一種海水微生物宏基因組的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種海水微生物宏基因組的提法方法。本發(fā)明針對海水這一特殊的樣本給予去鹽離子處理、雙重濾膜過濾再回收處理相結(jié)合，旨在提供一種高效、快速的提取海水微生物宏基因組的方法，具體包括以下幾個步驟：海水中雜質(zhì)的去除、海水微生物的裂解、DNA的游離與吸附、DNA洗脫。本發(fā)明能夠有效的去除海水中較多的鹽離子的干擾；充分裂解海水中的微生物細(xì)胞，使DNA充分釋放。本發(fā)明方法提取的DNA，其A260/280比值維持在1.8?2.0之間，所得DNA質(zhì)量好、純度高；能夠滿足基因文庫構(gòu)建和qPCR以及高通量測序的需求，為研究微生物基因組遺傳變異多樣性提供了良好的基礎(chǔ)。
【專利說明】
-種海水微生物宏基因組的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明提供一種海水微生物宏基因組的提取方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 海水微生物是生物活性物質(zhì)的重要源泉。海洋環(huán)境的特殊性W及海洋生物物種間 復(fù)雜的相互作用賦予了海洋微生物有別于陸生生物的新陳代謝途徑和適應(yīng)機(jī)制，從而產(chǎn)生 新的遺傳特異性，合成結(jié)構(gòu)獨(dú)特、具有特定生物活性的次級代謝產(chǎn)物。運(yùn)些結(jié)構(gòu)異常、作用 特殊的活性物質(zhì)是陸棲微生物所無法比擬的。20世紀(jì)W來，人們一直采用分離培養(yǎng)的方法 來研究海水微生物的多樣性。即將海水微生物從環(huán)境中分離純化，然后通過實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的 手段進(jìn)行后續(xù)的研究。
[0003] 然而隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)很多微生物不能夠培養(yǎng)繁殖，給進(jìn)一步的分子生物學(xué) 研究提出了新的難題。但近年來分子生物學(xué)手段的飛速發(fā)展使海洋微生物的研究進(jìn)入了新 的領(lǐng)域，擺脫了對傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)的依賴。特別是新一代測序技術(shù)的興起，使微生物基因組的 研究延伸到了前所未有的領(lǐng)域。二代測序特別適合微生物實(shí)驗(yàn)室，因其基因組小，且數(shù)據(jù)分 析相對簡單；與其他實(shí)驗(yàn)室方法相比極具吸引力。序列檢測的結(jié)果可直接關(guān)聯(lián)到基因組位 點(diǎn)，有利于分析該位點(diǎn)可能帶來的生物學(xué)影響；另外，我們能夠測定基因組中的單個堿基的 變化，W追蹤微生物在短期內(nèi)對環(huán)境的適應(yīng)性。例如，全球流行病的蔓延往往需要幾年的時 間來追蹤，有了單堿基分辨率的細(xì)菌基因組新一代測序，有望在幾周內(nèi)快讀追溯到局部地 區(qū)人群、醫(yī)院甚至家庭中的流行病原因。而提取海水微生物DNA是開展關(guān)于海水微生物研 究、開發(fā)、利用的基礎(chǔ)。但海水微生物含有大量的無機(jī)鹽離子、無機(jī)化合物及有機(jī)化合物、重 金屬離子等干擾提取反應(yīng)進(jìn)行的雜質(zhì)。且不同水域的海水微生物種類不同，運(yùn)都為從海水 微生物群中提取DNA帶來了困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種高效、快速的海水微生物宏基因組的提法方法。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種海水微生物宏基因組的提法方法，包括海水中雜質(zhì)的去除、海水微生物的裂解、 DNA的游離與吸附、DNA洗脫等步驟。所述海水微生物宏基因組的提取步驟如下： (1) 海水中雜質(zhì)的去除:海水樣本中按照2%的質(zhì)量體積比加入a-纖維素，常溫下，靜置 0.5 h;將0.8 um的濾膜安裝于已滅菌的過濾器上，連接好負(fù)壓累，將海水樣本倒入過濾器 上方，打開負(fù)壓累電源，執(zhí)行過濾;然后更換0.2 um的濾膜對濾液進(jìn)行再次過濾;把兩種濾 膜都進(jìn)行收集;將回收的濾膜迅速置于液氮中凍存1 min,然后置于室溫下90 S，如此反復(fù) 凍融5次； (2) 海水微生物的裂解:將濾膜剪碎置于5 ml離屯、管中，再加入250 iil細(xì)胞裂解液、40 濃度為20 mg/ml的溶菌酶W及10 iil濃度為2 mmol/L的邸TA;將反應(yīng)液置于56 °C水浴鍋 中解育10 min,期間每隔5 min震蕩一次;然后把樣品放入均質(zhì)分散機(jī)中，設(shè)定程序5 min、 120000 g離屯、15 min;取上清至干凈的2 ml離屯、管中； (3) DNA的游離與吸附:往上清液中加入250山濃度為10 mg/kg的蛋白酶k溶液，用槍頭 混勻；12000 Og離屯、5 min,然后小屯、取上清至新的2 ml離屯、管中；往離屯、管中加入等體積 的酪:氯仿:異戊醇=25:24:1進(jìn)行抽提；14000 g離屯、3 min,將上清轉(zhuǎn)移至吸附柱中；將吸附 柱置于離屯、管中，14000 g離屯、5 min,棄掉收集管中的廢液； (4) DNA洗脫:往離屯、柱中加入70%的乙醇750 yl，然后12000 g離屯、3 min,棄收集管中 的廢液;再次加入等體積的70%乙醇，14000 g離屯、5 min，棄掉收集管中的廢液;然后加入成 分為 10 mmol/L的lYis-CKl mmol/L的抓TA、pH=8.0的DNA洗脫液80 yl;14000 g離屯、5 min，收集離屯、管中的DM洗脫液，測定濃度。
[0006] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于： 首先，有效去除了鹽離子等雜質(zhì)干擾并提高了 DNA的濃度。本發(fā)明針對海水運(yùn)一特殊的 樣本，給予去鹽離子處理、雙重濾膜過濾再回收處理兩步結(jié)合的方法，旨在提供一種高效、 快速的提取海水微生物宏基因組的方法。采取兩步結(jié)合法一方面能夠有效的去除海水中較 多的鹽離子的干擾，使DNA的A260/280的純度維持在1.8-2.0之間。另一方面雙重過濾雙回 收能夠濃縮樣本濃度達(dá)到加快實(shí)驗(yàn)速率W及最大限度的提高DNA濃度的效果。鹽離子的處 理是在海水中加入2%的a-纖維素;a-纖維素能夠有效的與海水中化C〇3、Mg(OH)2等懸浮的雜 質(zhì)顆粒交聯(lián)，形成較大的凝體而沉淀從而避免海水中雜質(zhì)的影響。
[0007] 其次，本發(fā)明將海水微生物細(xì)胞充分裂解，DNA得W釋放。此外由于海水微生物和 其他物質(zhì)種類繁多，不僅含有革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌還有真菌、隧菌體、病菌等。如何 有效且充分的將其裂解，釋放出DNA物質(zhì)是關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)采用凍融法和酶溶法相結(jié)合的處理 方式，一方面能夠有效的避免采用機(jī)械處理方式帶來的非專一性，碎片破碎大小不一的缺 點(diǎn)。另一方面由于使用濾膜過濾時，傳統(tǒng)的方法要求必須置于-80 °C過夜，使得實(shí)驗(yàn)耗時 長;采用凍融法后一方面能夠直接處理樣本，減少-80 °C過夜的繁瑣步驟，此外能夠在一定 程度上破碎細(xì)胞，提高后續(xù)抽提的效率和收率。在裂解細(xì)胞壁的時候，傳統(tǒng)的方法一般僅僅 使用溶菌酶;本發(fā)明中使用的溶菌酶需和抓TA混合使用，一方面溶菌酶能夠有效的裂解革 蘭氏陽性菌細(xì)胞壁，但是對革蘭氏陰性菌裂解效果較差，必須加馨合劑才能將革蘭氏陰性 菌細(xì)胞壁有效的破除。通過運(yùn)樣的組合可W同時破除兩種細(xì)胞壁，簡單有效。
【具體實(shí)施方式】
[000引圖1為不同海水樣本基因組的16S rDNA的V3-V4區(qū)PCR擴(kuò)增電泳圖。其中M泳道為 DNA Marker; H1-H4分別為不同海水樣本基因組模板的PCR產(chǎn)物。 實(shí)施例
[0009] -種海水微生物宏基因組的提取方法，首先取得海水樣本并進(jìn)行預(yù)處理，然后提 取其微生物宏基因組。具體的步驟包括： (1)海水中雜質(zhì)的去除:海水樣本中按照2%的質(zhì)量體積比加入a-纖維素，常溫下，靜置 0.5 h;將0.8 um的濾膜安裝于已滅菌的過濾器上，連接好負(fù)壓累，將海水樣本倒入過濾器 上方，打開負(fù)壓累電源，執(zhí)行過濾;然后更換0.2 um的濾膜對濾液進(jìn)行再次過濾;把兩種濾 膜都進(jìn)行收集;將回收的濾膜迅速置于液氮中凍存Imin，然后置于室溫下90 S，如此反復(fù)凍 融5次； (2) 海水微生物的裂解:將濾膜剪碎置于5 ml離屯、管中，再加入250 iil細(xì)胞裂解液、40 濃度為20 mg/ml的溶菌酶W及10 iil濃度為2 mmol/L的抓TA;將反應(yīng)液置于56°C水浴鍋 中解育10 min,期間每隔5 min震蕩一次;然后把樣品放入均質(zhì)分散機(jī)中，設(shè)定程序5 min、 120000 g離屯、15 min;取上清至干凈的2 ml離屯、管中； (3) DNA的游離與吸附:往上清液中加入250山濃度為10 mg/kg的蛋白酶k溶液，用槍頭 混勻；120000 g離屯、5 min,然后小屯、取上清至新的2 ml離屯、管中；往離屯、管中加入等體積 的酪:氯仿:異戊醇=25:24:1進(jìn)行抽提；14000 g離屯、3 min,將上清轉(zhuǎn)移至吸附柱中；將吸附 柱置于離屯、管中，14000 g離屯、5 min,棄掉收集管中的廢液； (4) DNA洗脫:往離屯、柱中加入70%的乙醇750 yl，然后12000 g離屯、3 min,棄收集管中 的廢液;再次加入等體積的70%乙醇，14000 g離屯、5 min，棄掉收集管中的廢液;然后加入成 分為 10 mmol/L的lYis-CKl mmol/L的抓TA、pH=8.0的DNA洗脫液80 yl;14000 g離屯、5 min，收集離屯、管中的DM洗脫液，測定濃度。
[0010] 將提取所得DNA洗脫液使用化no化op 2000測定的DNA濃度，本發(fā)明（試驗(yàn)組)與常 規(guī)方法(對照組)提取海水微生物宏基因組的效果分別如表1所示。從表1可W看出按照本發(fā) 明方法提取的DNA濃度高于常規(guī)方法提取所得基因組濃度，可滿足測序、PCR反應(yīng)等分子生 物學(xué)操作的濃度要求;其次，A260/280的比值均位于1.8-2.0范圍內(nèi)，說明本發(fā)明提取所得 DNA純度高，表明本發(fā)明提取海水微生物宏基因組提取率高且提取提取效果良好。
[0011] 表1兩種方法提取海水微生物宏基因組效果對比
W所提宏基因組DNA洗脫液為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增16s rDNA V3-V4區(qū)，并進(jìn)行瓊脂糖 凝膠電泳驗(yàn)證，排除其他動植物的干擾。其中16S rDNA V3-V4引物為： 319F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3 ' 806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3' W上述兩組基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得16S rDNA V3-V4片段PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠 電泳驗(yàn)證結(jié)果見圖1。圖1顯示試驗(yàn)組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一、長度符合預(yù)期值且條帶比對照 組亮，說明PCR過程特異性高、擴(kuò)增效果好，滿足后續(xù)分子生物學(xué)研究使用。試驗(yàn)組的PCR效 果也更優(yōu)于對照組。該結(jié)果進(jìn)一步論證了本發(fā)明達(dá)到了理想的技術(shù)效果。
[0012] 所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修 飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種海水微生物宏基因組的提法方法，其特征在于:所述提取方法包括如下步驟:海 水中雜質(zhì)的去除、海水微生物的裂解、DNA的游離與吸附、DNA洗脫。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海水微生物宏基因組的提法方法，其特征在于:包括如下 步驟： (1) 海水中雜質(zhì)的去除：海水樣本中按照2 %的質(zhì)量體積比加入α-纖維素，常溫下，靜 置0.5 h;將0.8 um的濾膜安裝于已滅菌的過濾器上，連接好負(fù)壓栗，將海水樣本倒入過濾 器上方，打開負(fù)壓栗電源，執(zhí)行過濾;然后更換〇. 2 um的濾膜對濾液進(jìn)行再次過濾;把兩種 濾膜都進(jìn)行收集;將回收的濾膜迅速置于液氮中凍存1 min，然后置于室溫下90 s，如此反 復(fù)凍融5次； (2) 海水微生物的裂解:將濾膜剪碎置于5 ml離心管中，再加入250 μL細(xì)胞裂解液、40 μL濃度為20 mg/ml的溶菌酶以及10 μL濃度為2 mmol/L的EDTA;將反應(yīng)液置于56 °C水浴鍋 中孵育10 min，期間每隔5 min震蕩一次;然后把樣品放入均質(zhì)分散機(jī)中，設(shè)定程序5 min、 120000 g離心15 min;取上清至干凈的2 ml離心管中； (3) DNA的游離與吸附：往上清液中加入250 μL濃度為10 mg/kg的蛋白酶k溶液，用槍頭 混勻；120000g離心5min，然后小心取上清至新的2 ml離心管中；往離心管中加入等體積的 酸:氯仿:異戊醇=25:24:1進(jìn)行抽提;14000 g離心3 min，將上清轉(zhuǎn)移至吸附柱中；將吸附柱 置于離心管中，14000 g離心5 min，棄掉收集管中的廢液； (4) DNA洗脫:往離心柱中加入70%的乙醇750 μL，然后12000 g離心3 min，棄收集管中 的廢液;再次加入等體積的70%乙醇，14000 g離心5 min，棄掉收集管中的廢液;然后加入成 分為 10 mmol/L的Tris-Cl、l mmol/L的EDTA、pH=8.0的DNA洗脫液80 μ1;14000 g離心5 min，收集離心管中的DNA洗脫液，測定濃度。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種海水微生物宏基因組的提法方法，其特征在于:所述細(xì)胞 裂解液成分為：150 mmol/L NaCl、l% vol的NP-40、0.5% w/v的脫氧膽酸鈉、0.1% w/v的SDS 和50 mmol/L的Tris，pH=8·0〇
【文檔編號】C12N15/10GK106047869SQ201610706216
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月23日
【發(fā)明人】李珊, 謝文龍, 劉青青, 王松林, 陳榮山, 肖辛野, 李奇淵, 姚迅
【申請人】廈門基源醫(yī)療科技有限公司