專利名稱：一種抽提牛精子線粒體dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于遺傳工程領(lǐng)域，具體涉及一種抽提牛精子線粒體DNA的方法。
背景技術(shù)：
線粒體DNA (mtDNA)是指細胞內(nèi)獨立于核基因組外的遺傳物質(zhì)，為一雙鏈 環(huán)狀、大小約為16KB并能自我復(fù)制的脫氧核糖核苷酸。線粒體在細胞凋亡、衰 老及程序化死亡中發(fā)揮有重要作用，在畜牧業(yè)，奶牛的產(chǎn)奶量和乳脂量、肉牛的 肉質(zhì)及產(chǎn)犢率等可能都與mtDNA相關(guān)(Tamassia M, et al. Evidence of oocyte donor cow effect over oocyte production and embryo development in vitro.Reproduction ， 2003, 126(5): 629 637)，最近還發(fā)現(xiàn)mtDNA單倍型與牛體外胚胎生產(chǎn)(IVP)效率有關(guān) (Tamassia M, Nuttinck F, Reynier P， et al. In vitro embyro production efficiency in cattle and its association with oocyte adenosine triphosphate content, quantity of mitochondrial DNA, and mitochondrial DNA haplogroup. Biol Reprod， 2004,71(2): 697 704)。牛精子線粒體DNA突變影響ATP的產(chǎn)生時(馮雪瑩等，寡精和嚴重 少精患者精子線粒ATPase6基因突變的研究，生殖與避孕，2006， 26(6): 336 339)， 必將影響精子活力，導致生育障礙，所以很有必要抽提牛精子線粒體DNA對其進 行研究。
普通的從全血或組織中抽提DNA的方法例如馮凱等介紹的方法(馮凱，劉興， 蔣建新。介紹一種從全血中抽提DNA的方法.第三軍醫(yī)大學學報，2004，26(4): 368 369)，包括PBS洗滌，蛋白酶K和去污劑消化，酚和氯仿純化，乙醇沉淀，TE溶 解。該方法因為使用的去污劑、即SDS不能消化掉精子的細胞膜而裂解精子，并 不適用于抽提精子線粒體DNA。
精子的線粒體位于尾部中段，為尾部鞭毛的擺動提供能量。冷凍的牛精子小管 中含有卵黃甘油等復(fù)雜物質(zhì)，用普通的抽提組織線粒體DNA方法并不可行，且精 子的線粒體在微絲的幫助下融合，它與鞭毛共同組成線粒體鞘，進一步增加了抽提精子線粒體DNA的難度。 一個卵母細胞含高達105到IOS的線粒體NDA拷貝，而 一個成熟的精子中僅含有100個線粒體DNA拷貝，所以從精子中抽提DNA十分 不易。
目前沒有有效的抽提精子線粒體DNA的方法，因此要想獲得大量的DNA，必 須首先分離線粒體。目前與此最為接近的是從組織中抽提線粒體DNA，它主要是 通過差速離心法分離線粒體(尚濤等，提取分離肺臟線粒體的方法研究，河北醫(yī) 藥，2006， 28 (4): 252-253)，在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于 分離不同大小的細胞和細胞器，在差速離心中細胞器沉降的順序依次為核、線粒 體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。差速離心只用于 分離大小懸殊的細胞，更多用于分離細胞器。通過差速離心可將細胞器初步分離， 常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。而且這種離心分離需要超速離心機，機 器設(shè)備成本巨大，且需要額外的試劑，不適合于推廣應(yīng)用。
低滲技術(shù)普通應(yīng)用于細胞顯微鏡觀察，但用于抽提線粒體DNA目前未見有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本申請的發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，采用低滲溶液裂解牛精子后，再使用常規(guī)抽提
線粒體DNA的方法，可以成功地獲得牛精子線粒體DNA。
因此，本發(fā)明的目的就在于提供一種抽提牛精子線粒體DNA的方法。 本發(fā)明的抽提牛精子線粒體DNA的方法，包括采用低滲溶液裂解牛精子。 根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施例，所述低滲溶液優(yōu)選的是滲透壓在0 100 Osm
的溶液。
根據(jù)本發(fā)明，所述低滲溶液裂解的時間為0.5 24小時。 根據(jù)本發(fā)明，所述低滲溶液裂解的溫度為10 50°C。
根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)低滲溶液裂解后的牛精子，進一步采用常規(guī)抽提線粒體DNA 的步驟即可獲得牛精子線粒體DNA，這些步驟包括
1、 離心棄上清；
2、 加入STE懸??；
43、 加入蛋白酶K和10。/。的SDS消化蛋白質(zhì)；
4、 加入飽和酚和氯仿/異戊醇以去除蛋白質(zhì)，離心后取上清；
5、 上清加入NaAc混勻，再加入無水乙醇沉淀；
6、 離心棄上清，再用乙醇洗滌沉淀；
7、 離心后室溫風干。
本發(fā)明的方法無需昂貴的機器設(shè)備，使用常規(guī)試劑，操作方法簡單易行，冷凍
的牛精子小管中含有卵黃甘油等復(fù)雜物質(zhì)，用普通的抽提組織線粒體DNA方法并 不可行，且精子的線粒體在微絲的幫助下融合，它與鞭毛共同組成線粒體鞘，進一 步增加了抽提精子線粒體DNA的難度，本發(fā)明解決了從冷凍的牛精子小管中抽提 線粒體DNA的難題，具有重要的生物學意義及實際的應(yīng)用價值。


圖1是滲透壓為0 Osm溶液裂解牛精子(室溫2(TC， lh)后抽提牛精子線粒 體DNA的電泳結(jié)果。
圖2是滲透壓為25 Osm溶液裂解牛精子(室溫2(TC， lh)后抽提牛精子線粒 體DNA的電泳結(jié)果。
圖3是滲透壓為50 Osm溶液裂解牛精子(室溫20。C， lh)后抽提牛精子線粒 體DNA的電泳結(jié)果。
圖4是滲透壓為75 Osm溶液裂解牛精子(室溫2(TC， lh)后抽提牛精子線粒 體DNA的電泳結(jié)果。
圖5是滲透壓為100 Osm溶液裂解牛精子(室溫20。C， lh)后抽提牛精子線 粒體DNA的電泳結(jié)果。
圖6是滲透壓為125 Osm溶液裂解牛精子(室溫20。C， lh)后抽提牛精子線 粒體DNA的電泳結(jié)果。
圖7是滲透壓為150 Osm溶液裂解牛精子(室溫2(TC， lh)后抽提牛精子線 粒體DNA的電泳結(jié)果。
圖8是滲透壓為50 Osm溶液不同裂解溫度下(lh)的抽提牛精子線粒體DNA 的電泳結(jié)果。圖9是滲透壓為50 0sm溶液不同裂解時間下(室溫2(TC)的抽提牛精子線粒 體DNA的電泳結(jié)果。
圖10是牛精子mtDNA的NlaIII酶切后電泳分析結(jié)果(1%瓊脂糖凝膠電泳， TAE緩沖液，pH8.0，電壓150V， 40分鐘)。
具體實施例方式
以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說 明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
以下實施例中，使用的牛精子購自光明乳業(yè)股份有限公司。 STE配方50MmTris， pH7.5， lmMEDTA， pH8.0， O.lMNaCl。 蛋白酶K:購自CALBIOCHEM公司。
以下實施例中，如非特別說明，所用試劑均購自TAKARA公司。 實施例1、低滲溶液濃度的確定
為摸索裂解精子最佳的滲透壓，將溶液G20Osm)(正常生理鹽水的滲透壓是 320 0sm，低于320 Osm稱為低滲溶液)稀釋為不同的滲透壓，分別在顯微鏡下觀 察，若精子破裂，尾巴伸直，標記為"+ "，若精子沒有破裂標記為"-"，觀察結(jié)果 如表1所示。
表1、合適的滲透壓的確定
滲透壓值(單位Osm)裂解情況
0+
25+
50+
75+
100+
125—
150—
200—
250一
320—由表1的結(jié)果可知，在不同滲透壓下牛精子表現(xiàn)狀態(tài)不同，牛精子在0 100 Osm可以破裂，而在〉100Osm則沒有破裂，由此確定適合用于裂解牛精子的滲透 壓為0 100 Osm。
實施例2、牛精子線粒體DNA的抽提
首先取儲存冷凍精液的小管，用溫水復(fù)蘇，然后按照以下步驟抽提牛精子線粒 體DNA:
1) 復(fù)蘇的精液于2000 rpm離心10分鐘后棄上清；
2) 分別加入lml滲透壓依次為0 Osm、 25 Osm、 50 Osm、 75 Osm、 100 Osm、 125 0sm、 150 0sm的低滲溶液，上下顛倒數(shù)次混勻，于室溫2(TC靜置1小時以裂 解精子，然后8000rpm離心5分鐘后棄上清；
3) 沉淀加入320^1 STE懸浮，用移液器吹打混勻；
4) 懸浮液中加入5^1蛋白酶K (20mg/ml)和10^1 10%的SDS，在振蕩器上充 分混勻后放入37"C水浴過夜；
5) 反應(yīng)液中加入200^1飽和酚和200^1氯仿/異戊醇充分混勻，13000rpm離心 IO分鐘，取上清；
6) 上清液先加入40^1NaAc混勻后，再加入800W預(yù)冷的無水乙醇，于-20°C 冰箱靜置2小時，然后13000rpm離心10分鐘，再加入800W 80%乙醇洗滌一次；
7) 離心后室溫風干(約l小時)，加入20pl雙蒸水溶解備用。
實施例3、牛精子線粒體DNA的檢測 3.1、引物設(shè)計
針對牛線粒體DNA設(shè)計特異的引物如下 Ph 5-CTGCAGTCTCACCATCAACC-3' P2: 5 、 -GTGTAGATGCTTGCATGTGTAAGT-3' 目的片段長1094bp。
73.2、 PCR擴增
以實施例2抽提的牛精子線粒體DNA為模板進行PCR擴增
反應(yīng)體系(25|il):模板1h1，引物(l(HiM) 1^1， ExTaq酶0.2pl， Buffer 2.5|^，
dNTP (2.5mM) 2|iil， ddH20 17，。
反應(yīng)條件94i:預(yù)變性5min， 94。C變性lmin; 58。C復(fù)性lmin， 72°〇延伸2min，
循環(huán)32次；72°C，再延伸10min。
將所得PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1 7所示。
由圖1 7的結(jié)果可知，經(jīng)過滲透壓為0 100 Osm溶液裂解后，可以容易地
抽提到牛精子線粒體DNA，而125 Osm及150 Osm溶液不能裂解牛精子，因此得
不到牛精子線粒體DNA。
3.3、 限制酶酶切鑒定
通過限制性內(nèi)切酶NlaIII對PCR產(chǎn)物進行酶切，NlaIII能夠特異性識別牛精子 線粒體DNA中的堿基序列CATG，并在序列的兩端打開磷酸二脂鍵產(chǎn)生粘性末端。
酶切條件buffer 2^1， Nlalll 0.2pl， PCR產(chǎn)物5pl，雙蒸水12.8^1，反應(yīng)體系 共20ixl， 37°水浴8個小時。
將所得酶切產(chǎn)物進行電泳，1%瓊脂糖凝膠，TAE緩沖液，pH8.0，電壓150V， 40分鐘，結(jié)果如圖IO所示。
由圖IO的結(jié)果可知，酶切后各片段的大小加起來與步驟3.2擴增的PCR片段 的大小相符，進一步證明擴增牛精子線粒體DNA成功。
實施例4、溫度和時間對低滲溶液裂解牛精子抽提線粒體DNA的影響 為了進一步摸索溫度和時間對低滲溶液裂解牛精子抽提線粒體DNA的影響進 行以下實驗
4.1、溫度
首先復(fù)蘇精子，然后使用滲透壓為50Osm溶液在不同溫度下(80°C、 65°C、 50°C、 35°C、 10°C、 4°C)裂解牛精子1小時，按照實施例2所述的步驟抽提牛精子線粒體DNA，按照實施例3所述的方法進行牛精子線粒體DNA的檢測，結(jié)果如 圖8所示。
由圖8的結(jié)果可知，在10 5(TC裂解的牛精子可以抽提得到線粒體DNA。 4.2、時間
首先復(fù)蘇精子，然后使用滲透壓為50 Osm溶液在室溫2(TC下裂解牛精子(5 分鐘、30分鐘、24小時、48小時)，按照實施例2所述的步驟抽提牛精子線粒體 DNA，按照實施例3所述方法進行牛精子線粒體DNA的檢測，結(jié)果如圖9所示。
由圖9的結(jié)果可知，在室溫下裂解30分鐘 24小時的牛精子可以抽提得到線 粒體DNA。
由圖8和圖9的結(jié)果可以看出，低滲溶液裂解牛精子的最佳條件是10 5(TC靜 置30分鐘 24小時。
權(quán)利要求
1、一種抽提牛精子線粒體DNA的方法，其特征在于所述方法包括采用低滲溶液裂解牛精子。
2、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述低滲溶液的滲透壓在0 100Osm的溶液。
3、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述低滲溶液裂解的時間為0.5 24小時。
4、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述低滲溶液裂解的溫度為10 50°C。
5、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述經(jīng)低滲溶液裂解的牛精子通 過以下步驟獲得牛精子線粒體DNA:1) 離心棄上清；2) 加入STE懸??；3) 加入蛋白酶K和1(P/。的SDS消化蛋白質(zhì)；4) 加入飽和酚和氯仿/異戊醇以去除蛋白質(zhì)，離心后取上清；5) 上清加入NaAc混勻，再加入無水乙醇沉淀；6) 離心棄上清，再用乙醇洗滌沉淀；7) 離心后室溫風干。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抽提牛精子線粒體DNA的方法，該方法采用低滲溶液裂解牛精子。本發(fā)明的方法無需昂貴的機器設(shè)備，使用常規(guī)試劑，操作方法簡單易行，解決了從冷凍的牛精子小管中抽提線粒體DNA的難題。
文檔編號C07H21/04GK101575596SQ200910051948
公開日2009年11月11日 申請日期2009年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月26日
發(fā)明者任兆瑞, 周在威, 曾溢滔, 黃淑幀 申請人:上海市兒童醫(yī)院;上海滔滔轉(zhuǎn)基因工程股份有限公司