(zhì)性進行檢測，但這些方法只能檢測到高于20%的突變異質(zhì)性水平，從而導(dǎo)致低水平的異質(zhì)性突變無法被檢出，而被認為是同質(zhì)性突變或是同質(zhì)性野生型，檢測靈敏度不高，從而也無法解釋臨床表型多樣化的原因。因而探索一種檢測線粒體DNA1555A>G異質(zhì)性突變及定量分析的方法顯得十分重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種簡單、準確且快速靈敏的運用DHPLC方法對線粒體DNA1555A>G的異質(zhì)性突變進行檢測及定量的方法，靈敏度高，且操作方便。
[0005]為達到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:
DHPLC檢測并定量線粒體DNA 1555A>G的異質(zhì)性突變，包括如下步驟:
1)提取線粒體DNA；
2)引物設(shè)計，根據(jù)DHPLC方法的原理及檢測要求，應(yīng)用在線引物設(shè)計工具進行引物設(shè)
計；
3 )確定PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，采用優(yōu)化好的引物及PCR體系對線粒體DNA 1555A>G進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物；
4)用DHPLC方法對PCR產(chǎn)物進行異質(zhì)性突變的檢測:
將PCR反應(yīng)的產(chǎn)物在PCR儀中95 °C變性5min，然后以1°C /min的速度緩慢降溫至25 0C，以充分形成異源性DNA雙鏈；
然后采用DHPLC分析儀分析，每次自動進樣8 ii L，采用流動相A液(0.lmmol/L TEAA,0.025%乙腈)和B液(0.lmmol/L TEAA，25%乙腈)將樣本從分離柱中洗脫，檢測柱溫為59.5°C，洗脫液流速為0.9mL/min，洗脫曲線由紫外檢測器檢測獲得，紫外檢測器在260nm波長處收集信號。 [0006]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，步驟2)的引物設(shè)計含以下序列:
正向序列:5’ gctcagcctatataccgccatcttcagcaa3> ；
反向序列:5’ ITTCCAGTACACTTACCATGTTACGACTTG3’。
[0007]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，步驟2)的引物設(shè)計中，目的片段長度為339bp，且變異位點靠近下游引物的3’端。
[0008]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，步驟3)的PCR反應(yīng)體系為:50iiL反應(yīng)體系，含IOOng 模板 DNA, 10 U mol/L 上、下游引物各 IyL, 10mmol /T, dNTP IuL, 2SmmoI /I, Mg2+3u L, IOXBuffer 5 U L, 5U/ U L Taq DNA 聚合酶 3yL。
[0009]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，步驟3)的PCR的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min ；94°C lmin,60°C lmin,72°C lmin，35 個循環(huán)；72°C延伸 7min。
[0010]由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果為:
與PCR-RFLP和直接測序法相比，本發(fā)明不僅能檢測出突變型和野生型個體，還能準確檢測到低水平或高水平的異質(zhì)性突變個體，并能精確定量其突變負荷，從而可以較好地解釋臨床表型多樣化的原因，有助于進一步研究線粒體耳聾的分子遺傳學(xué)機制，本發(fā)明的最低檢測水平可達到5%，靈敏度較高。
[0011]本發(fā)明的檢測成本低廉，解決了檢測準確度和檢測成本間的矛盾，可以較好地應(yīng)用在臨床檢測和產(chǎn)前診斷等方面。本發(fā)明步驟簡單，可快速準備地對mtDNA 1555A>G異質(zhì)性突變進行檢測并定量，檢測結(jié)果穩(wěn)定，可以作為一種常規(guī)的檢測mtDNA 1555A>G的試驗方法，還可以通過優(yōu)化PCR擴增條件和DHPLC程序，以實現(xiàn)對其它位點突變進行檢測和定量分析，對其它線粒體異質(zhì)性點突變和疾病的臨床關(guān)系的研究有重要意義。
[0012]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1為標準品DNA 1555A>G異質(zhì)性突變的DHPLC檢測圖譜；
圖2為標準品DNA 1555A>G突變負荷的實際值和檢測值的線性關(guān)系；
圖3為部分樣品的酶切圖；
圖4為部分樣品的直接測序法檢測的圖譜及DHPLC檢測圖譜，其中箭頭所示位置為1555位點。
[0013]【具體實施方式】:
一、方法的建立 (I)引物設(shè)計
根據(jù)DHPLC方法的原理及檢測要求，應(yīng)用NCBI在線引物設(shè)計工具Primer-BLAST進行引物設(shè)計，序列如下:
【權(quán)利要求】
1.DHPLC檢測并定量線粒體DNA 1555A>G的異質(zhì)性突變，其特征在于包括如下步驟: 1)提取線粒體DNA樣本； 2)引物設(shè)計，根據(jù)DHPLC方法的原理及檢測要求，應(yīng)用在線引物設(shè)計工具進行引物設(shè)計； 3)確定PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，采用優(yōu)化好的引物及PCR體系對線粒體DNA 1555A>G進行PCR擴增，得到PCR反應(yīng)的產(chǎn)物； 4)用DHPLC方法對PCR反應(yīng)的產(chǎn)物進行異質(zhì)性突變的檢測: 將PCR反應(yīng)的產(chǎn)物在PCR儀中95°C變性5min，然后以1°C /min的速度緩慢降溫至25 0C，以充分形成異源性DNA雙鏈； 然后采用DHPLC分析儀分析，每次自動進樣8 iiL，采用流動相A液(0.lmmol/L TEAA，0.025%乙腈)和B液(0.lmmol/L TEAA，25%乙腈)將前述樣本從分離柱中洗脫，檢測柱溫為59.5°C，洗脫液流速為 0.9mL/min，洗脫曲線由紫外檢測器檢測獲得，紫外檢測器在260nm波長處收集信號。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DHPLC檢測并定量線粒體DNA1555A>G的異質(zhì)性突變，其特征在于:所述步驟2)的引物設(shè)計含以下序列:
正向序列:5’ gctcagcctatataccgccatcttcagcaa3> ；
反向序列:5’ ITTCCAGTACACTTACCATGTTACGACTTG3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的DHPLC檢測并定量線粒體DNA1555A>G的異質(zhì)性突變，其特征在于:所述步驟2)的引物設(shè)計中，目的片段長度為339bp，且變異位點靠近下游引物的3’端。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DHPLC檢測并定量線粒體DNA1555A>G的異質(zhì)性突變，其特征在于: 所述步驟3)的PCR反應(yīng)體系為:50 ii L反應(yīng)體系，含IOOng模板DNA，10 y mol/L上、下游引物各 I U L，10mmol/L dNTP I u L,25mmol/L Mg2+ 3 u L, IOXBuffer 5 u L, 5U/ u L TaqDNA聚合酶3 ii L ; 所述步驟3)的PCR的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min ;94°C lmin,60°C lmin，72°Clmin, 35 個循環(huán)；72°C延伸 7min。
【文檔編號】C12Q1/68GK103436604SQ201310302286
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月18日
【發(fā)明者】王沙燕, 沈姍姍, 王琳凱 申請人:深圳市人民醫(yī)院