專利名稱:C<sub>60</sub>的多羥基衍生物在防治線粒體損傷相關(guān)疾病中的用途的制作方法
技術(shù)領域:
本發(fā)明屬于生物學和藥學領域,更具體地,本發(fā)明涉及C6。的多羥基衍生物 在防治線粒體損傷相關(guān)疾病中的用途。
背景技術(shù):
線粒體是廣泛存在于各種真核細胞中,具有環(huán)狀DNA,可以進行獨立復制的 特殊的細胞器。它不僅是機體消耗氧和產(chǎn)生ATP的主要場所,還具有多種其它 極為重要的生理功能,包括產(chǎn)生超氧陰離子等活性氧、調(diào)節(jié)細胞氧化還原電勢 和信號傳導、調(diào)控細胞調(diào)亡和基因表達等。作為細胞代謝網(wǎng)絡和信號傳導網(wǎng)絡 的調(diào)控中心,線粒體因在生長、發(fā)育、代謝、衰老、疾病、死亡以及生物進化 等多個方面表現(xiàn)出的重要作用,日益受到人們的關(guān)注。研究表明,人類許多疾 病,如衰老及與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病,腫瘤、2型糖尿病都伴有不同程 度的線粒體功能障礙。線粒體是細胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧的主要細胞器,活性氧是反 應活性極強的代謝衍生分子,包括超氧自由基('02—)、過氧化氫(HA)和羥基 自由基(* 0H—);其過量產(chǎn)生能破壞細胞系統(tǒng)中的氧化物和抗氧化物之間的動態(tài) 平衡,導致線粒體本身的退行性病變和脂類分子的過氧化、DNA和蛋白修飾異 常與細胞功能損傷。為此,如何抑制和修復線粒體損傷將為線粒體相關(guān)性疾病 的預防和治療提供新的藥物靶點。老年性震顫麻痹,即帕金森氏癥(Parkinson' s Disease, PD)是危及老年 人健康的第二大類神經(jīng)退行性疾病。臨床研究發(fā)現(xiàn)PD的發(fā)病率隨著年齡增長 不斷增高,我國的PD患病率在30 60歲為500/10萬,60歲以上為1000/10 萬,男女比例為l:l,與其它國家類似。PD的一個重要特征是中腦黑質(zhì)致密部 多巴胺能神經(jīng)元的退行性死亡,這將導致紋狀體中多巴胺匱乏,產(chǎn)生靜止性震 顫、肌強直、運動遲緩和姿勢反射障礙為特征的運動控制失調(diào)癥狀,此外還常 伴有認知失調(diào)。PD的發(fā)病機制復雜且有待闡明,線粒體氧化損傷導致的線粒體
退行性病變,被認為是引起與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的一個主要因素而受 到普遍關(guān)注。線粒體(特別是損傷線粒體)是細胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧的主要細胞器, 線粒體結(jié)構(gòu)受損以及酶活性降低反過來又進一步加重線粒體損傷,導致細胞能 量代謝障礙、細胞功能喪失。例如PD病人紋狀體的電子傳遞鏈中線粒體復合 物I有嚴重缺陷,在動物和人身上能導致類似PD癥狀的藥物1-甲基-4-苯基 -l,2,3,6-四氫吡啶,以魚藤酮和6-羥多巴,其主要作用都是抑制線粒體復合 酶I。到目前為止,還沒有任何藥物和療法從根本上阻止或延緩帕金森綜合癥 的發(fā)生和發(fā)展,同時現(xiàn)有藥物還都有嚴重的副作用。線粒體DNA(mitchondrial DNA, mtDNA)是裸露的雙鏈環(huán)狀DNA分子結(jié)構(gòu), 其缺少組蛋白外衣的保護,復制快速。缺乏校讀功能以及缺乏有效的DNA修復 系統(tǒng),極易發(fā)生突變。而電離輻射作為一種致DNA損傷的因素,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)它可 以誘導線粒體DNA的突變,其中包括缺失、點突變、插入突變等。在凋亡調(diào)節(jié) 諸多通路中,線粒體在電離輻射誘導的細胞凋亡通路中起中心調(diào)控作用。各種 死亡信號通過Bcl-2家族蛋白或直接誘導線粒體膜的通透性的改變、細胞色素 C釋放和caspases激活,最終引起細胞凋亡。輻射病是短期暴露于大量地射線或長期暴露于小量的射線引起的疾病。例 如腫瘤病患者放療后可引起輻射病,放療時在超短時間內(nèi)可產(chǎn)生大量的自由 基,耗盡體內(nèi)的輻射防護系統(tǒng)超氧岐化酶的防御和破壞細胞活性物質(zhì)線粒體、 高爾基體、核糖核酸和脫氧核糖核酸等、產(chǎn)生諸如骨髓抑制,免疫抑制,胃腸 道功能障礙等。多年來放療專家一直在尋求解決放射線毒副作用的方法,利用 高氧和低氧放療,使用放射增敏劑和保護劑,但收效都不大。因此,本領域迫切需要找到對于線粒體相關(guān)性疾病如帕金森、輻射病等疾病 有效的藥物。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供C6?;蚱涠嗔u基衍生物在防治線粒體損傷相關(guān)疾病 中的用途。在本發(fā)明的第一方面,提供一種式I所示化合物或由多種式I所示化合物 形成的混合物的用途,C60 (OH) n I,
其中,n為0-24的正整數(shù);所述的化合物或混合物用于制備防治線粒體損傷相關(guān)疾病的組合物。在另一優(yōu)選例中,n為16-24的正整數(shù)。正整數(shù)n越大,該化合物的溶解 度越高。在另一優(yōu)選例中,所述的線粒體損傷相關(guān)疾病選自 神經(jīng)退行性疾病、輻射病、2型糖尿病。在另一優(yōu)選例中,所述的神經(jīng)退行性疾病選自帕金森氏癥、老年癡呆。 在另一優(yōu)選例中,所述的組合物還用于改善免疫功能。在另一優(yōu)選例中,所述的組合物還用于提高細胞活性;提高細胞內(nèi)線粒體膜電位;提高細胞內(nèi)谷胱甘肽水平;防止細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氧化損傷;防止細胞內(nèi)DNA損傷;提高細胞內(nèi)線粒體傳遞鏈復合酶的活性;提高細胞內(nèi)Nrf2蛋白的表達;和/或降低細胞內(nèi)活性氧水平;清除細胞內(nèi)自由基。在另一優(yōu)選例中,所述的線粒體傳遞鏈復合酶選自線粒體傳遞鏈復合酶 I、線粒體傳遞鏈復合酶II。在另一優(yōu)選例中,所述的自由基選自超氧自由基、羥基自由基、禾Q/或脂質(zhì)自由基。在另一優(yōu)選例中,所述的細胞選自(但不限于)神經(jīng)上皮細胞、脾臟細胞 或肝臟細胞。在另一優(yōu)選例中,所述的組合物還用于 降低哺乳動物肝臟線粒體活性氧水平; 促進哺乳動物脾細胞增殖;和/或 提高哺乳動物脾臟細胞線粒體膜電位。在本發(fā)明的第二方面,提供一種體外(優(yōu)選非治療性地)防止細胞線粒體 損傷方法,所述方法包括給予細胞有效量的式I所示化合物或由多種式I所示化合物形成的混合物。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容,對本領域的技術(shù)人員而言是顯而易 見的。
圖1顯示順磁共振波譜儀檢測C6。(OH)24體外吸收自由基的效應。圖1A為C6。(0H)24對于超氧自由基的清除作用; 圖1B為C6。(0H)24對于羥基自由基的清除作用; 圖1C為對于脂質(zhì)自由基的清除作用。圖2顯示Ce。(0H)24能有效的保護細胞免受MPP+造成的細胞活性的下降。 **p〈0. 01,同對照組(不加入C6"0H)"和MPP+)相比較;#p<0, 05和糾p〈0. 01, 同MPP+組相比較,多于三次的實驗結(jié)果用于統(tǒng)計檢驗。圖3顯示C6。(0H)24能有效的保護MPP+造成的線粒體膜電位的下降jp〈0. 05, 同對照組相比較;#p<0.05,同MPP+組相比較,—p<0. 01,同Cs。(OH)M組相比較, 多于三次的實驗結(jié)果用于統(tǒng)計檢驗。圖4顯示C6。(0H)24能有效的保護MPP+造成的細胞內(nèi)古谷胱甘肽水平的降低。 林p〈0, 01,同對照組相比較;##p〈0. 01,同MPP+組相比較,—p〈0. 01,同C6。(0H)24 相比較。多于三次的實驗結(jié)果用于統(tǒng)計檢驗。圖5顯示U(0H)24能有效的保護MPP+引起的蛋白質(zhì)的氧化損傷。圖中上面顯 示的蛋白質(zhì)氧化后形成羰基蛋白的水平,下圖為考馬斯亮藍染色顯示的總蛋白 水平。圖6顯示C6。(0H)24能有效保護MPP+引起的DNA氧化損傷。其中,第1列顯示 的是TRITC的染色,紅色表示特異性的8-0X0-dG水平,第2列顯示的MPI染 色,DAPI使整個細胞核染成蘭色;第3列是第l列和第2列的合并。圖7顯示C6。(0H)24能有效的保護MPP+造成的DNA損傷。
圖7A是單細胞電泳實驗的結(jié)果;圖7B是圖7A的量化;其中,**p<0.01,同對照組相比較;糾p〈0.01,同MPP+組相比較,多于三次的實驗結(jié)果用于統(tǒng)計檢驗。圖8顯示C6。(0H) 24能有效的保護MPF引起的線粒體復合酶I (圖8A)和II (圖 8B)的活性的降低。**p〈0. 01,同MPP+組相比較;,<0. 01, #p〈0, 05,同MPP+ 組相比較,多于三次的實驗結(jié)果用于統(tǒng)計檢驗。圖9顯示U(0H)24能有效的保護MPP+引起Nrf2蛋白表達的降低。圖中顯示 的是三次實驗有代表的結(jié)果。圖10顯示C6。(0H)24能有效的保護MPP+引起的細胞內(nèi)活性氧水平的提高。 **p〈0. 01,同對照組相比較;#p<0.05,同MPP+組相比較,多于三次的實驗結(jié) 果用于統(tǒng)計檢驗。圖11顯示C6。(0H)M能有效保護輻射引起小鼠肝臟線粒體活性氧升高。 **p<0. 01,同正常組相比較;##p<0.01,同輻照組相比較。圖12顯示Ce。(0H)24能有效提高輻射引起小鼠脾細胞增殖率降低。*p<0.05, 同正常組相比較;#p〈0.05,同輻照組相比較。圖13顯示C6。(0H)24能有效保護輻射引起小鼠脾臟細胞線粒體膜電位的降低。 **p〈0. 01,同正常組相比較;##p<0.01,同輻照組相比較。圖14顯示了各種處理組小鼠體內(nèi)MDA含量情況。**p<0.01,同對照組(正 常小鼠,注射生理鹽水不輻照)相比較;弁pO.05和弁弁p0.01,同輻照組相比較, 每組的ICR小鼠為8只(11=8)。
具體實施方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究,首次揭示Ce。及其多羥基衍生物對于線粒 體損傷相關(guān)疾病的防治具有極其顯著的效果。本發(fā)明人分別采用帕金森氏綜合
癥的細胞模型和輻射病的動物模型,從線粒體形態(tài)學,線粒體復合物酶活性, 細胞抗氧化系統(tǒng)生化指標,核酸、蛋白、脂質(zhì)過氧化損傷等方面,充分論證了 U及其多羥基衍生物對于防治線粒體損傷的優(yōu)異功效,從而為開發(fā)以線粒體為 靶點的多功能藥物提供了有效途徑。在此基礎上完成了本發(fā)明。C6。及其多羥基衍生物C6。(又稱為富勒烯)是碳的第三種同位素異型體,其是由60個碳原子組成 的具有特殊的中空籠狀結(jié)構(gòu)的球形分子,包括12個五元環(huán)和20個六元環(huán),有 30個雙鍵,其直徑約為O. 71nm。C6。的多羥基衍生物又稱富勒醇。C6。的多羥基衍生物由于含有一定數(shù)量的羥 基而更易溶于水,而且羥基的數(shù)量越多水溶性越好。因此,所述的C6?;蚱涠嗔u基衍生物具有如式I所示的結(jié)構(gòu)C60 (OH) n I, 其中,n表示0-24的正整數(shù)。已有的研究表明,C。??梢园l(fā)生Diels-Alder反應、Bingel反應和1, 3-偶極環(huán)加成反應,能清除自由基。但是其對線粒體的作用至今還沒有被人們意 識到。而本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn),"及其多羥基衍生物對于線粒體損傷的防治具 有極其優(yōu)異的效果。所述的U或其多羥基衍生物的制備方法可采用本領域現(xiàn)有技術(shù)人員所了 解的方法,比如化學合成的方法,所述的化合物可以以純凈物的形式用于本發(fā)明,例如化合物Ce?;蚧衔顲e。 (OH) 24;此外,由兩種或多種所述的化合物組成的混合物也可用于本發(fā)明,例 如,U和C6。 (OH) 24的組合;或者含有多種C6。的多羥基衍生物的混合物,如混 合物中含有C6。 (OH) 24、 C6。 (OH) 23、 C6。 (OH) 22等。此外,考慮到化合物的溶解 性,優(yōu)選的是那些羥基數(shù)量較多的化合物,例如n為16-24的C6。多羥基衍生物。本發(fā)明的化合物還可以以藥學或生理學上可接受的鹽或酯的形式使用。這些 鹽或酯包括(但不限于)與如下酸形成的鹽或酯氫氯酸、氫溴酸、硫酸、檸檬 酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富馬酸、馬來酸、 草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、羥乙磺酸。鹵化物的鹽同樣適用。其他 鹽包括與堿金屬或堿土金屬(如鈉、鉀、鈣或鎂)形成的鹽,以及以其他常規(guī) 的"前體藥物"形式存在的鹽(當以這種形式給藥時,在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化成活性部分)。用途本發(fā)明提供了 C6?;蚱涠嗔u基衍生物在修復線粒體損傷方面的作用,從而 可用于制備預防或治療線粒體損傷相關(guān)疾病的藥物。所述的線粒體損傷相關(guān)疾 病例如如帕金森氏綜合癥和輻射病。本發(fā)明人利用l-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP+)建立了模擬急性環(huán)境毒性導 致的神經(jīng)退行性疾病(帕金森氏綜合癥)的體外細胞模型。構(gòu)建細胞模型基于的 原理為MPP+可直接被多巴胺能神經(jīng)元膜上的單胺轉(zhuǎn)運體攝取進入胞內(nèi),然后 進入線粒體,特異性地與線粒體傳遞鏈復合酶I結(jié)合并抑制其活性,進一步抑 制ATP合成,并且產(chǎn)生大量自由基和醌類物質(zhì),導致多巴胺神經(jīng)元發(fā)生退行性 改變,甚至死亡。本發(fā)明人應用MPP+急性處理人神經(jīng)上皮瘤細胞,該細胞表現(xiàn)為表達線粒體傳 遞鏈復合酶I活性的下降。然后觀察應用不同濃度的C6?;蚱涠嗔u基衍生物進行 預防性干預的效應。本發(fā)明人還考察了 U或其多羥基衍生物對于該線粒體損傷 模型中線粒體功能的各項指標的影響,針對該細胞模型分別觀察線粒體酶活 性;線粒體中ROS高活性代謝分子的水平;線粒體的腫脹度和線粒體的膜電位以及蛋白、核酸及脂質(zhì)氧化損傷水平。本發(fā)明人還考察了細胞內(nèi)抗氧化酶活性 及其參與抗氧化酶活性調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子的表達。此外,本發(fā)明人還在整體動物模型水平上研究了含U或其多羥基衍生物的生物效應。采用Y射線輻照的方法使小鼠線粒體受到損傷,考察小鼠肝臟線粒 體中R0S高活性代謝分子的水平和線粒體的膜電位,以及考察小鼠脾臟淋巴細 胞的增殖率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),C6。或其多羥基衍生物對于神經(jīng)上皮瘤細胞和小鼠肝臟線粒體的 氧化損傷有很好的保護作用。實驗充分證明,C6。或其多羥基衍生物保護細胞免 受MPP+造成的DNA損傷、蛋白質(zhì)氧化、線粒體功能的下降、細胞內(nèi)氧化還原平衡的破壞;Ce?;蚱涠嗔u基衍生物保護輻射引起的肝臟線粒體的活性氧和膜電位 的下降,并保護輻射引起的脾臟細胞增殖降低,提高了小鼠的免疫力。并揭示 了 Ce。或其多羥基衍生物的良好的吸收自由基的效應和通過激活Nrf2的通路,促 進細胞GSH的生成,保護線粒體功能和抵抗氧化損傷的機制。組合物如本文所用,術(shù)語"本發(fā)明的組合物"包括藥物組合物和飲食補充劑(如 保健品組合物),只要它們含有u或其多羥基衍生物作為對于修復線粒體損傷有用的活性成分。通常,所述的藥物組合物或飲食補充劑含有0.000001-20wt。/。(優(yōu)選的為 0. 00005-10wt%;更優(yōu)選0.00001-5wt。/。)的C6?;蚱涠嗔u基衍生物;(b)藥學上或 食品學上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明中,"藥學上可接受的"成分是適用于人和/或動物而無過度不良副 反應(如毒性、刺激和變態(tài)反應)即有合理的效益/風險比的物質(zhì)。本發(fā)明中, "藥學上可接受的載體"是用于將本發(fā)明的C6。或其多羥基衍生物傳送給動物或 人的藥學上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑等。載體可以是液體形式 或固體形式。本發(fā)明所述的組合物的劑型可以是多種多樣的,只要是能夠使活性成分有 效地到達哺乳動物體內(nèi)的劑型都是可以的。比如可選自(但不限于)片劑、膠 囊、粉末、顆粒、糖漿、溶液、或懸浮液。其中U或其多羥基衍生物可以存在 于適宜的固體或液體的載體或稀釋液中。一些增加可C6。或其多羥基衍生物溶解 性的物質(zhì)也可應用于本發(fā)明的組合物中。從易于制備和給藥的立場看,優(yōu)選的組合物是固態(tài)組合物,尤其是片劑和固 體填充或液體填充的膠囊。組合物的口服給藥是優(yōu)選的。所用的活性成分的有效劑量可隨所用的化合物、給藥的模式或待治療的疾病 的嚴重程度而變化。然而,通常當本發(fā)明的C6?;蚱涠嗔u基衍生物每天以約 0. l-100mg/kg動物體重的劑量給予時,能得到令人滿意的效果,較佳地每天以 l-3次分開的劑量給予,或以緩釋形式給藥。對大部分大型哺乳動物而言,每天 的總劑量約為O. l-1000mg,較佳地約為l-500mg。適用于內(nèi)服的劑量形式,包含 與固態(tài)或液態(tài)藥學上可接受的載體密切混合的約1-200mg的活性化合物。可調(diào)節(jié) 此劑量方案以提供最佳治療應答。例如,由治療狀況的迫切要求,可每天給予若 干次分開的劑量,或?qū)┝堪幢壤販p少或增加。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠 商所建議的條件。除非另外說明,否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義,文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉 的意義相同。此外,任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本 發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。I.材料與方法1. 試劑地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤;抗PGC-lci抗體購于美國 Santa Cruz公司;抗微管蛋白(tubulin)抗體購于美國Sigma公司;TRIzol購 于美國Invitrogen公司;抗復合物I, II, III的抗體購自美國Invitrogen 公司;逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購于美國Proraega公司;游離脂肪酸測定試劑盒購自南 京建成生物試劑公司;熱啟動Taq酶購于日本TaKaRa公司;D-loop, PPAR-a , L-CPT1, NRF1; mtTFA和18SRNA引物由上海博亞公司合成;硫辛酰胺購自于 Fluka公司,N-乙酰半胱氨酸購自德國Calbiochem公司;實時定量PCR測定 試劑盒購自大連寶生物(Takara Bio)公司;p-JNK抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;小鼠月中瘤壞死因子a (Tumor necrosis factor—a , TNF—a ) 購自美國R&D公司;2-脫氧-D-[1-3H]葡萄糖(2-D0G)購自英國Amersham公 司;BCA蛋白測定試盒和West Pico chemilurainescent發(fā)光底物來自美國 PIERCE公司;R-硫辛酸(簡稱硫辛酸)由德國K. Wessel博士贈送(或也可商購, 如可購自上海新嵩巍有限公司);其余的細胞培養(yǎng)的試劑均購自于美國 Invitrogen公司。2. 方法細胞培養(yǎng)和脂肪細胞分化3T3-L1前脂肪細胞(購自ATCC, Cat. No. CL-173)用完全培養(yǎng)液(DMEM+10% 胎牛血清+青、鏈霉素各100u/ml),在37。C孵箱(5。/。二氧化碳,95%空氣)中培 養(yǎng),每2天換液1次。待細胞生長至完全融合后2天(第0天),開始誘導分化, 具體步驟為將培養(yǎng)液換成含0.5raM IBMX、 0.25 p M地塞米松和1 yM胰島 素的完全培養(yǎng)液;48h后,撤去IBMX和地塞米松,使完全培養(yǎng)液中只含有l(wèi) UM 胰島素;2天后換液,撤去胰島素,使用不含有任何誘導劑的完全培養(yǎng)基;以
所述的順磁共振波譜儀由德國Brucker光譜儀公司生產(chǎn)。檢測的自由基主要包 括常見的超氧自由基、羥基自由基以及脂質(zhì)自由基。次黃嘌啉和次黃嘌啉氧化 酶產(chǎn)生超氧自由基;羥基自由基由Fenton反應產(chǎn)生;脂質(zhì)自由基由SDS-CuS04 系統(tǒng)產(chǎn)生。制備不同濃度的C6。(0H)24水溶液,依次用ESR檢測相關(guān)自由基的信 號強度。分別采用DMPO(二甲基吡咯氧酮)和POBN(a -(1氧基-4_吡啶基-N-叔 丁基氮氧化合物)作為自由基捕獲劑。圖1顯示C6。(0H)"體外吸收自由基的效應。電子自旋共振(ESR)結(jié)果顯示 C6。(0H)24能很好的清除三種常見的自由基超氧自由基、羥基自由基和脂質(zhì)自 由基。其中清除超氧自由基的IC50(半數(shù)清除率)為36. 8uM(圖1A);清除羥基 自由基的IC50為135.4uM(圖1B);清除脂質(zhì)自由基的IC50為495 uM(圖1C)。上述結(jié)果可見,U(OH)m清除超氧自由基的能力和SOD差不多;清除羥基自 由基的能力是甘露醇的268倍;清除脂質(zhì)自由基的能力是維生素E的37倍。 因此,C6。(0H)24具有極其優(yōu)異的體外吸收自由基效應。實施例2細胞培養(yǎng)、C6。(0H)24和MPP+對SK-N-MC細胞的處理1. 細胞培養(yǎng)SK-N-MC細胞(成人神經(jīng)上皮瘤細胞,ATCC),培養(yǎng)在37。C, 5°/。二氧化碳飽和 濕度的培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)基為a -MEM,加入10%FBS, 0. 5mM丙酮酸鈉,0. 2徹a跳, 100U/L青霉素和100mg/L硫酸鏈霉素。2. C6。多羥基衍生物的合成合成Ce。(0H)24,采用的方法是將C6。和液溴反應,加入少量還原性Fe粉作 為催化劑,反應時間為48小時,反應得到產(chǎn)物為C6。Br24。再將得到的Ce。Br24 與PH=13的NaOH水解反應2小時,經(jīng)過提純得到C6。(0H)^。提純方法如下水 解后產(chǎn)物用80%的乙醇洗五次,再將合成的C6。(0H)m水溶液裝入透析袋中用 MilliQ純水進行透析,直到透析液PH〈6. 5,真空干燥后做質(zhì)譜表征,發(fā)現(xiàn)分 子離子峰1128。高分辨質(zhì)譜顯示其分子式為C6。(OH)24,其純度大于95%。使用前放入4t:保存。此外,通過減少Ce。和液溴反應的時間(反應時間約30小時),還制備了C6。(0H)24和/或羥基數(shù)量少于24的其它C6。多羥基衍生物的混合物。 3.分組和處理在進行試驗時,C6。(0H)24在SK-N-MC細胞培養(yǎng)基中的終濃度為50uM。 MPP+ 在細胞培養(yǎng)基中的終濃度為500iiM。實驗分為四組,分別是正常對照組(不加入C6。(0H)M和MPP+)、 C6。(0H)24組、 MPP+損傷組、預先加C6。(0H)24組再加MPP+組(合并組)。其中預先加C6。(0H)24的時間為48小時。實施例3 C6。(0H)24對細胞活性的影響本實施例中,采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞活性。 細胞培養(yǎng)在96孔板中,按如實施例2所述方法分組和處理后,加入50ul 5mg/mlMTT,置于細胞培養(yǎng)箱中溫育3個小時后,棄去MTT,加入200ulDMS0 溶解紫色產(chǎn)物,于酶標儀(Molecular Device, Spectra Max 340)讀取560nm 吸光值。結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示,單加入MPP+24小時后,細胞活性下降至對照 的45%,而預先加入不同濃度的C6。(0H)24,高于20tiM的Ce。(OH)24開始有明顯的 保護效果,其中50u M的C6。(0H)"保護效果基本和正常對照組差不多。 林p〈0. 01,同對照組相比較;#p〈0. 05和將p〈0. 01,同MPP+組相比較,多于三 次的實驗結(jié)果用于統(tǒng)計檢驗。上述結(jié)果可見,Ce。(OH)24能有效地保護細胞免受MPP+造成的細胞活性的下降,提高細胞的活性。實施例4 C6。(0H)24對線粒體膜電位的影響本實施例中,線粒體膜電位檢測方法如下SK-N-MC細胞培養(yǎng)在96孔細胞 培養(yǎng)板中,按如實施例2所述的處理方法處理后,加入含20"M JC-l染料的 培養(yǎng)基,在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)溫育30分鐘,棄去含染料的培養(yǎng)基,每孔用200y 1PBS 洗一次,再加入200y 1PBS于熒光酶標儀讀數(shù),激發(fā)波長488nm,檢測發(fā)射波 長530nm和590nm,熒光強度比值(590nm/530nm,紅光比綠光),作為線粒體膜 電位的指標。結(jié)果如圖3所示,不加入MPP+而僅加入C6。(0H)24,可顯著地提高線粒體的膜 電位;加入MPP+ 24小時后,線粒體的膜電位下降,而預先加入C6。(0H)2,保護 的細胞的線粒體的膜電位顯著高于MPP+處理組,能較大程度的提高線粒體膜電
位。C6。(0H)M組的線粒體膜電位顯著高于正常對照組。*p<0. 05,同對照組相比較;#p<0.05,同MPP+組相比較;—p<0.01,同Ce。(0H)24組相比較,多于三次的實驗結(jié)果用于統(tǒng)計檢驗。因此可見,Ce。(0H)24能有效地提高線粒體膜電位,并且能夠有效地保護^ ^+造成的線粒體膜電位的下降。實施例5 Ce。(0H)24對細胞內(nèi)谷胱甘肽含量的影響還原型谷胱甘肽含量的測定方法如下細胞培養(yǎng)在100mm細胞培養(yǎng)板中,按 如實施例2所述的處理方法處理后,用PBS洗一次,用生理鹽水刮下細胞,用 玻璃勻漿器手動研磨20次,3000rcf、 4。C離心10分鐘,取上清,按照試劑盒 說明書進行GSH含量測定,該試劑盒的原理為二硫代二硝基苯甲酸和巰基化合 物反應產(chǎn)生一種黃色化合物,從而進行比色測定。圖4顯示,不加入MPP+而僅加入"。(0H)24,可顯著地提高細胞內(nèi)谷胱甘肽水 平;加入MPP+ 24小時后,細胞內(nèi)谷胱甘肽水平顯著降低,而預先加入"。(0H)24 保護的細胞谷胱甘肽水平顯著高于MPP+處理組。C6。(0H)M組的谷胱甘肽水平顯 著高于正常對照組。**p<0.01,同對照組相比較;ft#p<0.01,同MPP+組相比較, 一p〈0.01,同U(OH)M相比較。多于三次的實驗結(jié)果用于統(tǒng)計檢驗。因此可見,Ce。(0H)24能有效地提高細胞內(nèi)谷胱甘肽水平,并且能夠有效地保護MPP+造成的細胞內(nèi)谷胱甘肽水平的降低。實施例6 C6。(0H)24對蛋白質(zhì)氧化損傷的保護作用氧化性蛋白檢測方法如下細胞培養(yǎng)在100mm細胞培養(yǎng)板中,按如實施例2 所述的處理方法處理后,用PBS洗一次,細胞用含lmM的細胞裂解液收取蛋白 后,按照Oxyblot Protein Oxidation Detection Kit說明進行,該試劑盒原 理為用2,4-二硝基苯基肼(Dinitrophenylhydrazine, DNPH)標記氧化性蛋 白,以抗DNPH的抗體進行蛋白免疫印跡實驗檢測,用考馬斯亮藍染色聚丙烯酰胺蛋白電泳凝膠,作為蛋白量的內(nèi)參。結(jié)果如圖5所示,加入MPP+24小時后,細胞氧化性蛋白水平比對照組顯著 升高,而預先加入U(OH)M保護的細胞氧化性蛋白水平顯著降低,接近正常對 照組。圖中上面顯示的蛋白質(zhì)氧化后形成羰基蛋白的水平,下圖為考馬斯亮藍 染色顯示的總蛋白水平。 因此可見,Ce。(0H)24能夠有效地保護細胞,防止蛋白質(zhì)的氧化損傷。實施例7 C6。(OH)24對于DNA損傷的保護作用1. DNA的氧化損傷檢測檢測方法如下用抗8-oxo-dG抗體來檢測DNA的氧化損傷,8-oxo-dG是DNA 氧化損傷的標志。細胞生長在12誦的玻片上,C6。(0H)"及MPP+處理后用70%的 冷乙醇固定, 一抗用抗8-oxo-dG抗體(l: 300稀釋),二抗用TRITC連接的IG 抗鼠抗體(l: 200稀釋)。用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察DNA的氧化損傷。結(jié)果如圖6所示,DNA的氧化損傷通過抗8-oxo-dG特異性抗體染色,再通 過激光共聚焦熒光顯微鏡觀察8-羥鳥苷水平。圖中,第1列顯示的是TRITC的 染色,紅色表示特異性的8-oxo-dG水平,第2列顯示的DAPI染色,DAPI使整 個細胞核染成蘭色;第3列是第1列和第2列的合并。從圖中可以看出,加入 MPP+24小時后,細胞內(nèi)DNA的氧化損傷顯著升高,而預先加入C6。(0H)24能顯著 降低MPP+引起的DNA的氧化損傷。由上述結(jié)果可見,C6。(0H)24能有效地防止DNA氧化損傷。2. 單細胞電泳實驗細胞培養(yǎng)在6孔細胞培養(yǎng)板中,按如實施例2所述的處理方法處理后,用 0. 25%的胰酶將細胞消化下來,均勻重懸于37。C的0. 75%低熔點瓊脂糖中,并 滴在載玻片上,用蓋玻片壓平,在4"C環(huán)境下,低熔點瓊脂糖形成凝膠后,將 玻片置于細胞裂解液中(2. 5MNaCl, 100mMEDTA, 10mM Tris pH10. 0, 1% Triton X-IOO和10% DMSO),放置兩個小時,然后在電泳液(300mM NaOH, lmM EDTA) 中放置20分鐘,之后進行電泳(300毫安,25伏特,20分鐘),電泳后的玻片 浸入中和液(0.4M Tris, pH7.5)中和,取出后在凝膠上滴上PI (2 u g/ml)染細 胞核,于熒光顯微鏡下觀察,在紫外光激發(fā)下,觀察細胞核是否在電泳中出現(xiàn) 拖尾,數(shù)出總細胞中帶拖尾細胞的百分比,作為DNA損傷的指標。結(jié)果如圖7A和圖7B所示,加入MPP+24小時后,細胞核損傷的(有拖尾的) 占總細胞數(shù)的90%以上,預先加入C6。(0H)24保護的細胞核損傷的(有拖尾的)占 總細胞數(shù)的18%。 **p<0.01,同對照組相比較;##p〈0.01,同MPP+組相比較, 多于三次的實驗結(jié)果用于統(tǒng)計檢驗。由上述結(jié)果可見,C6。(0HL能有效地防止DNA損傷。 實施例8 C6。(0H)M對于線粒體傳遞鏈復合酶的影響線粒體傳遞鏈復合酶I和線粒體傳遞鏈復合酶II活性的檢測方法如下細胞培養(yǎng)在100mra細胞培養(yǎng)板中,按如上方法處理后,用PBS洗一次,刮下細胞, 在低滲溶液中用玻璃勻漿器手動研磨20次,800rcf、 4'C離心5分鐘,收取上 清,11000rcf、 4'C離心30分鐘,所得沉淀為線粒體,用于復合酶I和II的 活性測定。復合酶I的測定方法為在反應液(50mM Tris pH8. 1, 0. 1%BSA, 1 u M Antimycin A, 0. 2mMNaN3, 0. 05mM CoQl, 0. 4mMDCPIP)中力口入終濃度為50 u g/ral 的線粒體,用終濃度為0. 2mM的NADH啟動反應,于600nm測定吸光度的降低 速度,以此作為活性的反映。復合酶II的測定方法為在反應液(50mM磷酸鉀緩沖液,pH7. 8, 2mMEDTA, 0. 1%BSA, 3uM魚藤酮,1 w M Antimycin A, 0. 2mM NaN3, 0.05mMCoQl, 0. 2mM ATP, OJmM DCPIP)中加入終濃度為100" g/ml的線粒體,于600nm測定吸光 度的降低速度,以此作為活性的反應。測定結(jié)果如圖8A和圖8B所示,加入MPP+24小時后,線粒體的復合酶I和 II的活性分別降低到對照組的48%和63%,而預先加入Ce。(0H)24保護的細胞的 線粒體復合酶I和II的活性顯著高于MPP+處理組。**p〈0.01,同MPP+組相比 較;共ttp〈0,01, #p<0. 05,同MPP+組相比較,多于三次的實驗結(jié)果用于統(tǒng)計檢 驗。由上述結(jié)果可見,U(OH)M能有效地防止線粒體復合酶I和II的活性的降低。實施例9 C6。(0H)24對于Nrf2蛋白表達的影響Nrf2的表達用蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測。檢測采用實施例2所述 的處理方法處理的細胞內(nèi)Nrf2的表達??筃rf2的抗體來自Santa Cruz公司, 一抗?jié)舛葹?:1000, 二抗使用辣根過氧化酶標記的山羊抗兔抗體。結(jié)果如圖9所示,加入MPP+24小時后,Nrf2蛋白表達水平明顯降低,而預 先加入C6。(0H)24能有效提高MPP+引起的Nrf2蛋白表達水平。圖中顯示的是三次 實驗有代表的結(jié)果。由上述結(jié)果可見,Ce。(0H)24能有效地防止Nrf2蛋白表達的降低。
實施例10 Ce。(OH)24對于細胞內(nèi)活性氧水平的影響細胞內(nèi)活性氧的檢測方法如下細胞培養(yǎng)在6孔細胞培養(yǎng)板中,按如上方法處理后,加入含25wM DCFH-DA(2,7二氯熒光素雙乙酸鹽)染料的培養(yǎng)基,在 細胞培養(yǎng)箱內(nèi)溫育30分鐘,棄去含染料的培養(yǎng)基,用冷的PBS洗三次,再制 成500uL細胞懸液,用流式細胞儀(FACSAriaTM, Becton Dickinson)檢測細 胞的熒光值(激發(fā)波長488nm,發(fā)射波長530nm),熒光值作為細胞內(nèi)活性氧的 高低的指標。結(jié)果如圖10所示,加入^ ^+ 24小時后,細胞質(zhì)中活性氧水平有明顯的提 高,而預先加入U(0H)2j呆護的細胞活性氧水平低于MPP+處理組。**p〈0. 01, 同對照組相比較;#p<0.05,同MPP+組相比較,多于三次的實驗結(jié)果用于統(tǒng)計 檢驗。由上述結(jié)果可見,U(OH)M能有效地防止細胞內(nèi)活性氧水平的提高。實施例11 C6。(0H)24對于小鼠肝臟線粒體活性氧的影響本實施例中,通過動物實驗模型觀察線粒體活性氧變化,方法如下采用Y 射線輻照的方法使小鼠線粒體受到損傷,取出肝臟,采用差速離心的方法提取肝線粒體。正常組、給C6。(0H)M組、輻照組、合并組線粒體加入含丙酮酸鈉的DCra-DA溶液,37。C溫育30分鐘,棄去DCFH-DA溶液,用冷的PBS洗三次, 用熒光酶標儀(Flex StationII 384, Molecular Devices)讀取熒光值(激 發(fā)波長488nm,發(fā)射波長530nm) , BCA方法測定蛋白濃度,單位濃度蛋白的熒 光值作為各組線粒體活性氧的高低的指標。結(jié)果如圖ll所示,小鼠輻照后,肝臟線粒體活性氧水平明顯升高,而輻照 前給予Ce。(OH)24組其肝臟線粒體活性氧水平顯著降低,基本和正常組活性氧水 平差不多。**p<0.01,同正常組相比較;##p<0. 01,同輻照組相比較。由上述結(jié)果可見,"。(OH)w能夠有效地防止小鼠肝臟線粒體活性氧升高。實施例12 C6。(0H)M對于小鼠脾細胞增殖的影響本實施例中,通過動物實驗模型觀察脾臟細胞增殖,方法如下頸椎脫臼處死小鼠,于無菌條件下取出脾臟,在磷酸鹽緩沖液(PBS, pH值7.4)中勻漿過 濾,制成單個脾細胞懸液。低滲液處理去除血細胞,PBS洗滌2次后,用含10%
胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基將細胞稀釋為7. 5 X106個'mL—'。在96孔細胞 培養(yǎng)板中每孔加細胞懸液100uL,每個樣品均設3個復孔,置37 °C 、飽和濕 度為5% C02孵溫箱中培養(yǎng)48 h,然后每孔加20uL MTT(5 nig mL—'),繼續(xù)培 養(yǎng)4h。棄培養(yǎng)液,每孔加入DMS0 200u L,于酶標儀(Molecular Device, Spectra Max 340)讀取560nm吸光值。結(jié)果如圖12所示,小鼠輻照后,脾臟細胞增殖率下降,而輻照前給予C6。(0H)M 組其脾臟細胞增殖率升高。*p<0.05,同正常組相比較;共p〈0.05,同輻照組相 比較。由上述結(jié)果可見,C6。(0H)24能夠有效地提高輻射引起小鼠脾細胞增殖率的降低。實施例13 C6。(0H)24對于小鼠脾臟細胞線粒體膜電位的影響本實施例中,通過動物實驗模型觀察線粒體膜電位,具體方法如下動物的 脾臟細胞培養(yǎng)在96孔細胞培養(yǎng)板中,按如實施例2所述的處理方法處理后, 加入含20uM JC-l染料的培養(yǎng)基,在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)溫育30分鐘,棄去含染料 的培養(yǎng)基,每孔用200 y 1PBS洗一次,再加入200u 1PBS于熒光酶標儀度數(shù), 激發(fā)波長488頭,檢測發(fā)射波長530nm和590nm,熒光強度比值(590nm/530nm, 紅光比綠光),作為線粒體膜電位的指標。結(jié)果圖13所示,小鼠輻照后,脾臟細胞線粒體膜電位急劇降低,只有正常 對照組的30%,而輻照前給予C6。(0H)24組其脾臟細胞線粒體膜電位明顯升高, 基本和正常組脾臟細胞線粒體膜電位差不多。**p<0.01,同正常組相比較; ##p<0. 01,同輻照組相比較。由上述結(jié)果可見,C6。(0H)M能有效保護輻射引起小鼠脾臟細胞線粒體膜電位 的降低。實施例14 C6。對于輻射損傷的修護作用丙二醛(MDA)是輻射損傷引起脂質(zhì)過氧化的重要指標。本實施例中,通過 觀察ICR小鼠輻照后體內(nèi)丙二醛的情況來驗證C6。和C6()(OH)24對于輻射損傷的 修護作用。具體實驗方法如下輻照后取小鼠新鮮肝臟,用生理鹽水制成10%的勻漿。 MDA測定用硫代巴比妥酸法,采用南京建成生物工程研究所的MDA試劑盒進
行測定,具體測定方法按試劑盒的說明進行。結(jié)果如圖14所示,可以看出,ICR小鼠受到輻照后,肝組織勻漿的MDA 顯著升高,說明輻照后肝脂質(zhì)產(chǎn)生大量過氧化產(chǎn)物。而輻照前分別給予4g/kg 的Ceo和C6o(OH)24能降低輻射引起的過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生,對輻射引起的損傷有一定的保護作用。其中,C60(OH)24的輻射效果要好于C60。此外,本發(fā)明人還驗證了 C6。(0H)24以及羥基數(shù)量少于24的其它C6。多羥基 衍生物的混合物對于線粒體損傷的修護作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),該混合物也具有線粒 體修護作用。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考,就如同每一篇文獻被 單獨引用作為參考那樣。此外應理解,在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后, 本領域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改,這些等價形式同樣落于本申 請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1. 一種式I所示化合物或由多種式I所示化合物形成的混合物的用途,C60(OH)nI,其中,n為0-24的正整數(shù);其特征在于,所述的化合物或混合物用于制備防治線粒體損傷相關(guān)疾病的組合物。
2. 如權(quán)利要求l所述的用途,其特征在于,n為16-24的正整數(shù)。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途,其特征在于,所述的線粒體損傷相關(guān)疾病 選自-神經(jīng)退行性疾病、輻射病、2型糖尿病。
4. 如權(quán)利要求1所述的用途,其特征在于,所述的組合物還用于改善免 疫功能。
5. 如權(quán)利要求l所述的用途,其特征在于,所述的組合物還用于 提高細胞活性;提高細胞內(nèi)線粒體膜電位; 提高細胞內(nèi)谷胱甘肽水平; 防止細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氧化損傷; 防止細胞內(nèi)DNA損傷; 提高細胞內(nèi)線粒體傳遞鏈復合酶的活性; 提高細胞內(nèi)Nrf2蛋白的表達;禾口/或降低細胞內(nèi)活性氧水平; 清除細胞內(nèi)自由基。
6. 如權(quán)利要求5所述的用途,其特征在于,所述的線粒體傳遞鏈復合酶 選自線粒體傳遞鏈復合酶I、線粒體傳遞鏈復合酶II。
7. 如權(quán)利要求5所述的用途,其特征在于,所述的自由基選自超氧自 由基、羥基自由基、和/或脂質(zhì)自由基。
8. 如權(quán)利要求5所述的用途,其特征在于,所述的細胞選自神經(jīng)上皮 細胞、脾臟細胞或肝臟細胞。
9. 如權(quán)利要求l所述的用途,其特征在于,所述的組合物還用于 降低哺乳動物肝臟線粒體活性氧水平;促進哺乳動物脾細胞增殖;和/或提高哺乳動物脾臟細胞線粒體膜電位。
10. —種體外防止細胞線粒體損傷方法,其特征在于,所述方法包括 給予細胞有效量的式I所示化合物或由多種式I所示化合物形成的混合
全文摘要
本發(fā)明屬于生物學和藥學領域,公開了一種C<sub>60</sub>或其多羥基衍生物的用途,用于制備防治線粒體損傷相關(guān)疾病(如神經(jīng)退行性疾病或輻射病)的組合物。本發(fā)明人構(gòu)建了線粒體損傷相關(guān)疾病的細胞模型和動物模型,充分論證了C<sub>60</sub>及其多羥基衍生物對于防治線粒體損傷的優(yōu)異功效,從而為開發(fā)以線粒體為靶點的多功能藥物提供了有效途徑。
文檔編號A61P25/16GK101396372SQ20071004661
公開日2009年4月1日 申請日期2007年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月29日
發(fā)明者劉健康, 李文新, 蔡小青 申請人:中國科學院上海生命科學研究院;中國科學院上海應用物理研究所