一種與臨床原因不明的弱精子癥相關(guān)的線粒體dna的snp標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程及生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，公開了一種與臨床原因不明的弱精子癥相關(guān)的線粒體DNA的SNP標(biāo)志物及其應(yīng)用。該標(biāo)志物為C5601T，T12338C，A12361G，G13928C，A15851G，C16179T，G16291A的組合，可用于制備臨床原因不明的弱精子癥輔助診斷試劑盒，具有較好的特異性和靈敏度。
【專利說明】—種與臨床原因不明的弱精子癥相關(guān)的線粒體DNA的SNP標(biāo)志物及其應(yīng)用
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于基因工程及生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種與臨床原因不明的弱精子癥相關(guān)的線粒體DNA的SNP標(biāo)志物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]全世界約有8 — 15%的育齡夫婦具有不同程度的生育障礙，其中男方因素約占50%。研究表明，半個多世紀以來，人類精液質(zhì)量顯著下降，目前認為男性不育的發(fā)生是一個多因素、多階段的過程，是環(huán)境危險因素(外因)和個體遺傳因素(內(nèi)因)共同作用的結(jié)果。其中，個體遺傳因素包括染色體遺傳因子改變，表觀遺傳修飾異常及線粒體基因組遺傳結(jié)構(gòu)變異。線粒體基因組作為核外唯一的基因組，其遺傳結(jié)構(gòu)變異被認為是男性不育最重要的遺傳病因之一。
[0003]線粒體(mitochondria)是一個復(fù)雜的細胞器,為細胞發(fā)揮功能所需能量的主要來源。線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是一個雙鏈閉合環(huán)狀分子，包括了 16569個堿基對(登錄號為NC_012920.1 )，其上37個基因負責(zé)編碼13個呼吸鏈酶復(fù)合物亞基，22種轉(zhuǎn)運RNA (tRNA)和2種核糖體RNA (rRNA)。由于缺少組蛋白的保護和DNA修復(fù)系統(tǒng)，mtDNA的突變率是核DNA的10-100倍。ATP是精子活力的首要能量來源，它主要來自兩個途徑:無氧酵解和線粒體呼吸鏈OXPHOS (有氧氧化)途徑。經(jīng)典的理論認為精子中段線粒體形成的線粒體鞘在精子 運動過程中供給所需能量，凡影響ATP生成的任何因素，如呼吸酶抑制劑等均可直接或間接影響精子活力。研究證明，獲能前的精子主要依賴無氧酵解供能，這個過程不需線粒體參加。精子獲能以后代謝活動明顯增強，表明精子線粒體中OXPHOS產(chǎn)生大量ATP，精子出現(xiàn)一種特異的“鞭打樣”運動方式，通過此種運動方式，精子穿過卵子透明帶而受精。由此可見，當(dāng)活性氧(ROS)等自由基對mtDNA的攻擊導(dǎo)致氧化損傷或mtDNA突變影響ATP的產(chǎn)生時，必將影響精子活力，導(dǎo)致生育障礙。
[0004]目前，弱精子癥(asthenospermia)的初步診斷方法主要為病史詢問、體格檢查、精液參數(shù)、精漿生化、血性激素檢測、B超以及染色體檢測等。世界衛(wèi)生組織在男性不育的診斷檢查及處理手冊指明:弱精子癥是指精液參數(shù)中前向運動的精子(a和b級)小于50%或a級運動的精子小于25%的病癥，弱精子癥又稱精子活力低下。常規(guī)的精子活力分析目前主要依靠精子活力判別(人工計數(shù)或利用計算機輔助系統(tǒng)分析，即CASA)，尚無其他有效的手段，但其自身存在一定的缺陷，如個體精液質(zhì)量波動較大，尤其易受到禁欲天數(shù)、溫度、采集精液方法等因素的影響，從而造成精子活力測量不準確；對相應(yīng)疾病的早期診斷效果也遠不能滿足需要。盡管目前國內(nèi)外研究者正努力探索新的弱精子癥診斷生物標(biāo)志物，并對現(xiàn)有評估手段進行有效的補充，但一直難以突破傳統(tǒng)生物標(biāo)志物發(fā)展和男性生殖實際應(yīng)用中的瓶頸，即精液質(zhì)量分析結(jié)果波動、早期診斷困難等。此外，由于病因不明，缺乏有效的治療手段，大多數(shù)弱精子癥病人只能選擇ICSI或AID等輔助生育手段，不僅無法滿足心理上的要求，而且有可能出現(xiàn)后代的遺傳缺陷。[0005]研究表明，遺傳因素是引起男性不育的主要因素，線粒體遺傳變異在其中起重要作用。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。遺傳變異的存在被認為賦予了個體不同的表型性狀，以及對于環(huán)境暴露、藥物治療等因素的不同反應(yīng)性，因此遺傳變異可能是導(dǎo)致個體對常見疾病發(fā)病和預(yù)后易感性差異的重要遺傳基礎(chǔ)。目前還沒有將線粒體DNA遺傳變異應(yīng)用于弱精子癥診斷的報道，若能篩選出弱精子癥易感的線粒體DNA遺傳變異作為生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的診斷試劑盒，對弱精子癥的診斷現(xiàn)狀必將是一次有力的推動，也為其藥物篩選、藥效評價及靶向治療開辟了新的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)問題，提出一種與臨床原因不明的弱精子癥輔助診斷相關(guān)的線粒體DNA遺傳變異標(biāo)志物及含有該標(biāo)志物的基因。
[0007]本發(fā)明的第二個目的是提供上述線粒體DNA遺傳變異標(biāo)志物的特異性擴增引物。
[0008]本發(fā)明的第三個目的是提供上述線粒體DNA遺傳變異標(biāo)志物的特異性延伸引物。
[0009]本發(fā)明的第四個目的是提供上述線粒體DNA遺傳變異標(biāo)志物及其特異性擴增引物和特異性延伸引物在制備弱精子癥輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的第五個目的是提供弱精子癥輔助診斷試劑盒。
[0011]發(fā)明人通過分離和研究臨床原因不明的弱精子癥患者及與其年齡匹配的健康男性對照外周血線粒體DNA遺傳變異(SNP)，尋找一組與弱精子癥高度相關(guān)的高特異性和敏感性的線粒體DNA遺傳變異，并研制出可便于臨床應(yīng)用的弱精子癥輔助診斷試劑盒，為臨床原因不明的弱精子癥的篩查和診斷提供數(shù)據(jù)支持，為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價值的新型小分子藥物提供數(shù)據(jù)支持。
[0012]本發(fā)明的目的是通`過下列技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0013]一種與臨床原因不明的弱精子癥輔助診斷相關(guān)的線粒體DNA的SNP標(biāo)志物，該SNP標(biāo)志物為線粒體 DNA 的 C5601T, T12338C, A12361G, G13928C, A15851G, C16179T, G16291A。
[0014]一種與臨床原因不明的弱精子癥輔助診斷相關(guān)的基因，該基因的序列為登錄號為NC_012920.1 的線粒體 DNA 序列中存在下列 SNP:C5601T, T12338C, A12361G, G13928C, A15851G, C16179T, G16291A0
[0015]用于檢測所述的線粒體DNA遺傳變異標(biāo)志物的特異性擴增引物，這些引物為:
[0016]C5601T 的引物序列為 SEQ ID No:l 和 SEQ ID No: 2 ;T12338C 的引物序列為 SEQ IDNo:4 和 SEQ ID No:5 ;T12361G 的引物序列為 SEQ ID No:7 和 SEQ ID No:8 ;G13928C 的引物序列為 SEQ ID No: 10 和 SEQ ID No: 11 ;A15851G 的引物序列為 SEQ ID No: 13 和 SEQ IDNo:14 ;C16179T 的引物序列為 SEQ ID No: 16 和 SEQ ID No: 17 ;G16291A 的引物序列為 SEQID No:19 和 SEQ ID No:20。
[0017]用于檢測所述的線粒體DNA遺傳變異標(biāo)志物的特異性延伸引物序列，這些延伸引物序列為:
[0018]C5601T的延伸引物序列為SEQ ID No:3 ;T12338C的延伸引物序列為SEQ IDNo:6 ;A12361G的延伸引物序列為SEQ ID No:9 ;G13928C的延伸引物序列為SEQ ID No:12 ；A15851G的延伸引物序列為SEQ ID No: 15 ;C16179T的延伸引物序列為SEQ ID No: 18;G16291A的延伸引物序列為SEQ ID No:21。[0019]所述的SNP標(biāo)志物在制備臨床原因不明的弱精子癥輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0020]所述的基因在制備臨床原因不明的弱精子癥輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0021]所述的特異性擴增引物和/或特異性延伸引物在制備臨床原因不明的弱精子癥輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0022]一種臨床原因不明的弱精子癥輔助診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測外周血DNA中C5601T, T12338C, A12361G, G13928C, A15851G, C16179T, G16291A。
[0023]所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有所述的特異性擴增引物和/或所述的特異性延伸引物。
[0024]所述診斷試劑盒，該試劑盒還包括PCR技術(shù)常用的試劑。
[0025]具體地說，本發(fā)明解決問題的技術(shù)方案包括:(1)建立統(tǒng)一標(biāo)準的標(biāo)本庫和數(shù)據(jù)庫:以標(biāo)準操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床資料。(2)基因型檢測:選擇臨床原因不明的弱精子癥病例、與臨床原因不明的弱精子癥病例年齡匹配的健康男性對照，利用Illumina測序技術(shù)，在線粒體全基因組范圍內(nèi)找出與臨床原因不明的弱精子癥相關(guān)的線粒體DNA遺傳變異。(3)對篩選出的陽性關(guān)聯(lián)線粒體遺傳變異，進一步在大樣本人群中進行檢測，以判斷其關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定性。(4)弱精子癥輔助診斷試劑盒的研制:根據(jù)弱精子癥病例和健康男性對照中基因型分布頻率有顯著差異的線粒體遺傳變異開發(fā)線粒體遺傳變異輔助診斷試劑盒。
[0026]本發(fā)明人以標(biāo)準操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料、臨床資料等，并采用了 Illumina測序技術(shù)進行線粒體全基因組掃描，SNaPshot基因分型進行單個位點的檢測等。
[0027]具體來說研究的實 驗方法主要包括以下幾個部分:
[0028]1.研究樣本的選擇
[0029](I)重復(fù)精液質(zhì)量檢測，確診為弱精子癥；
[0030](2)性功能正常；排除具有隱睪癥病史、睪丸炎、輸精管梗阻、輸精管切除術(shù)、多染色體異常及Y染色體無精子癥因子微缺失等具有已知病因的患者
[0031](3)與病例年齡匹配的健康男性對照
[0032]本研究共采用1724例符合標(biāo)準的樣本進行研究。
[0033]2.酚-氯仿法提取外周血基因組DNA，按常規(guī)方法操作。通常能得到20_50ng/μ IDNA，純度(紫外2600D與2800D比值)在1.6-2.0。
[0034]3.線粒體DNA基因組全測序
[0035](I)取受試者全基因組DNA樣本；
[0036](2)利用Illumina測序技術(shù)進行線粒體全基因組掃描；
[0037](3)檢測并比較各基因型在弱精子癥病例與健康男性對照中的分別差異。
[0038]4.遺傳變異位點的SNaPshot基因分型
[0039](I)取受試者DNA樣本；
[0040](2)設(shè)計單個遺傳變異的特異性多重PCR引物和單堿基延伸引物；
[0041](3)進行多重PCR反應(yīng)和延伸反應(yīng)；
[0042](4)檢測并比較臨床原因不明的弱精子癥病例與健康男性對照中不同基因型的分
布差異。[0043]5.診斷試劑盒制備方法
[0044]利用Illumina測序技術(shù)進行全基因組掃描和單個遺傳變異檢測后確定臨床原因不明的弱精子癥病例與健康男性對照中基因型分布頻率有顯著差異的遺傳變異，作為臨床原因不明的弱精子癥診斷的指標(biāo)。最后篩選出的與臨床原因不明的弱精子癥發(fā)病有關(guān)的遺傳變異組成輔助診斷試劑盒(用于檢測C5601T，T12338C, A12361G, G13928C, A15851G, C16179T, G16291A)。診斷試劑可以包括這些變異位點的特異性引物和特異性延伸引物，以及Taq酶、dNTP等試劑。
[0045]6.統(tǒng)計分析方法 [0046]運用卡方檢驗(用于分類變量)或者student t檢驗(用于連續(xù)性變量)比較人口學(xué)特征等在研究對象組間分布的差異。用Logistic回歸分析中的additive模型進行關(guān)聯(lián)分析。
[0047]為了進一步研究這7個遺傳變異構(gòu)成的綜合指征用于早期診斷的效果，我們構(gòu)建了一個數(shù)學(xué)公式，綜合考慮每個遺傳變異位點與臨床原因不明的弱精子癥發(fā)病的正、負關(guān)聯(lián)情況和聯(lián)系強度。具體來說，我們對每個遺傳變異位點的二種基因型進行評分，野生純合型=“0”，變異純合型=“2”，以單個SNP分析時的additive模型下的回歸系數(shù)為權(quán)重，綜合考慮每個SNP的情況給每個研究對象確定一個危險分值。危險分值的計算方法如下:危險分值=(0.95XC5601T 的評分)+ (1.18 X T12338C 的評分)+ (1.00 X A12361G 的評分)+ (0.48XG13928C 的評分)+ (1.30XA15851G 的評分)+ (1.10XC16179T 的評分)+(0.90XG16291A的評分)，獲得的危險分值系數(shù)以及界限值被直接應(yīng)用于全基因組關(guān)聯(lián)研究的470例樣本中。(以C5601T為例:0.95為C5601T變異位點的回歸系數(shù)(見表1);C5601T的評分，由于線粒體只有2種基因型，若這個點為CC (野生純合型)則賦值為O分，若為TT(變異純合型)則賦值為2分。某個SNP是野生純合型還是變異純合型由儀器檢測結(jié)果確定；某個樣本的總評分是這7個SNP分別評分的總和，單個SNP的基因型只是計算評分的一個中間過程，不需要知道具體基因型。)
[0048]統(tǒng)計學(xué)分析均通過專門的統(tǒng)計學(xué)分析軟件完成(PLINK1.07)。統(tǒng)計學(xué)顯著性水平P值設(shè)為0.05，所有統(tǒng)計學(xué)檢驗均為雙側(cè)檢驗。
[0049]以下是本發(fā)明進一步的說明:
[0050]在236例符合條件的臨床原因不明的弱精子癥病例及234例健康男性對照中，兩組年齡均衡可比。我們將這兩組人群經(jīng)Illumina測序技術(shù)進行線粒體全基因組掃描獲得相關(guān)結(jié)果。
[0051]根據(jù)全基因組檢測結(jié)果，本發(fā)明人檢測到在“臨床原因不明的弱精子癥病例”組和“健康男性對照”組中基因型分布頻率存在差異的遺傳變異包括:C5601T，T12338C，A12361G，G13928C, A15851G, C16179T, G16291A。
[0052]根據(jù)上述檢測結(jié)果，我們將這7個與臨床原因不明的弱精子癥發(fā)病相關(guān)的遺傳變異在另外688例臨床原因不明的弱精子癥病例和與其年齡匹配的566例健康男性對照中進行了單個遺傳變異的檢測，結(jié)果與全基因組檢測一致。
[0053]單因素和多因素Logistic回歸分析結(jié)果均表明，這7個遺傳變異與臨床原因不明的弱精子癥的發(fā)病存在著顯著關(guān)聯(lián)，7個遺傳變異均是危險因素，變異等位基因可增加臨床原因不明的弱精子癥的發(fā)病風(fēng)險。[0054]進一步分析這7個遺傳變異的組合用于臨床原因不明的弱精子癥診斷的效果，發(fā)現(xiàn)其組合能夠很好的區(qū)分病例與對照。
[0055]根據(jù)上述實驗結(jié)果，本發(fā)明人制備了一種能用于臨床原因不明的弱精子癥輔助診斷的試劑盒，包含測定受試者血標(biāo)本DNA中上述遺傳變異的特異性引物、特異性延伸引物和/或其他檢測試劑。
[0056]具體而言，這7個遺傳變異的組合，或者這7個遺傳變異的特異性引物及特異性延伸引物的組合構(gòu)成的相關(guān)診斷試劑盒有助于臨床原因不明的弱精子癥的輔助診斷，為臨床醫(yī)生快速準確掌握患者的疾病狀態(tài)和病情嚴重程度，及時采取更具個性化的防治方案提供支持。
[0057]本發(fā)明有益效果:
[0058]本發(fā)明提供的遺傳變異標(biāo)志物作為臨床原因不明的弱精子癥輔助判斷的標(biāo)志物的優(yōu)越性在于:
[0059]( I)遺傳變異位點是一種新型基因生物標(biāo)志物，區(qū)別于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物,穩(wěn)定、微倉IJ、易于檢測，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類生物標(biāo)志物的成功開發(fā)將為臨床原因不明的弱精子癥的診斷和治療開創(chuàng)全新局面，為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供借鑒。
[0060](2)遺傳變異位點試劑盒是一種系統(tǒng)、全面的診斷試劑盒，可用于臨床原因不明的弱精子癥的輔助診斷，為臨床醫(yī)生快速準確掌握患者病情、及時采取更具個性化的防治方案提供支持。
[0061](3)采用嚴密的驗證和評價體系，本發(fā)明人初期采用全基因組測序以獲取疾病相關(guān)的遺傳變異譜，并應(yīng)用SNaP`shot基因分型方法在大樣本中進行了驗證；以上方法和策略的應(yīng)用加速和保證了遺傳變異生物標(biāo)志物和診斷試劑盒在臨床上的應(yīng)用，也為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供方法和策略上的借鑒。
[0062]本發(fā)明通過控制年齡等對疾病發(fā)展的影響因素，研究遺傳變異在臨床原因不明的弱精子癥輔助診斷的應(yīng)用前景，闡述遺傳變異對于臨床原因不明的弱精子癥進展的影響，揭示其診斷價值。因此，本發(fā)明獲得了臨床原因不明的弱精子癥發(fā)病相關(guān)遺傳變異譜和特異性標(biāo)志物；通過遺傳變異生物標(biāo)志物和診斷試劑盒的研制和應(yīng)用，可使得臨床原因不明的弱精子癥的診斷更加方便易行，為臨床醫(yī)生快速準確掌握患者病情，為臨床治療效果評價奠定基礎(chǔ)，并為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價值的新型小分子藥物靶標(biāo)提供幫助。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0063]圖1為健康男性對照組和臨床原因不明的弱精子癥病例組之間的ROC曲線?！揪唧w實施方式】
[0064]實施例1樣品的收集和樣品資料的整理
[0065]發(fā)明人于2007年6月4月開始至2011年I月從南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)中心收集了大量的臨床原因不明的弱精子癥患者血標(biāo)本，通過對樣品資料的整理，發(fā)明人從中選擇了 1724例符合下列標(biāo)準的樣本全基因組芯片掃描和單個SNP SNaPshot基因分型的實驗樣品:[0066]1、重復(fù)精液質(zhì)量檢測，確診為弱精子癥；
[0067]2、性功能正常；排除具有隱睪癥病史、睪丸炎、輸精管梗阻、輸精管切除術(shù)、多染色體異常及Y染色體無精子癥因子微缺失等具有已知病因的患者；
[0068]3、與病例年齡匹配的健康男性對照。
[0069]并系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學(xué)資料和臨床資料等情況。
[0070]實施例2外周血DNA中SNP的全基因組掃描
[0071]在上述符合條件的236例臨床原因不明的弱精子癥患者和234例健康男性對照中，兩組年齡匹配。將這兩組人群經(jīng)Illumina全測序獲得相關(guān)結(jié)果。具體步驟為:
[0072]1、向儲存于2ml凍存管中的血細胞加入溶血試劑(即裂解液，40份量配置方法如下:蔗糖 219.72g、氯化鎂 2.02g 和曲拉通 X-100 (amresco0694) 20ml 混合后，用 TrisHcl溶液定容至2000ml,下同),顛倒混勻后完全轉(zhuǎn)入。
[0073]2、去除紅細胞:用溶血試劑將5ml離心管補至4ml,顛倒混勻,4000rpm離心10分鐘，棄上清。向沉淀中加入4ml溶血試劑,再次顛倒混勻清洗一次,4000rpm離心10分鐘,棄上清。
[0074]3、抽提DNA:向沉淀中加Iml抽提液(每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化鈉，14.4ml 0.5M乙二胺四 乙酸，15ml 10%十二烷基硫酸鈉，148.1ml雙蒸水，下同)和8 μ I蛋白酶K，震蕩器上充分震蕩混勻，37°C水浴過夜。
[0075]4、去除蛋白質(zhì):加Iml Tris-平衡酹充分混勻(手輕搖15分鐘),4000rpm離心10分鐘，取上清轉(zhuǎn)入新的5ml離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液(氯仿:異戊醇=24:1，v/v，下同)，充分混勻后(手搖15分鐘)，4000rpm離心10分鐘，取上清(分入兩個1.5ml的離心管)。
[0076]5、DNA沉淀:在上清液中加入3M的醋酸鈉60 μ I,再加入與上清液等體積的冰無水乙醇，上下輕搖，可見白色絮狀沉淀物，再以12000rpm離心lOmin。
[0077]6、DNA洗漆:在沉淀中加入冰無水乙醇lml, 12000rpm離心IOmin,棄上清后真空
抽干或置于清潔干燥環(huán)境中蒸干。
[0078]7、測量濃度:通常能得到20-50ng/ μ I DNA,純度(紫外2600D與2800D比值)在1.6_2.0 ο
[0079]8、進行全測序:利用Illumina測序技術(shù)進行線粒體全基因組掃描。
[0080]9、數(shù)據(jù)分析與處理:在“臨床原因不明的弱精子癥病例”組和“健康男性對照”組中發(fā)現(xiàn)的基因型分布頻率有顯著差異的遺傳變異在上文中已經(jīng)羅列出，結(jié)果見表1。
[0081]表1:病例組與對照組全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種與臨床原因不明的弱精子癥輔助診斷相關(guān)的線粒體DNA的SNP標(biāo)志物，其特征在于該標(biāo)志物為 C5601T, T12338C, A12361G, G13928C, A15851G, C16179T, G16291A 的組合。
2.一種與臨床原因不明的弱精子癥輔助診斷相關(guān)的基因，其特征在于該基因的序列為登錄號為NC_012920.1的線粒體DNA序列中存在下列SNP:C5601T, T12338C, A12361G, G13928C, A15851G, C16179T, G16291A。
3.用于檢測權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)志物的特異性擴增引物，其特征在于該擴增引物為: C5601T的引物序列為SEQ ID No:l和SEQ ID No:2 ;T12338C的引物序列為SEQ IDNo:4 和 SEQ ID No:5 ;T12361G 的引物序列為 SEQ ID No:7 和 SEQ ID No:8 ;G13928C 的引物序列為 SEQ ID No: 10 和 SEQ ID No: 11 ;A15851G 的引物序列為 SEQ ID No: 13 和 SEQ IDNo:14 ;C16179T 的引物序列為 SEQ ID No: 16 和 SEQ ID No: 17 ;G16291A 的引物序列為 SEQID No:19 和 SEQ ID No:20。
4.用于檢測權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物，其特征在于該延伸引物為: C5601T的延伸引物序列為SEQ ID No:3 ;T12338C的延伸引物序列為SEQ ID No:6 ；A12361G的延伸引物序列為SEQ ID No:9 ;G13928C的延伸引物序列為SEQ ID No:12 ；A15851G的延伸引物序列為SEQ ID No: 15 ;C16179T的延伸引物序列為SEQ ID No: 18;G16291A的延伸引物序列為SEQ ID No:21。
5.權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)志物在制備臨床原因不明的弱精子癥輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。`
6.權(quán)利要求2所述的基因在制備臨床原因不明的弱精子癥輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求3所述的特異性擴增引物和/或權(quán)利要求4所述的特異性延伸引物在制備臨床原因不明的弱精子癥輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
8.一種臨床原因不明的弱精子癥輔助診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒用于檢測外周血 DNA 中 C5601T, T12338C, A12361G, G13928C, A15851G, C16179T, G16291A。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求2所述的特異性擴增引物和/或權(quán)利要求3所述的特異性延伸引物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒還包括PCR技術(shù)常用的試劑。
【文檔編號】C12N15/11GK103773859SQ201410012282
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月10日
【發(fā)明者】陸春城, 王嶸, 夏彥愷, 吳煒, 許妙斐, 秦玉峰, 陳敏健, 杜桂珍, 王心如 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)