專利名稱：一種新的微生物及其基因片段序列和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從海洋或淡水水體微生物有益菌群中分離的新的放線菌，以及該放線菌的16SrRNA的基因序列和用途。

背景技術(shù)：
近年來，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)逐步從粗放式養(yǎng)殖過渡到集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖，不僅增加了養(yǎng)殖的品種，而且大大提高了產(chǎn)量，豐富了人民的生活。但是由于集約化養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，養(yǎng)殖水體污染嚴(yán)重，養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境遭到破壞，導(dǎo)致水產(chǎn)動物的病害日益猖獗，嚴(yán)重制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。
長期以來，為防治病害的發(fā)生，化學(xué)藥物作為一種快速、有效、經(jīng)濟的手段在我國得到大面積的廣泛應(yīng)用，因此，水產(chǎn)動物病害防治主要依靠廣譜性抗菌素、消毒劑、重金屬鹽以及強氧化劑等，在生產(chǎn)上往往發(fā)生很多不利的因素，一是有些水產(chǎn)品由于長期使用抗菌素不但使病原菌產(chǎn)生耐藥性，增加了疾病防治的難度，而且藥殘損害消費者身體健康以及面臨水產(chǎn)品出口綠色貿(mào)易壁壘問題；二是大量使用消毒劑在殺滅病原菌的同時，也殺滅了水體中凈化水質(zhì)的有益菌群、藻類等，嚴(yán)重破壞了水體微生物凈化系統(tǒng)，導(dǎo)致養(yǎng)殖水體日益惡化，嚴(yán)重破壞了生態(tài)環(huán)境。20世紀(jì)90年代以后我國引進(jìn)了有效微生物菌群(EM)的基本技術(shù)，大量微生態(tài)制劑產(chǎn)品不斷出現(xiàn)，并作為某些化學(xué)藥物的替代品越來越廣泛地應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，從微生態(tài)學(xué)觀點來防治病害發(fā)生，減少環(huán)境污染，增進(jìn)動物健康。但是微生態(tài)制劑的菌種往往局限于芽孢桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌和酵母菌等傳統(tǒng)菌種，這些菌種大多殺菌作用不強或無殺菌作用，且多數(shù)對常用抗生素敏感，雖然能在一定程度上或通過間接的方法來防治水產(chǎn)動物病害的發(fā)生，但其防治作用有限，治標(biāo)不治本。


發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題與缺陷，本發(fā)明目的在于提供一種能夠產(chǎn)生抗菌物質(zhì)或免疫增強活性成分，以防治水產(chǎn)動物疾病的發(fā)生，對藻類無殺滅作用，在水體中能夠大量地增殖，抑制水體中病原菌的繁殖以及分解水體中的有機物及殘余餌料，消除致病微生物因子的滋生，改善養(yǎng)殖水體環(huán)境的新的放線菌。
實現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)方案是一種放線菌DL2-F-5，分類命名是弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)，于2006年12月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，其保藏號為CCTCC M 206135。
本發(fā)明的另一目的是提供一種上述放線菌DL2-F-55菌株的16SrRNA基因片段序列。
本發(fā)明還有一目的是放線菌DL2-F-5菌株在水質(zhì)改良劑和藥物組合物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還有一目的是放線菌DL2-F-5菌株作為添加劑動物飼料中的應(yīng)用。
該株放線菌DL2-F-5是從大連海域海泥中，經(jīng)分離、篩選獲得。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的放線菌DL2-F-5菌株具有以下優(yōu)點 1)放線菌DL2-F-5能夠產(chǎn)生抗菌物質(zhì)或免疫增強活性成分，可以防治水產(chǎn)動物疾病的發(fā)生，并且對藻類無殺滅作用，避免了使用消毒劑或殺生劑對凈化水環(huán)境有益藻類的破壞； 2)在水體中放線菌DL2-F-5大量地增殖，抑制了水體中病原菌的繁殖以及分解了水體中的有機質(zhì)，起到凈化水質(zhì)的作用； 3)將這些來自水環(huán)境中的放線菌DL2-F-5制劑成生物漁藥，來抑制養(yǎng)殖水體中的病原微生物，或內(nèi)服控制水產(chǎn)動物體內(nèi)的病害菌，可以替代化學(xué)藥物進(jìn)行疾病防治，且不破環(huán)生態(tài)環(huán)境； 4)放線菌DL2-F-5還能分解水體中的有機物及殘余餌料，消除致病微生物因子的滋生，改善養(yǎng)殖水體環(huán)境。



圖1是本發(fā)明的放線菌DL2-F-5的基內(nèi)菌絲在400倍的顯微鏡圖。
圖2是本發(fā)明的放線菌DL2-F-5的氣生菌絲在400倍的顯微鏡圖。
圖3是依據(jù)16SrDNA序列構(gòu)建的放線菌DL2-F-5株的系統(tǒng)進(jìn)化樹圖。
圖4是慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
圖5DL2-F-5菌株16SrRNA基因片段序列長度是1289bp核苷酸序。

具體實施例方式 以下結(jié)合發(fā)明人給出的附圖和具體試驗例及具體實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明放線菌DL2-F-5的有益效果和制備方法。
實施例1.放線菌DL2-F-5的分離篩選 1)、海泥來源采自大連海域海底泥層。
2)、菌株的分離篩選 將采集的海泥通過采樣箱空運實驗室中。每份樣品取3g，分別加入27mL滅菌的去離子水，用磁力攪拌器攪拌20min，即成10-1濃度的懸液，然后用滅菌去離子水依次稀釋至10-2，10-3，10-4，分別取各稀釋度上清液0.1mL，涂抹到高氏1號培養(yǎng)基平板上(培養(yǎng)基中含0.0075％的重鉻酸鉀，以抑制細(xì)菌和真菌的生長)，放入28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，挑取不同形態(tài)的菌落到高氏1號斜面上進(jìn)行培養(yǎng)，將分離的菌落在平板上反復(fù)劃線純化，直至得到純培養(yǎng)，命名為DL2-F-5菌株。4℃保存?zhèn)溆谩?br> 所述的高氏1號培養(yǎng)基的組分及配比為可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO40.5g，NaCl 15g，MgSO4·7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，瓊脂粉15g，水1000mL，pH7.2～7.4，121℃滅菌30min。
實施例2.放線菌DL2-F-5的鑒定 1)、形態(tài)學(xué)的特征 放線菌DL2-F-5菌株在高氏1號上，采用插片法，培養(yǎng)3d，7d，15d，30d后，在光學(xué)顯微鏡下觀察，可見基內(nèi)菌絲發(fā)達(dá)，呈分枝狀，無橫隔無斷裂見(圖1)；氣生菌絲較少，呈螺旋或曲線狀，孢子橢圓形見(圖2)。
2)、培養(yǎng)學(xué)的特征 放線菌DL2-F-5株在9種培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，分別于3d，7d，15d，30d觀察其生長情況，氣絲、基絲的顏色及產(chǎn)色素情況，其培養(yǎng)特征見表1。
表1海洋放線菌DL2-F-5菌株的培養(yǎng)特征 所述的上述培養(yǎng)基的組分及配比分別為 蔗糖察氏瓊脂蔗糖30g，NaNO3 2g，K2HPO4 1g，KCl 0.5g，MgSO40.5g，F(xiàn)eSO4 0.01g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.2，112℃滅菌30min。
葡萄糖酵母膏瓊脂葡萄糖10g，酵母膏10g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.2，112℃滅菌30min。
酪氨酸瓊脂酵母膏1g，L-酪氨酸1g，NaCl 8.5g，瓊脂15g，水1000mL，pH7.2，121℃滅菌30min。
甘油天門冬素瓊脂L-天門冬素1g，微量鹽溶液1mL，甘油10g，K2HPO410g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.2，112℃滅菌30min。
(微量鹽溶液FeSO4·7H2O 0.1g，MnCl2·4H2O 0.1g，ZnSO4·7H2O0.1g，蒸餾水100mL)。
普通營養(yǎng)瓊脂蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.2，121℃滅菌30min。
燕麥粉瓊脂燕麥粉20g，微量鹽溶液1mL(同上)，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.2，121℃滅菌30min。
無機鹽淀粉瓊脂可溶性淀粉10g，NaNO3 1g，MgCO3 1g，K2HPO4 0.3g，NaCl 0.5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.2，121℃滅菌30min。
伊莫松瓊脂牛肉膏4g，蛋白陳4g，酵母膏10g，葡萄糖10g，氯化鈉2.5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.0，112℃30min高壓滅菌。
3)、生理生化特征 參照《微生物分類學(xué)》(張繼忠.復(fù)旦大學(xué)出版社，1990)，對放線菌DL2-F-5菌株分別進(jìn)行明膠液化、牛奶凝固和胨化、淀粉水解、纖維素生長、硝酸鹽還原、黑色素產(chǎn)生、H2S產(chǎn)生、唯一碳源利用等各項試驗，放線菌DL2-F-5菌株的生理生化特征見表2。
表2放線菌菌株生理生化特征 注“+”表示陽性反應(yīng)，“-”表示陰性反應(yīng)。
4)、放線菌DL2-F-5菌株的分子生物學(xué)鑒定。
(1)放線菌DL2-F-5菌株16SrRNA的基因片段序列測定 將放線菌DL2-F-5純培養(yǎng)物接種于普通肉湯，28℃搖床培養(yǎng)48h，離心收集菌體，采用離心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取放線菌總DNA。擴增放線菌DL2-F-5菌株16SrRNA的基因采用通用引物，正向引物為5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′(對應(yīng)于E.coli 16S rDNA 5′43-63f)，反向引物為3′-GGGCGGWGTGTACAAGGC-5′(對應(yīng)于E.coli16S rDNA 3′1405-1387r)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(50μL)10×PCR Buffer 5μL，25mmol/LMgCl24μL，2mmol/L dNTPs4μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，0.6mmol/L的引物各1μL，模板DNA2μL，ddH2O 32.5μL。PCR反應(yīng)條件在94℃預(yù)變性5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段94℃變性1min→56℃復(fù)性1min→72℃延伸2min，循環(huán)35次，最后72℃延伸5min。結(jié)束反應(yīng)后，PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用H.Q.&.Q.Gel凝膠回收試劑盒II回收，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。DL2-F-5菌株16SrRNA基因片段的1289bp核苷酸序列如圖5所示。
(2)放線菌DL2-F-5序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 將測定的16S rDNA序列，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的所有已測定的原核生物16SrDNA進(jìn)行比對，其同弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)的相似率達(dá)到99.6％，利用Blast搜索軟件從GenBank數(shù)據(jù)庫中調(diào)出相關(guān)放線菌株的16SrDNA序列(相關(guān)放線菌菌株的登陸號如表3所示)，通過Clustal X 1.83軟件進(jìn)行多序列比對，并采用Neighbour-joining法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建見(圖3)所示，分析表明DL2-F-5菌株與弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)之間的進(jìn)化距離相隔較近。再結(jié)合放線菌菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和生理生化特性，認(rèn)為DL2-F-5株放線菌屬于弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)。
表3相關(guān)放線菌株登陸號 該放線菌DL2-F-5的經(jīng)形態(tài)學(xué)的特征、培養(yǎng)學(xué)的特征、生理生化特征測定和16S rDNA序列同源性分析，鑒定為弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)。該菌能產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)可以殺滅水產(chǎn)動物病原菌，同時能夠利用水體中的氮源、碳源，可降解水體中的有機質(zhì)起到凈化水質(zhì)作用。
試驗例1放線菌DL2-F-5發(fā)酵液抑菌效果試驗 1)指示病原菌 柱狀黃桿菌(魚害粘球菌)(Flavobacterium columnare，編號G4)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum，編號E-3-11)、點狀產(chǎn)氣單胞菌點狀亞種(Aeromonaspunctata sub.punctata，編號XP91-4-1)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，編號ST78-3-3)均由中國科學(xué)院水生生物研究所魚病室細(xì)菌組提供；溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈維弧菌(Vibrio harvey)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonida)為西北農(nóng)林科技大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)實驗室提供。
2)放線菌DL2-F-5原始發(fā)酵液中抗生素相對生物效價的測定 按照前述方法用發(fā)酵罐發(fā)酵50L放線菌DL2-F-5原始發(fā)酵液，采用挖孔法分別測定慶大霉素對大腸桿菌的抑制作用(用抑菌圈表示)，設(shè)置10個濃度，分別為78μg/ml，156μg/ml，313μg/ml，625μg/ml，1250μg/ml，2500μg/ml，5000μg/ml，10000μg/ml，20000μg/ml，40000μg/ml，以慶大霉素濃度對數(shù)值為縱坐標(biāo)，以抑菌圈直徑的大小為橫坐標(biāo)，制成線性關(guān)系圖，函數(shù)關(guān)系為Y＝0.209+0.173X，結(jié)果見(圖4)，通過計算，對放線菌DL2-F-5原始發(fā)酵液測定抗生素的相對生物效價為4667μg/mL。
3)放線菌DL2-F-5原始發(fā)酵液體外殺菌試驗 以引起魚類腸炎病的腸型點狀氣單胞菌(Aeromonas punctataf.instestinalis)為例，來說明放線菌DL2-F-5原始發(fā)酵液的體外殺菌效果 取8支試管，每支試管加入1mL無菌肉湯，在第1支試管中加入1mL放線菌DL2-F-5發(fā)酵液，混勻后，取出1mL加入第2支試管中，混勻，在從第2支試管中取出1mL加入第3支試管中，依此，一直加到第7支試管，第7支試管混勻后，棄去1mL，濃度依次為原發(fā)酵液的2-1，2-2，2-3，2-4，2-5，2-6，2-7；第8支試管為空白肉湯。向這8支試管中各加入1mL濃度為105cfu/mL的腸型點狀氣單胞菌菌液。另取8支試管作為對照組，稀釋方法同上，但不加入腸型點狀氣單胞菌，而是各加入1mL的空白普通肉湯培養(yǎng)基。兩組試管均放入28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后觀察結(jié)果。
24h后，與對照組相比，試驗組前5個試管與對照組渾濁度基本一致，第6管開始，渾濁度比對照組明顯增加。故認(rèn)為放線菌DL2-F-5稀釋至2-5時，與腸型點狀氣單胞菌共同培養(yǎng)24h后，能抑制腸型點狀氣單胞菌。對于試驗組的第1到第5支試管，在培養(yǎng)24h，48h，72h后分別取100μL涂布于R-S培養(yǎng)基上，28℃條件下培養(yǎng)24h后，觀察有無黃色菌落產(chǎn)生，腸型點狀氣單胞菌在R-S培養(yǎng)基呈黃色菌落，是鑒定特征，結(jié)果見表4。
表4放線菌DL2-F-5發(fā)酵液對腸型點狀氣單胞菌的殺滅效果 注“+”表示有黃色菌落產(chǎn)生，“-”表示沒有黃色菌落產(chǎn)生 由表4可見，培養(yǎng)48h后，前3支試管中均不含腸型點狀氣單胞菌，故認(rèn)為，當(dāng)放線菌DL2-F-5發(fā)酵液稀釋至2-3以上時，與腸型點狀氣單胞菌共同培養(yǎng)48h后，可將其全部殺滅。
放線菌DL2-F-5發(fā)酵液除對腸型點狀氣單胞菌有較強殺滅效果外，對嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、哈維弧菌(Vibrio harvevi)、殺鮭氣單胞菌史氏亞種(Aeromonas salmonicida)和殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)等多種水產(chǎn)病原菌均有殺滅作用。采用挖孔法測定其殺菌作用，結(jié)果表5。
表5放線菌DL2-F-5殺菌譜測定結(jié)果(抑菌圈直徑mm) 所述的普通肉湯培養(yǎng)基和R-S培養(yǎng)基的組分及配比為 普通肉湯培養(yǎng)基牛肉膏4g，蛋白胨10g，NaCl 5g，KH2PO4 0.5g，蒸餾水1L，pH為7.4～7.6，121℃高壓滅菌20min。
R-S培養(yǎng)基L-賴氨酸鹽酸鹽5g，L-鳥氨酸鹽酸鹽6.5g，麥芽糖3.5g，Na2S2O3 6.8g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.3g，溴麝香草酚蘭0.03g，去氧膽酸鈉1g，新生霉素0.005g，酵母浸膏3g，NaCl 5g，瓊脂15g，蒸餾水1L，pH為7.0，121℃高壓滅菌20min。
4)放線菌DL2-F-5原始發(fā)酵液的體內(nèi)殺菌效果試驗 以鯽魚腸炎病的防治為例，說明放線菌DL2-F-5原始發(fā)酵液的體內(nèi)殺滅效果。
①放線菌DL2-F-5原始發(fā)酵液對鯽魚腸炎病的預(yù)防試驗 將體質(zhì)健康、規(guī)格基本一致的鯽魚隨機分成2組，每組3尾。預(yù)防組先投喂添加放線菌DL2-F-5發(fā)酵液的飼料(含菌量4×103cfu/g飼料)，連續(xù)投喂2d，第3天開始投喂添加腸型點狀氣單胞菌的飼料(含菌量109cfu/g飼料)，連續(xù)投喂5d；對照組先投喂基礎(chǔ)飼料，連續(xù)投喂2d，第3天開始投喂添加腸型點狀氣單胞菌的飼料(含菌量109cfu/g飼料)，連續(xù)投喂5d。每組每天的投喂量為魚體重的2％。飼喂7d后，觀察各組鯽魚的發(fā)病情況，并觀察放線菌DL2-F-5發(fā)酵液對鯽魚腸道氣單胞菌(Aeromonas)數(shù)量的影響。
具體操作如下無菌條件下每尾鯽魚取腸道內(nèi)容物0.5g左右，放入預(yù)先稱重的滅菌玻璃小采樣瓶內(nèi)，準(zhǔn)確稱量腸道內(nèi)容物的重量，按1∶10的比例加入無菌水，充分混勻，并用無菌水稀釋至一定濃度后，涂抹到R-S選擇培養(yǎng)基上(氣單胞菌在此培養(yǎng)基上呈黃色)，在28℃條件下培養(yǎng)24h，選擇黃色菌落進(jìn)行計數(shù)，并計算出每克腸道內(nèi)容物中所含的氣單胞菌數(shù)。記錄每尾鯽魚腸道內(nèi)容物中的氣單胞菌數(shù)，并按生物統(tǒng)計處理數(shù)據(jù)，比較組間差異。
預(yù)防試驗結(jié)果飼喂7d后，對照組鯽魚出現(xiàn)活動遲鈍、吞餌吐餌甚至不攝食現(xiàn)象，攝食和搶食能力明顯下降，個別個體肛門出現(xiàn)紅腫；解剖觀察，可見腸壁充血，腸道內(nèi)有黃色粘液，但沒有食物或僅有少量食物；而預(yù)防組鯽魚均無明顯發(fā)病癥狀。兩組鯽魚腸道內(nèi)氣單胞菌數(shù)量比較結(jié)果見表6。
表6預(yù)防組與對照組鯽魚腸道內(nèi)容物中氣單胞菌數(shù)量比較 從表6可以看出預(yù)防組與對照組相比差異顯著(p＜0.05)，鯽魚腸道內(nèi)氣單胞菌數(shù)量明顯降低。因此將殺菌放線菌應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖上，能夠在一定程度預(yù)防爆發(fā)性疾病的發(fā)生。
②放線菌DL2-F-5原始發(fā)酵液對鯽魚腸炎病的治療試驗 將體質(zhì)健康、規(guī)格基本一致的鯽魚隨機分成2組，每組3尾。治療組先投喂添加腸型點狀氣單胞菌的飼料(含菌量109cfu/g飼料)，連續(xù)投喂2d，第3天開始投喂添加放線菌發(fā)酵液的飼料(含菌量4×105cfu/g飼料)，連續(xù)投喂5d；對照組先投喂添加腸型點狀氣單胞菌的飼料(含菌量109cfu/g飼料)，連續(xù)投喂2d，第3天開始投喂未添加原始發(fā)酵液的飼料，連續(xù)投喂5d。每組每天的投喂量為魚體重的2％。飼喂7d后，按預(yù)防試驗的方法記錄結(jié)果。
治療試驗結(jié)果飼喂7d后觀察，對照組鯽魚出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍，攝食和搶食能力明顯下降，肛門出現(xiàn)紅腫，解剖觀察，可見腸壁充血，腸道內(nèi)有黃色粘液，無食物；而治療組鯽魚發(fā)病癥狀明顯減輕或基本無發(fā)病癥狀。兩組鯽魚腸道內(nèi)氣單胞菌數(shù)量比較結(jié)果見表7。
表7治療組與對照組鯽魚腸道內(nèi)容物中氣單胞菌數(shù)量比較 從表7可以看出治療組鯽魚腸道內(nèi)氣單胞菌數(shù)量與對照組相比明顯降低(p＜0.05)。因此將殺菌放線菌應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖上，能夠代替一部分的化學(xué)藥物治療養(yǎng)殖動物的各種疾病，以減少對環(huán)境的破壞，而又能達(dá)到理想的治療效果。
③放線菌DL2-F-5原始發(fā)酵液對鯽魚腸道總菌數(shù)的影響 將體質(zhì)健康、規(guī)格基本一致的鯽魚隨機分成2組，每組3尾，一組投喂添加放線菌DL2-F-5原始發(fā)酵液的飼料(每克飼料含弗氏鏈霉菌3.7×105cfu)，另一組投喂不含原始發(fā)酵液的飼料作為對照。每天的投喂量為魚體重的2％-3％。
將連續(xù)投喂15d后的兩組鯽魚在無菌條件下，用燃燒的75％的酒精棉球擦拭體表進(jìn)行消毒，用灼燒后冷卻的剪刀從肛門處剪開，然后向上朝前剪成弧形，掀開游離腹壁展現(xiàn)腸道，無菌采取腸道內(nèi)容物0.5g左右放入預(yù)先稱重的無菌采樣玻璃瓶瓶內(nèi)，再準(zhǔn)確稱出腸內(nèi)容物重量，按1∶10加入無菌蒸餾水稀釋，在旋渦混合器充分混勻10min，從采樣瓶內(nèi)取0.5mL混合液加入盛有4.5mL的試管內(nèi)，混勻，此為10-1，逐步稀釋至10-8。用微量加樣槍從第4到第8個梯度各取100μL涂普通營養(yǎng)瓊脂平板上，進(jìn)行平板細(xì)菌計數(shù)。每個梯度設(shè)3個平行。
涂菌的普通營養(yǎng)瓊脂平板在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，選擇菌落數(shù)在30～300個之間的計數(shù)，求出每組樣品菌落數(shù)的平均值，計算出每克腸道內(nèi)容物中所含的總菌數(shù)；每克腸道內(nèi)容物中總菌數(shù)＝菌落數(shù)×10×稀釋倍數(shù)×100cfu。鯽魚腸道中總菌數(shù)測定結(jié)果見表8 表8放線菌DL2-F-5發(fā)酵液對鯽魚腸道總菌數(shù)的影響(log 10/g腸道內(nèi)容物) 結(jié)果表明與投喂未添加原始發(fā)酵液的飼料的對照組相比，連續(xù)投喂15d添加放線菌DL2-F-5飼料的試驗組鯽魚腸道總菌數(shù)有所降低，但試驗組與對照組的差異不顯著。因而，放線菌DL2-F-5不會擾亂鯽魚腸道內(nèi)微生物正常菌群。
試驗例2放線菌DL2-F-5的毒性試驗及安全性評價 (1)金魚急性毒性試驗挑選健康、無病無外傷的金魚50尾，隨機分成2組，每組25尾，第一組投喂添加放線菌DL2-F-5的飼料(100g基礎(chǔ)飼料原料中加入60mL發(fā)酵液)；第二組為對照組，投喂基礎(chǔ)飼料，投餌量均為魚體重的2％。連續(xù)投喂5d后，兩組金魚全部改投基礎(chǔ)飼料，連續(xù)投喂7d，試驗組和對照組金魚，均未出現(xiàn)死亡，解剖試驗組沒有病理現(xiàn)象。(2)小鼠急性毒性試驗取昆明種小鼠20只，雌雄各半，隨機分成2組，分別飼養(yǎng)禁食12h后，給各小鼠灌胃，第一組灌胃放線菌DL2-F-5發(fā)酵液0.2mL/20g，第二組灌胃生理鹽水0.2mL/20g，觀察7d，試驗組和對照組小鼠均未出現(xiàn)死亡，解剖試驗組沒有病理現(xiàn)象。
說明放線菌DL2-F-5對水產(chǎn)動物和哺乳動物均無較大毒性，可安全使用。
實施例3放線菌DL2-F-5水產(chǎn)生物制劑使用方法與用量 (1)放線菌DL2-F-5水產(chǎn)生物制劑技術(shù)指標(biāo) 將獲得的放線菌DL2-F-5發(fā)酵液通過低溫(20℃)氣流濃縮4倍制成水產(chǎn)放線菌生物制劑，制劑有固體與液體劑型，固體制劑用麩皮或腐殖酸作為吸附載體，并測定相對生物效價≥10mg/g，活菌數(shù)量≥109cfu/g；液體制劑為濃縮后即成，相對生物效價≥10mg/mL，活菌數(shù)量≥109cfu/mL。達(dá)到制定的標(biāo)準(zhǔn)要求再裝入不同體積的包裝袋或瓶中。
(2)放線菌DL2-F-5水產(chǎn)生物制劑使用方法與劑量 該制劑可以添加到水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的飼料中使用。預(yù)防用量將放線菌DL2-F-5水產(chǎn)生物制劑0.5～0.8％的比例添加于飼料中投喂，每20d使用1～2次；治療用量添加量為1％，連續(xù)使用一周。
池塘潑灑外用，每畝(水深1m)每次2000mL，連續(xù)使用3次，可以達(dá)到較佳防病和水質(zhì)改良的效果。
實施例4制備放線菌DL2-F-5菌株發(fā)酵液的方法 用接種環(huán)從保藏的斜面培養(yǎng)基(高氏1號培養(yǎng)基)中刮取放線菌DL2-F-5的孢子，在無菌條件下接入生產(chǎn)用斜面培養(yǎng)基(高氏1號培養(yǎng)基)上，28℃條件下培養(yǎng)5～7d，待長出孢子后，用接種環(huán)刮取孢子，在無菌條件下接入250mL裝有50mL已滅菌的種子液培養(yǎng)基的三角瓶中，于28℃條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)2d，搖速為150r/min，將獲得的一級種子液按10％的接種量接入到二級種子培養(yǎng)基中，28℃搖床振蕩培養(yǎng)2d，搖速為150r/min，獲得二級種子液，將獲得的二級種子液按10％的接種量接入到裝有已滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，于28℃條件下，進(jìn)行通氣培養(yǎng)，保持罐壓0.1Mpa，發(fā)酵培養(yǎng)7d，即可獲得活性菌株發(fā)酵液。
各種培養(yǎng)基配方如下 (1)種子液培養(yǎng)基配方葡萄糖10g，牛肉膏10g， NaCl 15g，MgSO4·7H2O 0.5g， K2HPO4 0.5g，CaCO3 0.5g， 水1000mL，121℃滅菌30min。
(2)發(fā)酵培養(yǎng)基配方蔗糖10g，可溶性淀粉5g， 牛肉膏4g，NaCl 15g， MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO4 0.5g， CaCO3 0.5g，2％的黃豆粉浸汁原液1000mL， pH7.0～7.5，121℃滅菌30min。
2％的黃豆粉浸汁原液的制作方法稱取20g黃豆粉，先用少量水調(diào)成漿糊狀，然后加入一定量的水，小火煮沸30min，加水定容至1000mL，如有較多沉淀，可用紗布過濾。
實施例5含有放線菌DL2-F-5水產(chǎn)生物制劑 (1)放線菌DL2-F-5水產(chǎn)生物制劑發(fā)酵液的制備用接種環(huán)從保藏斜面培養(yǎng)基中刮取放線菌DL2-F-5孢子，在無菌條件下接入生產(chǎn)斜面培養(yǎng)基中，28℃條件下培養(yǎng)5～7d，待長出孢子后，用接種環(huán)刮取孢子，在無菌條件下接入250mL裝有50mL已滅菌的種子液培養(yǎng)基的三角瓶中，于28℃條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)2d，搖速為150r/min，將獲得的一級種子液按10％的接種量接入到2500mL裝有500mL已滅菌的二級種子培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃搖床振蕩培養(yǎng)2d，搖速為150r/min，獲得二級種子液，將獲得的二級種子液按10％的接種量接入到裝有50L已滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，于28℃條件下，轉(zhuǎn)速為200r/min，風(fēng)量為50L/h，進(jìn)行通氣培養(yǎng)，保持罐壓0.1Mpa，發(fā)酵培養(yǎng)7d，即可獲得放線菌DL2-F-5發(fā)酵液。
(2)將獲得的50L放線菌DL2-F-5發(fā)酵液通過低溫氣流濃縮4倍后，獲得12.5L濃縮液，測定相對生物效價和活菌數(shù)量，配制液體裝瓶或使用吸附劑(麩皮或腐殖酸)制成固體。
<110>西北農(nóng)林科技大學(xué) 四川華強漁牧藥業(yè)有限公司
<120>一種新的微生物及其基因片段序列和應(yīng)用
<160>1
<210>1
<211>1289
<212>DNA
<213>弗氏鏈霉菌種(Streptomyces fradiae)
<400>1
gtgcagacgc gtcggtgaga gatagtggcg acgggtgagt aacacgtggg caatctgccc 60
tgcactctgg gacaagccct ggaaacgggg tctaataccg gatacgacca cttcaggcat 120
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權(quán)利要求
1.一種放線菌DL2-F-5菌株，分類命名是弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)，它于2006年12月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 206135。
2.如權(quán)利要求1所述的放線菌DL2-F-5菌株，其特征在于，所述的放線菌DL2-F-5菌株16SrRNA基因片段的1289bp核苷酸序列如圖5所示。
3.含有如權(quán)利要求1所述的放線菌DL2-F-5菌株的水質(zhì)改良劑和藥物組合物。
4.含有如權(quán)利要求1所述的放線菌DL2-F-5菌株作為添加劑的動物飼料。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的放線菌DL2-F-5菌株，分類命名是弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)，保藏號為CCTCC M 206135。該放線菌DL2-F-5菌株是從海洋或淡水水體微生物有益菌群中分離的，能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)或增強免疫活性成分，可以防治水產(chǎn)動物疾病的發(fā)生，并且對藻類無殺滅作用，避免了使用消毒劑或殺生劑對凈化水環(huán)境有益藻類的破壞，同時在水體中這些抗菌放線菌大量地增殖，抑制了水體中病原菌的繁殖以及分解了水體中的有機質(zhì)，起到凈化水質(zhì)的作用。另外，放線菌還能分解水體中的有機污染物及殘余餌料，消除致病微生物因子的滋生，改善養(yǎng)殖水體環(huán)境。在生產(chǎn)藥物和作為食品、飼料添加劑中有廣泛用途。
文檔編號C02F3/34GK101100653SQ20061010526
公開日2008年1月9日 申請日期2006年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月25日
發(fā)明者王高學(xué), 顧忠旗, 葉道林, 原居林, 楊 穆, 黃海洪, 付維法, 梁朝軍, 婧 崔, 姚嘉赟 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué), 四川華強漁牧藥業(yè)有限公司