本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于基因組改組的吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株的育種方法。

背景技術(shù)：

吩嗪-1-甲酰胺(PCN)是一種有效的新型生物農(nóng)藥，具有廣譜的抑制植物病原真菌的作用。綠針假單胞菌HT66(Pseudomonas chlororaphis HT66)CCTCCNO:M2013467是從水稻根際土壤中分離到一株產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺(PCN)的綠針假單胞菌，安全性很高，且PCN產(chǎn)量高達(dá)420mg/L，是國(guó)際上報(bào)道的吩嗪化合物產(chǎn)量最高的野生株。該菌分泌吩嗪化合物的能力很強(qiáng)，能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)合成的吩嗪化合物快速運(yùn)輸?shù)桨?，在培養(yǎng)基中形成綠色晶體，不僅降低了代謝調(diào)控中的反饋抑制現(xiàn)象，具有高產(chǎn)PCN的巨大潛力，而且綠色晶體可以作為篩選指標(biāo)，有利于PCN高產(chǎn)菌株的選育。

PCN具有良好的應(yīng)用前景，對(duì)此開展高產(chǎn)菌株的選育，有利于其工業(yè)應(yīng)用。目前，經(jīng)過(guò)十輪的物理和化學(xué)方法誘變，PCN產(chǎn)量提高了很多；但是由于前期誘變引入的負(fù)突變較多，后期繼續(xù)以誘變育種的方法提高PCN產(chǎn)量的難度較大。

1998年Maxygen公司的Stemmer等人提出了一種新的分子育種方法——全基因組重排技術(shù)(genome shuffling)，這種技術(shù)是分子定向進(jìn)化在全基因組水平上的延伸，它將重組的對(duì)象從單個(gè)基因擴(kuò)展到整個(gè)基因組，因此可以在更為廣泛的范圍內(nèi)對(duì)菌種的目的性狀進(jìn)行優(yōu)化組合。

基因組重排的原理是，首先通過(guò)誘變育種得到一個(gè)含有各種不同正突變的基因組庫(kù)，然后通過(guò)原生質(zhì)體的融合將這些正突變菌株的基因組進(jìn)行隨機(jī)重組，并篩選目的性狀得到進(jìn)一步改進(jìn)的菌株來(lái)進(jìn)行下一輪基因組重排，這樣可以快速、高效地選育出表型得到較大改進(jìn)的雜交菌種?；蚪M重排技術(shù)提出后的短短幾年時(shí)間，在菌種改進(jìn)方面已經(jīng)取得了很突出的成果。

Zhang等[Zhang Y，Perry K，Vinci V，et al.Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria，Nature，2002，415:644-646]通過(guò)基因組重排提高了弗氏鏈霉菌的泰樂(lè)菌素產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)在經(jīng)過(guò)一輪誘變和兩輪基因組重排篩選得到高產(chǎn)菌株，其生產(chǎn)能力與通過(guò)20輪連續(xù)誘變篩選得到的泰樂(lè)菌素高產(chǎn)菌株生產(chǎn)能力相同，這說(shuō)明基因組重排在育種方面可以更加快速有效。

Hida等[Hida H，Yamada T，et al.Genome shuffling of Streptomyces sp U121for improved production of hydroxycitric acid.Applied Microbiology and Biotechnology，2007，73(6):1387-1393]利用基因組重排的方法改進(jìn)了Streptomyces sp.U121生產(chǎn)HCA的能力，實(shí)驗(yàn)中用亞硝基胍處理誘變來(lái)處理U121的孢子，得到突變株進(jìn)行原生質(zhì)體融合，三輪融合后篩選到高產(chǎn)融合子，其產(chǎn)量比野生型菌株提高5倍。

在國(guó)內(nèi)，也有類似的通過(guò)基因組重排方法來(lái)進(jìn)行菌種的育種從而提高產(chǎn)品產(chǎn)量，如梁惠儀[梁惠儀，郭勇.全基因組重排育種技術(shù)提高豆豉纖溶酶菌產(chǎn)酶量.中國(guó)生物工程雜志，2007，27(10):39－43]等通過(guò)對(duì)DC-12進(jìn)行紫外誘變和亞硝基胍誘變構(gòu)建突變庫(kù)，以篩選到的4株誘變菌株作為融合親本，采用電融合的方法進(jìn)行基因組重排，結(jié)合雙滅活的篩選方法，篩選出的菌株比親本菌株的酶活提高了4～5倍。

浙江大學(xué)朱惠等[朱惠，金志華，岑沛霖.納他霉素產(chǎn)生菌基因組重排育種.中國(guó)抗生素雜志，2006，31(12):739-742]將Streptomyces gilvosporeus SG21原生質(zhì)體經(jīng)紫外線誘變并篩選鏈霉素抗性菌株，在高產(chǎn)突變株中選擇4株作為親本進(jìn)行基因組重排育種，篩選得到了高產(chǎn)重組菌株，其產(chǎn)量比原始出發(fā)菌株提高1.17倍。

總之，在微生物育種方面，基因組重排有很多的應(yīng)用研究，也有很大的應(yīng)用潛力?；蚪M重排(Genome shuffling)技術(shù)是自2002年發(fā)展起來(lái)的一種新型的微生物育種方法，通過(guò)原生質(zhì)體的遞歸融合使正向突變的表型快速聚集。在理論上這種方法相較于傳統(tǒng)誘變選育能夠更快速的改良菌株。然而，采用該技術(shù)用于吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株的育種尚未見有相關(guān)報(bào)道。此外，傳統(tǒng)的基因組改組方法需要預(yù)先對(duì)融合前的兩株親本進(jìn)行分別標(biāo)記，包括整合型標(biāo)記、遺傳缺陷型標(biāo)記、抗藥性標(biāo)記等，然后根據(jù)標(biāo)記篩選融合子，最后從融合子中篩選高產(chǎn)株，因此該方法的步驟繁瑣、工作難度較大，實(shí)施周期長(zhǎng)，而且有些標(biāo)記可能對(duì)染色體造成損害。本專利旨在優(yōu)化融合條件，提高融合效率，以多株正突變株進(jìn)行隨機(jī)融合，直接篩選高產(chǎn)株以縮短育種時(shí)間。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種基于基因組改組的吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株的育種方法。本發(fā)明的方法無(wú)需對(duì)誘變獲得的高產(chǎn)菌株進(jìn)行標(biāo)記，而且直接以高通量篩選的方法獲得高產(chǎn)PCN的融合子，大大提高了工作效率。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種基于基因組改組的吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株的育種方法，包括以下步驟：

A、以綠針假單胞菌HT66為出發(fā)株，通過(guò)誘變處理獲得含有各種不同正突變的基因組庫(kù)，然后篩選出高PCN產(chǎn)量的若干株突變菌株；

B、將突變菌株進(jìn)行原生質(zhì)體制備、原生質(zhì)體融合，篩選出高PCN產(chǎn)量的融合子。

優(yōu)選地，步驟A中，所述誘變處理包括物理誘變和/或化學(xué)誘變。

優(yōu)選地，步驟B中，所述原生質(zhì)體制備包括以下步驟：所述原生質(zhì)體制備具體采用以下步驟：將突變菌株重懸于SMM緩沖液中，添加溶菌酶、滲透壓穩(wěn)定劑和螯合劑進(jìn)行酶解，然后離心吸去溶液，用磷酸緩沖液清洗后重懸，得原生質(zhì)體懸浮液。

優(yōu)選地，所述溶菌酶的濃度為0.2mg/mL，滲透壓穩(wěn)定劑為濃度0.5M甘露醇，螯合劑為濃度0.1％的EDTA；所述酶解時(shí)間為1h，突變菌株的菌齡為18h。所述EDTA的濃度為質(zhì)量濃度，0.1g/100mL。

優(yōu)選地，所述SMM緩沖液中含有以下濃度的各組分：蔗糖0.5mol/L，順丁烯二酸20mmol/L，六水合氯化鎂20mmol/L。

優(yōu)選地，步驟B中，所述原生質(zhì)體融合包括以下步驟：將突變株的原生質(zhì)體懸浮液混合，離心，去上清液后，加入磷酸緩沖液，吹打原生質(zhì)體沉淀重新懸浮；再加入PEG和DMSO，定溶后充分混勻，水浴中保溫靜置即可。

優(yōu)選地，所述DMSO添加量為1％，所述PEG的濃度為35％，PEG分子量為8000。所述DMSO添加量為質(zhì)量添加量，1g/100mL；PEG的濃度為質(zhì)量濃度，35g/100mL。

優(yōu)選地，所述原生質(zhì)體懸浮液混合前，需將菌株分別置于70℃條件下處理15min或者750W的微波爐中低熱檔處理50s。

優(yōu)選地，所述水浴溫度為32℃，所述保溫靜置時(shí)間為5分鐘。

優(yōu)選地，步驟B中，所述篩選的方法包括以下步驟將經(jīng)原生質(zhì)體融合后獲得的融合子進(jìn)行稀釋涂布培養(yǎng)，根據(jù)菌落上綠色晶體的產(chǎn)量進(jìn)行篩選，即可獲得高PCN產(chǎn)量的融合子。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

1、本發(fā)明采用誘變處理和基因組改組技術(shù)對(duì)綠針假單胞菌HT66的突變株進(jìn)行篩選，并獲得了一種吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株，與出發(fā)株相比，其吩嗪-1-甲酰胺的產(chǎn)量最高提高了2.8倍。

2、本發(fā)明優(yōu)化了原生質(zhì)體制備與融合的相關(guān)參數(shù)，提高了基因組改組的效率。

3、本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單，無(wú)需進(jìn)行標(biāo)記，縮短了育種周期，大大節(jié)省勞動(dòng)成本。

附圖說(shuō)明

通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制備的高產(chǎn)融合子的PCN產(chǎn)量變化圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2制備的高產(chǎn)融合子的PCN產(chǎn)量變化圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

1.1 NTG誘變與初篩

本實(shí)施例以綠針假單胞菌HT66為出發(fā)株，采用化學(xué)誘變劑處理獲得高產(chǎn)的突變株。所述的誘變處理可以為NTG誘變，但不限于該方法。采用NTG誘變處理時(shí)，其步驟如下：

配制濃度為10g/L的NTG母液，使用時(shí)按比例稀釋。吸取1mL對(duì)數(shù)期菌懸液，用無(wú)菌0.01mol/L的PBS緩沖液(pH7.4)洗滌菌體兩次；加入1mL PBS緩沖液重懸菌體，加入適量的NTG母液，使NTG終濃度為50、100、200、500、1000g/L，28℃處理20min；加入0.5mL 1mol/L的NaCl溶液終止反應(yīng)，使用無(wú)菌培養(yǎng)基洗滌菌體3次徹底去除殘留NTG，適量稀釋后涂布平板，24h后計(jì)數(shù)平板上長(zhǎng)出的菌落個(gè)數(shù)，得到致死率。當(dāng)NTG處理劑量為100ppm時(shí)，菌株HT66的致死率約為75％。因此，首次使用NTG誘變的處理濃度為100ppm，以同樣的方法進(jìn)行誘變處理。

培養(yǎng)至平板上的菌落可以明顯看出有綠色結(jié)晶，觀察菌落的大小，以及綠色結(jié)晶出現(xiàn)時(shí)間的早晚和綠色結(jié)晶的多少，根據(jù)這三點(diǎn)直接篩選出產(chǎn)量較高的四個(gè)單菌落，分別為1，2，3，4。分別挑取4個(gè)菌株的單菌落接種于5mL液體培養(yǎng)基的小瓶中，放置于28℃，180rpm的搖床上培養(yǎng)48h后取樣，每個(gè)樣品中加入1mL的乙腈，并且充分振蕩混勻溶解樣品。將乙腈溶解的抽提物用0.22μm有機(jī)相濾頭過(guò)濾至進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

色譜柱采用島津WondaSil-WR C-18反相柱(5μm×250mm)，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，流速為1mL/min，柱溫為30℃。檢測(cè)條件為：0-2min：乙腈8％，5mmol/L乙酸銨92％；2-20min：乙腈由8％升至60％，5mmol/L乙酸銨由92％降至40％；20-21min：乙腈8％，5mmol/L乙酸銨92％。

將篩選的四株產(chǎn)量較高的菌株1(HT66-N1)，2(HT66-N2)，3(HT66-N3)，4(HT66-N4)以及出發(fā)株(HT66)分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，取樣以HPLC產(chǎn)量測(cè)定峰面積并計(jì)算出PCN的實(shí)際產(chǎn)量，測(cè)定結(jié)果如下表1所示。

表1 突變株的PCN產(chǎn)量

從圖中可以看出，篩選的四個(gè)突變株的PCN產(chǎn)量相對(duì)于HT66原始菌株的產(chǎn)量有明顯提高，其中HT66-N2的產(chǎn)量最高，按照48h的PCN產(chǎn)量來(lái)算的話，可以達(dá)到886mg/L，比原始菌株提高了100％。即使是產(chǎn)量最低的突變株HT66-N4在48h的產(chǎn)量也達(dá)到了816mg/L，相比原始菌株提高了85％。

1.2 原生質(zhì)體制備

原生質(zhì)體的制備主要依靠溶菌酶的作用，但是在制備體系中添加滲透壓穩(wěn)定劑(甘露醇濃度分別為0.3M、0.5M和0.7M)、螯合劑(Na-EDTA的濃度分別為0.1％、0.2％和0.3％)以及選擇不同菌齡(18h，24h，30h)都是影響原生質(zhì)體制備和再生效率的重要因素，利用正交試驗(yàn)來(lái)探索綠針假單胞菌原生質(zhì)體制備的最優(yōu)條件。

將培養(yǎng)一定時(shí)間的菌液離心收集菌體，重新懸浮于SMM緩沖液中(含蔗糖0.5mol/L，順丁烯二酸20mmol/L，六水合氯化鎂20mmol/L)。然后添加濃度為0.2mg/mL的溶菌酶及不同濃度的滲透壓穩(wěn)定劑、螯合劑，置于37℃恒溫水浴鍋中酶解一小時(shí)后取出，6000rpm離心后吸去溶液，用pH6.8磷酸緩沖液清洗兩次后重懸，稀釋一定倍數(shù)，吸取100μL分別涂布在KB培養(yǎng)基的平板,將平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

定期觀察所有平板上的菌落生長(zhǎng)情況，到所有平板上的菌落都生長(zhǎng)到可以明確計(jì)數(shù)的時(shí)候，對(duì)每個(gè)平板上的菌落的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。

A組平板上的菌落數(shù)代表為原始菌液中的細(xì)胞數(shù)。

B組平板上的菌落數(shù)代表經(jīng)溶菌酶處理之后的菌液中沒有成為原生質(zhì)體的細(xì)胞數(shù)，因?yàn)樵|(zhì)體失去了細(xì)胞壁無(wú)法在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

C組平板上的菌落數(shù)代表經(jīng)溶菌酶處理后沒有成為原生質(zhì)體的細(xì)胞以及制備為原生質(zhì)體且成功再生出來(lái)的細(xì)胞數(shù)，因?yàn)樵谠偕囵B(yǎng)基上，不僅完整的細(xì)胞可以生存，失去細(xì)胞壁的部分原生質(zhì)體也可以再生。

按照上述的A,B,C的含義，可以知道原生質(zhì)體的制備率ZB和再生率ZS的計(jì)算公式：

正交試驗(yàn)結(jié)果見下表2所示。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

從上表2中可以看出，各因素最高平均綜合分的條件為：菌齡為18h，甘露醇濃度0.5M，EDTA濃度為0.1％。

1.3 原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體的融合過(guò)程就是基因組重排的過(guò)程，所以不僅需要選擇最佳的融合條件，而且要選擇融合的親本菌株。研究發(fā)現(xiàn)，融合條件如PEG分子量和濃度、促融化合物DMSO對(duì)融合效率有較大影響。本專利以NTG誘變得到的四株高產(chǎn)突變株為親本，分別制備為原生質(zhì)體溶液后等體積混合，可以篩選到高產(chǎn)融合子。

分別吸取0.25mL的四株親本的原生質(zhì)體懸浮液在1.5mL離心管中，四株親本分為兩組，第一組四株親本的原生質(zhì)體懸浮液置于70℃條件下處理15min，第二組四株親本的原生質(zhì)體懸浮液置于750W的微波爐中低熱檔處理50s。

將第一組和第二組共計(jì)8個(gè)離心管中的原生質(zhì)體懸浮液等量混合，離心，去除上清液。

加入0.1mL的pH6.8磷酸緩沖液，吹打原生質(zhì)體沉淀，重新懸浮。

然后加入一定量的PEG和DMSO，以pH6.8磷酸緩沖液定容到1mL，充分混勻。

放在32℃水浴中保溫靜置。

5分鐘后取出即可。

融合之后，按照一定的比例稀釋融合液，每個(gè)稀釋倍數(shù)吸取100μL涂布在高滲KB培養(yǎng)基的平板上。放在28℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

培養(yǎng)三天后，每天定期過(guò)來(lái)觀察平板上的菌落生長(zhǎng)情況，等到菌落生長(zhǎng)到可以清晰計(jì)數(shù)的時(shí)候，就可以計(jì)算融合率了。

融合率＝(融合后平板菌落數(shù)X相應(yīng)稀釋倍數(shù))/(滅活前雙親等量混合平板菌落數(shù)X相應(yīng)稀釋倍數(shù))X100％

通過(guò)計(jì)算不同融合條件下原生質(zhì)體的融合率，可以得到綠針假單胞菌原生質(zhì)體融合的最佳條件。下表3是不同條件下的融合率。

表3 不同融合條件下的融合率

從上表可以看出，使用濃度為25％的PEG8000為融合劑，添加1％的DMSO時(shí)原生質(zhì)體的融合率最高，可達(dá)82.1％。

1.4 高產(chǎn)PCN融合子的篩選

將融合子培養(yǎng)至可以看出菌落上的綠色結(jié)晶的時(shí)候，按照綠色結(jié)晶的多少來(lái)直接篩選產(chǎn)量較高的菌株，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵和PCN產(chǎn)量測(cè)定。由平板上篩選到四株綠色結(jié)晶較多的菌株，分別編號(hào)為HT66-SF1，HT66-SF2，HT66-SF3，HT66-SF4。

對(duì)這四個(gè)高產(chǎn)PCN的融合子進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，根據(jù)高產(chǎn)融合子的24h，26h，48h的PCN產(chǎn)量繪制產(chǎn)量變化圖，如圖1所示。

從圖1中可以看出，篩選到的四個(gè)融合子的產(chǎn)量都有所提高，產(chǎn)量最高是菌株HT66-SF1，48h的PCN產(chǎn)量達(dá)到了1224mg/L，是HT66野生型產(chǎn)量的2.8倍。

實(shí)施例2

2.1 鈷-60γ射線誘變與初篩

本實(shí)施例以綠針假單胞菌HT66為出發(fā)株，采用物理誘變處理獲得高產(chǎn)的突變株。所述的誘變處理可以為鈷-60γ射線誘變，但不限于該方法。具體方法包括以下步驟：

1.取出發(fā)菌株HT66，活化并培養(yǎng)為種子液。

2.取種子液離心，吸去培養(yǎng)基，以PBS緩沖液重懸菌體，使細(xì)胞濃度約為10⁷至10⁸個(gè)/mL。

3.將細(xì)胞懸浮液分裝至滅菌的玻璃進(jìn)樣小瓶中，置于鈷-60γ射線放射環(huán)境中接受輻照；對(duì)照組菌液小瓶不接受輻照。

各組細(xì)胞懸浮液接受的吸收劑量分別為0.225、0.320、0.430、0.490和0.905kGy。

4.輻照完畢后，吹打混勻各組菌液，進(jìn)行梯度稀釋并涂布，每組設(shè)置3個(gè)平行。待菌落長(zhǎng)出后，挑選平板上的菌落數(shù)介于30至300個(gè)之間的計(jì)數(shù)，對(duì)各組中菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算活菌數(shù)和致死率，如表4所示。

鈷-60(60Co)半衰期為5.27a，可通過(guò)β衰變釋放出能量為315keV的高速電子成為鎳-60，并放出兩束γ射線，其能量分別為1.17及1.33MeV。其衰變反應(yīng)方程式為：

考慮到對(duì)于照射量率常數(shù)為Γ的放射性同位素放射性活度為A的放射源，物體在距離點(diǎn)源距離為R處輻照時(shí)間為t，其接受的吸收劑量為：

其中，f為照射劑量換算為吸收劑量的常數(shù)，為照射量率，鈷-60的照射量率常數(shù)Γ為1.32Rm²/(h·Ci)?？梢?，對(duì)于特定的放射源，物體接受的吸收劑量與輻照時(shí)間成正比，與到點(diǎn)源距離的平方成反比，故R和t是可用于控制吸收劑量的變量?？紤]到放射源的具體特征及多次進(jìn)出放射室的的危險(xiǎn)性，實(shí)驗(yàn)通過(guò)將菌液小瓶擺放在于點(diǎn)源距離不同的位置一次性輻照相同時(shí)間，以控制吸收劑量。

表4 各吸收劑量下的活菌數(shù)和致死率

5.對(duì)吸收劑量為0.225kGy的菌株進(jìn)行篩選

將輻照后的菌懸液轉(zhuǎn)接至KB培養(yǎng)基中，隨后稀釋涂布KB平板。培養(yǎng)至平板上的菌落可以明顯看出有綠色結(jié)晶，觀察菌落的大小，以及綠色結(jié)晶出現(xiàn)時(shí)間的早晚和綠色結(jié)晶的多少，根據(jù)這三點(diǎn)直接篩選出產(chǎn)量較高的四個(gè)單菌落，分別為5，6，7，8。分別挑取4個(gè)菌株的單菌落接種于5mL液體培養(yǎng)基的小瓶中，放置于28℃，180rpm的搖床上培養(yǎng)48h后取樣，每個(gè)樣品中加入1mL的乙腈，并且充分振蕩混勻溶解樣品。將乙腈溶解的抽提物用0.22μm有機(jī)相濾頭過(guò)濾至進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

色譜柱采用島津WondaSil-WR C-18反相柱(5μm×250mm)，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，流速為1mL/min，柱溫為30℃。檢測(cè)條件為：0-2min：乙腈8％，5mmol/L乙酸銨92％；2-20min：乙腈由8％升至60％，5mmol/L乙酸銨由92％降至40％；20-21min：乙腈8％，5mmol/L乙酸銨92％。

將篩選的四株產(chǎn)量較高的菌株5(HT66-Q5)，6(HT66-Q6)，7(HT66-Q7)，8(HT66-Q8)以及出發(fā)株(HT66)分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，取樣以HPLC測(cè)得PCN的產(chǎn)量，結(jié)果如下表5所示。

表5 突變株的PCN產(chǎn)量

從上表中可以看出，四株篩選到的突變株相對(duì)于原始菌株的產(chǎn)量均有所提高，其中產(chǎn)量提高最明顯的是HT66-Q6突變株，48h的平均產(chǎn)量可以達(dá)到803mg/mL。這四株突變株均可以作為之后基因組重排的親本菌株，來(lái)篩選產(chǎn)量更高的融合子。

2.2 原生質(zhì)體制備

將篩選的四株產(chǎn)量較高的菌株5(HT66-Q5)，6(HT66-Q6)，7(HT66-Q7)，8(HT66-Q8)培養(yǎng)，當(dāng)菌體培養(yǎng)至18h進(jìn)行原生質(zhì)體制備。取5mL菌液離心收集菌體，重新懸浮于相同體積的SMM緩沖液中(含蔗糖0.5mol/L，順丁烯二酸20mmol/L，六水合氯化鎂20mmol/L)。然后添加濃度為0.2mg/mL的溶菌酶及0.5M甘露醇、0.1％的EDTA，置于37℃恒溫水浴鍋中酶解一小時(shí)后取出，6000rpm離心后吸去溶液，用pH6.8磷酸緩沖液清洗兩次后重懸，稀釋一定倍數(shù)，吸取100μL分別涂布在KB培養(yǎng)基的平板,將平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

定期觀察所有平板上的菌落生長(zhǎng)情況，到所有平板上的菌落都生長(zhǎng)到可以明確計(jì)數(shù)的時(shí)候，對(duì)每個(gè)平板上的菌落的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)實(shí)施例1的方法計(jì)算原生質(zhì)體的制備率ZB和再生率ZS，結(jié)果見下表6所示。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 原生質(zhì)體融合

分別吸取0.25mL的四株親本的原生質(zhì)體懸浮液在1.5mL離心管中，四株親本分為兩組，第一組四株親本的原生質(zhì)體懸浮液置于70℃條件下處理15min，第二組四株親本的原生質(zhì)體懸浮液置于750W的微波爐中低熱檔處理50s。

將第一組和第二組共計(jì)8個(gè)離心管中的原生質(zhì)體懸浮液等量混合，離心，去除上清液。

加入0.1mL的pH6.8磷酸緩沖液，吹打原生質(zhì)體沉淀，重新懸浮。

然后加入一定量的PEG和DMSO，以pH6.8磷酸緩沖液定容到1mL，充分混勻。

放在32℃水浴中保溫靜置。

5分鐘后取出即可。

融合之后，按照一定的比例稀釋融合液，每個(gè)稀釋倍數(shù)吸取100μL涂布在高滲KB培養(yǎng)基的平板上。放在28℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

2.4 高產(chǎn)PCN融合子的篩選

將融合子培養(yǎng)至可以看出菌落上的綠色結(jié)晶的時(shí)候，按照綠色結(jié)晶的多少來(lái)直接篩選產(chǎn)量較高的菌株，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵和PCN產(chǎn)量測(cè)定。由平板上篩選到五株綠色結(jié)晶較多的菌株，分別編號(hào)為HT66-QC1，HT66-QC3，HT66-QC5，HT66-QC6，HT66-QC9。

對(duì)這五個(gè)高產(chǎn)PCN的融合子進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，根據(jù)五株高產(chǎn)融合子的24h，26h，48h的PCN產(chǎn)量繪制產(chǎn)量變化圖，如圖2所示。

根據(jù)圖2的數(shù)據(jù)可以看出，用基因組重排的方法選育出來(lái)的五個(gè)融合子的產(chǎn)量有明顯的提高，產(chǎn)量最高的是HT66-QC6菌株，48h達(dá)到了1398mg/L，是原始出發(fā)菌株HT66的2.6倍。

綜上所述，本發(fā)明提供了一種新的吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株的育種方法，通過(guò)誘變處理和基因組改組的結(jié)合，制備出了產(chǎn)量提高達(dá)2.8倍的吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株。該方法可以采用任何誘變方法，只要能獲得正突變株即可，且無(wú)需對(duì)親本菌株進(jìn)行標(biāo)記，將多個(gè)突變的高產(chǎn)株制備成融合子后隨機(jī)融合，可以縮短育種周期，工作效率大幅度提高。

本發(fā)明具體應(yīng)用途徑很多，以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。應(yīng)當(dāng)指出，以上實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而并不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。