專利名稱：漢族人群線粒體dna單倍型檢測引物陣列及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種引物陣列，尤其涉及一種漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列(Primer Array)及制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
線粒體通過氧化磷酸化(OXPHOS)產(chǎn)生人體用于工作的ATP和維持體溫的熱量，處于新陳代謝和生物能量轉(zhuǎn)換的中心地位。線粒體DNA (mtDNA)是細(xì)胞內(nèi)除nDNA外唯一存在的遺傳物質(zhì)。其中，mtDNA編碼區(qū)所編碼的13個(gè)多肽是電子傳遞鏈的重要組成成分。近年來的研究證明，線粒體不僅為機(jī)體提供能量，其遺傳結(jié)構(gòu)和生理功能的缺陷又與機(jī)體的多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)(即線粒體疾病)，并且，定義線粒體DNA單倍型的“非致病性”DNA 遺傳變異與人類的多種疾病的易感性密切相關(guān)。目前，對絕大多數(shù)線粒體遺傳病尚無有效的治療方法，而許多線粒體遺傳病又具有致殘性，病人生活質(zhì)量差，而社會、家庭不但要支付其生活費(fèi)、醫(yī)療費(fèi)，還要安排專人料理其生活，給社會、家庭以沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)?；蛐酒址QDNA芯片、DNA微探針陣列等等，它是將半導(dǎo)體工業(yè)的微型制造技術(shù)與分子生物學(xué)結(jié)合起來，在玻璃、陶瓷、金屬片或尼龍膜、硝酸纖維素膜等基片物質(zhì)表面上產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后將待測定未知目標(biāo)DNA與芯片上已知DNA探針“雜交”，以確定未知DNA分子。Real-Time PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中添加熒光物質(zhì)或含熒光基團(tuán)的探針，利用熒光信號的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)PCR的過程，以達(dá)到對未知樣品的定性或定量分析的目的，與常規(guī)PCR技術(shù)和芯片技術(shù)比較，其快速、精確、定量、無污染及高通量等優(yōu)點(diǎn)成為國際公認(rèn)的核酸分子定量的標(biāo)準(zhǔn)方法。目前，檢測線粒體DNA單倍型的技術(shù)是基于PCR的 RFLP(restriction fragment length polymrphism)以及測序等技術(shù)。但這些技術(shù)對于大樣本人群來說，在不同程度上存在程序復(fù)雜、工作量大、繁瑣、費(fèi)時(shí)和設(shè)備要求高等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列，它具有靈敏度高、特異性好、操作簡單、快速、精確、定量、無污染及高通量等優(yōu)點(diǎn)，適合臨床實(shí)驗(yàn)室和科研開展。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列，包括固相載體、滴加在該固相載體上的Q-PCR(Real-time Quantitative PCR，Q-PCR)特異性引物以及在PCR反應(yīng)體系中添加熒光物質(zhì)，所述滴加在所述固相載體上的Q-PCR特異性引物具有SEQ ID NO=I-SEQ ID NO: 16所示的寡核苷酸序列。所述的漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列，還包括滴加在該固相載體上的 Q-PCR特異性引物作為陰性對照，其中，陰性對照Q-PCR特異性引物具有SEQ ID NO =I-SEQ ID NO :16所示的寡核苷酸序列。由于引物陣列制備時(shí)已滴加有Q-PCR特異性引物，因此，用本發(fā)明所述引物陣列檢測時(shí)僅滴加Q-PCR反應(yīng)液和基因組DNA模版。
所述固相載體為96孔PCR反應(yīng)板。所述熒光物質(zhì)為SYBR Green I。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述的漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列的制備方法，其有如下步驟1)采用亞磷酰胺三酯法合成SEQ ID NO =I-SEQ ID NO 16所示的Q-PCR特異性引物；2)將步驟1)中合成的Q-PCR特異性引物按濃度為100_300ηΜ滴加到Q-PCR反應(yīng)板中，陰性對照點(diǎn)為僅含引物而后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)不加任何基因組DNA模板的點(diǎn)樣液，制得所述的漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列。采用漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列的檢測方法，有步驟1) Q-PCR反應(yīng)混合液量的準(zhǔn)備根據(jù)96孔Q-PCR反應(yīng)板的孔數(shù)來確定Q-PCR反應(yīng)數(shù)，一般1個(gè)96孔PCR反應(yīng)板需要準(zhǔn)備100次Q-PCR反應(yīng)的2 X Q-PCR混合液(含熒光染料SYBR Green I，北京天根生化科技有限公司)，依次類推。2)將步驟1)制得的Q-PCR反應(yīng)液滴加到本發(fā)明所述引物陣列的待測標(biāo)本區(qū)；3) DNA樣品操作前的準(zhǔn)備工作為避免外源DNA對待測DNA樣品的污染，所有實(shí)驗(yàn)要嚴(yán)格遵守DNA操作的要求。在實(shí)驗(yàn)操作中，需戴口罩和一次性橡膠手套；4) DNA樣品準(zhǔn)備高質(zhì)量的DNA是基因精確檢測的首要條件，對于抽提的DNA必須保證DNA無降解、無蛋白質(zhì)污染。DNA是否有降解可通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA的質(zhì)量還可以通過紫外分光光度法檢測，質(zhì)量合格的DNA，其OD26tZOD28tl應(yīng)在1. 8 2. 0范圍內(nèi)；5) Q-PCR引物陣列采用Real-time PCR檢測儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定性PCR檢測。步驟1)中所述Q-PCR反應(yīng)液為Q-PCR特異性引物的溶液，所述Q-PCR特異性引物的寡核苷酸序列如SEQ ID NO =I-SEQ ID N0:16所示。漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列在檢測漢族人群線粒體DNA單倍型中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及的漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列是采用SYBRGreen I染料法檢測的Real-Time PCR技術(shù)，對不同樣品的線粒體DNA單倍型進(jìn)行分析的系統(tǒng)。其已把優(yōu)化并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的16對不同的Q-PCR引物按使用濃度滴加到96孔Q-PCR反應(yīng)板中， 工作人員僅需加入Q-PCR混合液、DNA及ddH20，即可上機(jī)反應(yīng)，并且所得結(jié)果可通過在線數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)(采用△ ACt分析方法)立即進(jìn)行分析。因此，本發(fā)明涉及的漢族人群線粒體 DNA單倍型檢測引物陣列相對傳統(tǒng)PCR-PRLPs分析方法和堿基序列測定，不僅可以快速、簡便、準(zhǔn)確地確定個(gè)體的線粒體DNA單倍型，并且可以分析個(gè)體患線粒體疾病的風(fēng)險(xiǎn)性。本發(fā)明所述的漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列可以用于漢族人群線粒體DNA單倍型的確定。本發(fā)明所述的漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列具有靈敏度高、特異性好、操作簡單、快速、精確、定量、無污染及高通量等優(yōu)點(diǎn)，適合臨床實(shí)驗(yàn)室和科研開展。本發(fā)明所述的熒光物質(zhì)SYBR Green I用于在檢測時(shí)發(fā)光(最大激發(fā)波長497nm， 最大發(fā)射波長是520nm)，便于觀察和分析PCR進(jìn)展和結(jié)果。SYBR GreenI是一種DNA結(jié)合染料，可以與雙鏈DNA非特異性結(jié)合。在游離狀態(tài)下，SYBRGreen I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合，其熒光增加1000倍。所以，一個(gè)反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號與PCR擴(kuò)增所獲得的雙鏈DNA量呈比列，且會隨擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而增加。該染料的優(yōu)點(diǎn)包括僅需要2 個(gè)引物，無需設(shè)計(jì)多個(gè)探針即可以快速檢驗(yàn)多個(gè)基因，低成本，且能夠進(jìn)行熔點(diǎn)曲線分析檢驗(yàn)擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例， 并配合附圖，作詳細(xì)說明如下。


圖1是本發(fā)明的漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列的 示意圖，其中1、固相載體；2、陽性對照區(qū)；3、陰性對照區(qū)；4、待測標(biāo)本區(qū)。圖2-1 圖2-8為是本發(fā)明的漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列分析漢族人群線粒體DNA單倍型的示意圖，其中圖2-1 線粒體DNA單倍型A，圖2_2 線粒體DNA單倍型B，圖2-3 線粒體DNA單倍型C，圖2-4 線粒體DNA單倍型D，圖2_5 線粒體DNA單倍型F，圖2-6 線粒體DNA單倍型G，圖2_7 線粒體DNA單倍型M7，圖2_8 線粒體DNA單倍型M9。圖3-1 圖3-8為應(yīng)用本發(fā)明的漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列進(jìn)行漢族人群線粒體DNA單倍型的檢測結(jié)果，其中圖3-1 線粒體DNA單倍型A，圖3_2 線粒體 DNA單倍型B，圖3-3 線粒體DNA單倍型C，圖3_4 線粒體DNA單倍型D，圖3_5 線粒體DNA 單倍型F，圖3-6 線粒體DNA單倍型G，圖3_7 線粒體DNA單倍型M7，圖3_8 線粒體DNA單倍型M9。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1待測樣品的制備(采用天根公司基因組DNA提取試劑盒)1.標(biāo)本的處理靜脈外周血(來源廣泛，可來自于各醫(yī)院、科研單位的患者或研究對象，本發(fā)明所述的靜脈外周血來自于中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院)取300 μ 1外周血標(biāo)本置無菌的1. 5ml EP管中，加900 μ 1紅細(xì)胞裂解液，顛倒混勻，室溫放置5分鐘，期間再顛倒幾次。10，OOOrpm離心2分鐘。棄上清，沉淀加200 μ 1緩沖液GA,震蕩混勻。2.加入20μ 1蛋白酶K，混勻。3.加入200 μ 1緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C放置10-15分鐘，溶液變清亮，簡單
離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。4.加入200 μ 1無水乙醇，充分混勻15秒，簡單離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。5.將上一步所得溶液和絮狀沉淀加入一個(gè)吸附柱CB3中，12，OOOrpm離心30秒， 倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。6.向吸附柱CB3中加入700 μ 1漂洗液⑶，12，OOOrpm離心1分鐘，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。7.向吸附柱CB3中加入700 μ 1漂洗液PW，12，OOOrpm離心1分鐘，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。8.向吸附柱CB3中加入500 μ 1漂洗液GD, 12，OOOrpm離心1分鐘，倒掉廢液。
9.將吸附柱CB3放入收集管中，12，OOOrpm離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3 置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。10.將吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加 50-100 μ 1洗脫緩沖液ΤΕ，室溫放置2-5分鐘，12，OOOrpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。-20°C保存?zhèn)溆谩?實(shí)施例2Q-PCR特異性PCR弓丨物的設(shè)計(jì)人類mtDNA是一個(gè)含16，569個(gè)堿基對的雙鏈閉環(huán)分子，負(fù)責(zé)編碼2種rRNA、22種 tRNA,以及13種參與線粒體呼吸鏈電子傳遞的多肽。

1.在www. mitomap. org網(wǎng)站上下載線粒體DNA劍橋序列(rCRS)全序列。2.利用Primer 5. 0軟件設(shè)計(jì)引物。引物設(shè)計(jì)原則1)引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性；2)引物長度一般在15 30堿基之間；3)引物GC含量在40% 60% 之間，Tm值最好接近72°C ；4)引物3'端要避開密碼子的第3位；5)引物3'端不能選擇 A，最好選擇T;6)擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)；7)引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)；8)引物的5'端可以修飾，而3'端不可修飾；9)引物5'端和中間AG值應(yīng)該相對較高，而3'端AG值較低；10)引物具有特異性；11)避免發(fā)夾結(jié)構(gòu)和自身二聚體的形成； 12)避免單一堿基的重復(fù)出現(xiàn)(不能多于4個(gè))。3.將備選引物序列提交Genbank，利用BLAST程序進(jìn)行特異性分析。4.將篩選出的引物進(jìn)行合成。實(shí)施例3檢測監(jiān)控系統(tǒng)的設(shè)計(jì)為保證檢測的可靠性，設(shè)置完善的檢測監(jiān)控系統(tǒng)，包括“是”和“非” Q-PCR特異性弓丨物、陽性對照、陰性對照。Q-PCR特異性引物序列來自于人線粒體DNA全序列，采用已知的漢族線粒體DNA單倍型基因組DNA(來源于第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院)作為陽性對照，僅含引物但不加任何DNA模板的點(diǎn)樣液作為陰性對照，陽性對照用于檢測Q-PCR熒光信號是否正確，陰性對照用于檢測引物陣列制備是否正常，陽性、陰性對照與樣品并行處理，用于監(jiān)測待檢樣品的檢測。實(shí)施例4引物陣列的制備1.點(diǎn)樣用無菌去離子水配置濃度為1 μ mol/L的引物溶液。參見圖1，本發(fā)明所述的固相載體1采用96孔Q-PCR反應(yīng)板1，在陽性對照區(qū)2、陰性對照區(qū)3以及待測標(biāo)本區(qū) 4分別滴加5微升(μ 1)引物溶液。一般1個(gè)96孔PCR反應(yīng)板需要準(zhǔn)備100次Q-PCR反應(yīng)的2 X Q-PCR混合液(含熒光染料SYBRGreen I，北京天根生化科技有限公司)。參見圖2， 在用微量移液器取引物溶液滴加于96孔Q-PCR反應(yīng)板相應(yīng)位置，包括陽性對照區(qū)、陰性對照區(qū)以及待測標(biāo)本區(qū)4。其中，線粒體DNA單倍型A引物陣列具有SEQ ID NO :1和2引物組合(圖2-1)；線粒體DNA單倍型B引物陣列具有SEQ ID NO 3和4引物組合(圖2-2)； 線粒體DNA單倍型C引物陣列具有SEQ ID NO :5和6引物組合(圖2_3)；線粒體DNA單倍型D引物陣列具有SEQ ID NO :7和8引物組合(圖2_4)；線粒體DNA單倍型F引物陣列具有SEQ ID NO 9和10引物組合(圖2_5)；線粒體DNA單倍型G引物陣列具有SEQ ID NO 11和12引物組合(圖2-6)；線粒體DNA單倍型Μ7引物陣列具有SEQ ID Ν0:13和14引物組合(圖2-7)；線粒體DNA單倍型Μ9引物陣列具有SEQ ID NO 15和16引物組合(圖 2-8)。
2.短 暫離心，使引物溶液置于96孔PCR反應(yīng)區(qū)的底部。3.用Q-PCR反應(yīng)板封膜密封上述96孔PCR反應(yīng)板。4.制備所得的引物陣列保存于+2°C +8°C備用。實(shí)施例5弓丨物陣列的檢測a.融解2 X Q-PCR混合液，上下輕微顛倒混勻，短暫離心后放置冰上待用。同時(shí)取出96孔Q-PCR反應(yīng)板，擦去表面水份并短暫離心后待用。再次確認(rèn)所使用的Real-time PCR 儀是否與本引物陣列所使用的96孔Q-PCR反應(yīng)板是否相匹配，即96孔PCR反應(yīng)板能否放入PCR儀。b.冰上進(jìn)行Q-PCR反應(yīng)液的配制(每個(gè)96孔PCR反應(yīng)板量)
權(quán)利要求
1.一種漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列，其特征在于包括固相載體、滴加在該固相載體上的Q-PCR特異性引物以及在PCR反應(yīng)體系中添加熒光物質(zhì)，所述滴加在所述固相載體上的Q-PCR特異性引物具有SEQ ID NO=I-SEQ IDNO 16所示的寡核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列，其特征在于還包括滴加在該固相載體上的Q-PCR特異性引物作為陰性對照。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列，其特征在于所述固相載體為96孔PCR反應(yīng)板。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列，其特征在于所述熒光物質(zhì)為SYBR Green I。
5.權(quán)利要求1-4任一所述的漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列的制備方法，其特征在于包含步驟1)采用亞磷酰胺三酯法合成SEQID NO =I-SEQ ID NO 16所示的Q-PCR特異性引物；2)將步驟1)中合成的Q-PCR特異性引物按濃度為100-300nM滴加到Q-PCR反應(yīng)板中， 制得所述的漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列，其陰性對照孔含有Q-PCR特異性引物。
6.采用權(quán)利要求1-4任一所述的漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列的檢測方法，其特征在于有步驟1)制備Q-PCR的反應(yīng)液；2)將步驟1)制得的Q-PCR反應(yīng)液滴加到本發(fā)明所述引物陣列的待測標(biāo)本區(qū)；3)DNA樣品準(zhǔn)備抽提無降解、無蛋白質(zhì)污染的DNA或通過紫外分光光度法檢測的DNA， 其 0D26Q/0D28Q 為 1. 8 2. 0 ；4)Q-PCR引物陣列的實(shí)時(shí)定量PCR檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于步驟1)中所述Q-PCR反應(yīng)液為Q-PCR 特異性引物的溶液，所述Q-PCR特異性引物的寡核苷酸序列如SEQ IDNO=I-SEQ ID NO 16 所示。
8.權(quán)利要求1-4任一所述的漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列在檢測漢族人群線粒體DNA單倍型中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列(Primer Array)，包括固相載體、滴加在該固相載體上的“是”和“非”實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time Quantitative PCR，Q-PCR)特異性引物以及在PCR反應(yīng)體系中添加熒光物質(zhì)，其中滴加在所述固相載體上的Q-PCR特異性引物具有SEQ ID NO1-SEQ IDNO16所示的寡核苷酸序列；本發(fā)明還涉及上述漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列的制備方法和使用方法，本發(fā)明所述的漢族人群線粒體DNA單倍型檢測引物陣列可快速、簡便地確定大量人群的線粒體DNA單倍型，具有靈敏度高、特異性好、操作簡單，不需要特殊儀器設(shè)備等特點(diǎn)，適合臨床實(shí)驗(yàn)室和科研開展。
文檔編號C40B50/06GK102277442SQ201110266160
公開日2011年12月14日 申請日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月8日
發(fā)明者吳國明, 戢福云, 李福祥, 王長征, 賀武峰, 鄭世珍, 錢桂生, 陳琰 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院