由免疫復(fù)合物直接對(duì)微生物進(jìn)行測(cè)序的測(cè)定法與方法
【專利摘要】本文提供了用于在患者樣品中對(duì)免疫刺激性微生物進(jìn)行檢測(cè)和/或識(shí)別的MiIP-Seq測(cè)定法和方法。本文還提供了用于對(duì)感染性疾病進(jìn)行診斷或在患者樣品中對(duì)先前未特征化的微生物進(jìn)行識(shí)別的方法。本文所述的方法和測(cè)定法相對(duì)于現(xiàn)有方法的優(yōu)勢(shì)在于：（i）不需要用于微生物擴(kuò)增的培養(yǎng)步驟；（ii）并非特異性針對(duì)特定微生物，可用于對(duì)先前未特征化的微生物進(jìn)行識(shí)別；以及（iii）由于不進(jìn)行微生物培養(yǎng)步驟，因此允許快速處理。
【專利說(shuō)明】由免疫復(fù)合物直接對(duì)微生物進(jìn)行測(cè)序的測(cè)定法與方法
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]根據(jù)35U.S.C.§ 119(e)，本申請(qǐng)要求2011年I月26日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列N0.=61/436, 345的優(yōu)先權(quán)，以引用的方式將其整體內(nèi)容并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明的【技術(shù)領(lǐng)域】涉及免疫系統(tǒng)刺激性微生物的檢測(cè)和識(shí)別，以及感染性疾病的診斷。
[0004]政府支持
[0005]本發(fā)明是在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)授予的NIH DK44319的政府支持下作出的。美國(guó)政府對(duì)本發(fā)明享有一定的權(quán)利。
【背景技術(shù)】
[0006]據(jù)估計(jì)，有一百萬(wàn)美國(guó)人患有慢性炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)o IBD，如 Crohn’ s 病(CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)。這些疾病以導(dǎo)致腸內(nèi)膜(intestinal lining)組織受損的慢性炎癥性響應(yīng)為特征。⑶和UC兩者均顯出大量遷移至粘膜并進(jìn)入腸腔的白細(xì)胞。兩種疾病均在疾病活性中的活性階段(即，存在腸炎)和非活性階段(即，最低限度的腸炎至無(wú)腸炎)之間交替?；钚訧BD可包括如出血性腹瀉、腹痛和發(fā)熱等癥狀。非活性階段具有最低限度的腸炎至無(wú)腸炎，且無(wú)嚴(yán)重的胃腸病。已經(jīng)具有下列假定:對(duì)共生細(xì)菌(co_ensal bacteria)的不當(dāng)免疫響應(yīng)是炎癥性腸病的起因之一。不當(dāng)免疫響應(yīng)可導(dǎo)致形成免疫復(fù)合物，例如，抗體分子和抗原的組合。抗原可以為外來(lái)物質(zhì)，如病毒或細(xì)菌多肽?？贵w可以通過(guò)包覆病毒或細(xì)菌來(lái)防止感染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本文所述的測(cè)定法和方法提供了檢測(cè)和/或識(shí)別微生物的直接方法，先天性免疫系統(tǒng)或適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的一種或多種組分對(duì)所述微生物產(chǎn)生響應(yīng)。此類方法的獨(dú)特之處在于其確定何種微生物被免疫系統(tǒng)識(shí)別為外來(lái)抗原的能力，而非單純檢測(cè)微生物的存在。由于許多微生物可以在不導(dǎo)致疾病的情況下存在(例如，共生細(xì)菌)，因此檢測(cè)微生物水平并不一定表明某微生物對(duì)于檢出該微生物的受試者來(lái)說(shuō)是病原性的。然而，本文所述的方法允許對(duì)如下微生物進(jìn)行檢測(cè):受試者機(jī)體對(duì)該微生物產(chǎn)生免疫響應(yīng),這些方法在本文中被稱為“微生物免疫沉淀和測(cè)序(Microbe ImmunoPrecipitation and Sequencing)”法或者“MilP-Seq”法。這一區(qū)別對(duì)于一些情況來(lái)說(shuō)可以是尤其重要的，例如，對(duì)于這樣的疾病尤其重要:在該疾病中，對(duì)個(gè)體的子集中的特定抗原產(chǎn)生免疫響應(yīng)，而這一反應(yīng)在群體中的多數(shù)個(gè)體中并不出現(xiàn)(例如，對(duì)于患有自身免疫病癥的個(gè)體)。另一個(gè)實(shí)例包括炎癥性腸病(IBD),所述疾病被認(rèn)為在一些情況下由對(duì)共生微生物群(commensal microbiota)產(chǎn)生的不當(dāng)免疫響應(yīng)導(dǎo)致。相應(yīng)地,本文所述的測(cè)定法和方法在一些實(shí)施方式中允許對(duì)在例如患有免疫性腸病的受試者中特異性引發(fā)免疫響應(yīng)的共生微生物群(包括細(xì)菌、病毒和其它微生物)進(jìn)行檢測(cè)和/或識(shí)別，并允許對(duì)感染性疾病進(jìn)行診斷。
[0008]相應(yīng)地，本文提供了用于對(duì)患者樣品中的免疫刺激性微生物進(jìn)行檢測(cè)和/或識(shí)別的測(cè)定法和方法。本文還提供了用于對(duì)感染性疾病進(jìn)行診斷或?qū)颊邩悠分械男滦筒≡w進(jìn)行識(shí)別的方法。
[0009]相應(yīng)地,在一些方面,本文提供了用于在患有疾病或失調(diào)(disorder)的患者中對(duì)免疫刺激性微生物的存在進(jìn)行識(shí)別或檢測(cè)的方法，所述方法包括如下步驟:(a)由從患者樣品獲得的免疫蛋白富集部分中提取核酸；(b)對(duì)提取的核酸進(jìn)行測(cè)序；以及(C)將所述提取的核酸的序列與已知的微生物核酸序列進(jìn)行比較，以識(shí)別由所述免疫蛋白富集部分中提取的核酸是否是微生物核酸，其中，若所述提取的核酸是微生物核酸，則患者被檢測(cè)為具有免疫刺激性微生物。在一些方面，本文提供了用于在患有疾病或失調(diào)的患者中對(duì)免疫刺激性微生物的存在進(jìn)行識(shí)別或檢測(cè)的方法，所述方法包括如下步驟:(a)由患者樣品制備免疫蛋白富集部分；(b)由所述免疫蛋白富集部分提取核酸；(c)對(duì)所述提取的核酸進(jìn)行測(cè)序；以及(d)將所述提取的核酸的序列與已知的微生物核酸序列進(jìn)行比較，以識(shí)別由所述免疫蛋白富集部分中提取的核酸是否是微生物核酸，其中，若所述提取的核酸是微生物核酸，則患者被檢測(cè)為具有免疫刺激性微生物。 [0010]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實(shí)施方式中，患有疾病或失調(diào)的患者患有炎癥性腸病。在一些此類實(shí)施方式中，所述炎癥性腸病為Crohn’ s病、潰瘍性結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎(collagenous colitis)、淋巴細(xì)胞性結(jié)腸炎、缺血性結(jié)腸炎、改道性結(jié)腸炎(diversion colitis)、Behcet’ s 綜合征、或未定型結(jié)腸炎(indeterminate colitis)。
[0011]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實(shí)施方式中，患有疾病或失調(diào)的患者患有自身免疫失調(diào)。
[0012]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實(shí)施方式中，患有疾病或失調(diào)的患者患有硬化(cirrhosis)、敗血癥(sepsis)或病毒血癥(viremia)。
[0013]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實(shí)施方式中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用對(duì)免疫球蛋白、補(bǔ)體蛋白(complement protein)或病原體識(shí)別受體(pathogenrecognition receptor)的特異性親和結(jié)合劑制備。
[0014]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實(shí)施方式中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用IgA、IgD、IgE、IgG、IgM的特異性親和結(jié)合劑或所述親和結(jié)合劑的任意組合制備。
[0015]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實(shí)施方式中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用對(duì)IgG具有特異性的親和結(jié)合劑制備。
[0016]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實(shí)施方式中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用親和結(jié)合劑利用免疫沉淀制備。
[0017]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實(shí)施方式中，所述親和結(jié)合劑為蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L、免疫蛋白特異性抗體或其片段，或所述親和結(jié)合劑的任意組
八
口 ο
[0018]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實(shí)施方式中，在所述方法中使用的親和結(jié)合劑或免疫蛋白特異性抗體包括抗人IgG抗體、抗人IgA抗體、抗人IgD抗體、抗人IgE抗體、抗人IgM抗體,或所述親和結(jié)合劑或抗體的任意組合。[0019]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實(shí)施方式中，所述方法中使用的親和結(jié)合劑對(duì)免疫球蛋白免疫蛋白具有特異性，并結(jié)合至免疫球蛋白免疫蛋白的Fe片段上的抗原表位。
[0020]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實(shí)施方式中，所述方法中使用的親和結(jié)合劑未結(jié)合至固相載體。
[0021]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實(shí)施方式中，所述方法中使用的親和結(jié)合劑結(jié)合至固相載體。在一些此類實(shí)施方式中，所述固相載體包括超順磁微珠(superparamagnetic microbeads)、微尺度瓊月旨糖珠(microscopic agarose beads)、或瓊脂糖樹(shù)脂珠(agarose resin beads)。
[0022]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實(shí)施方式中，被檢測(cè)的免疫系統(tǒng)刺激性微生物為細(xì)菌、真菌或病毒。
[0023]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實(shí)施方式中，被檢測(cè)的免疫系統(tǒng)刺激性微生物屬于分類單元中的古細(xì)菌域、細(xì)菌域或真核生物域。
[0024]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實(shí)施方式中，患者樣品為血液樣品、血衆(zhòng)樣品、尿樣品、腦脊液(cerebrospinal fluid)樣品、粘膜(mucous membrane)樣品、糞便(fecal)樣品、腸灌洗(intestinal lavage)樣品、腸液樣品、關(guān)節(jié)液樣品、呼吸道痰(respiratory sputum)樣品、或支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid)樣品。在一些此類實(shí)施方式中，腸灌洗樣品為回腸灌洗(ileal lavage)樣品。
[0025]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實(shí)施方式中，被檢測(cè)的免疫系統(tǒng)刺激性微生物為先前未特征化(uncharacterized)的微生物。
[0026]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實(shí)施方式中，所述測(cè)序步驟使用鳥(niǎo)槍法克隆(shotgun cloning)、16S rRNA/DNA擴(kuò)增和/或宏基因組(metagenomic)測(cè)序進(jìn)行。
[0027]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實(shí)施方式中，使用微生物基因特異性引物進(jìn)行步驟(b)或步驟(c)的測(cè)序。
[0028]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實(shí)施方式中，使用非基因特異性引物進(jìn)行步驟(b)或步驟(c)的測(cè)序。
[0029]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實(shí)施方式中，制備免疫蛋白富集部分的患者樣品在提取核酸的步驟之前不進(jìn)行培養(yǎng)步驟。
[0030]此外，在一些方面，本文還提供了一種在患者樣品中對(duì)免疫系統(tǒng)刺激性微生物進(jìn)行直接檢測(cè)的測(cè)定法，所述測(cè)定法包括以下步驟:(a)由從患者樣品制備的免疫蛋白富集部分中提取核酸；以及(b)對(duì)存在于所述免疫蛋白富集部分中的提取的核酸進(jìn)行測(cè)序，從而獲得存在于所述患者樣品中的任何免疫系統(tǒng)刺激性微生物的序列。
[0031]在一些方面，本文還提供了一種在患者樣品中對(duì)免疫系統(tǒng)刺激性微生物進(jìn)行直接檢測(cè)的測(cè)定法，所述測(cè)定法包括以下步驟:(a)由患者樣品制備免疫蛋白富集部分；(b)從所述免疫蛋白富集部分中提取核酸；以及(c )對(duì)存在于所述免疫蛋白富集部分中的提取的核酸進(jìn)行測(cè)序，從而獲得存在于所述患者樣品中的任何免疫系統(tǒng)刺激性微生物的序列。
[0032]在本文所述的這些測(cè)定法和全部此類測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用對(duì)免疫球蛋白、補(bǔ)體蛋白或病原體識(shí)別受體具有特異性的親和結(jié)合劑制備。
[0033]在本文所述的這些測(cè)定法和全部此類測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用對(duì)IgA、IgD、IgE、IgG、IgM具有特異性的親和結(jié)合劑或所述親和結(jié)合劑的任意組合制備。
[0034]在本文所述的這些測(cè)定法和全部此類測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用對(duì)IgG具有特異性的親和結(jié)合劑制備。
[0035]在本文所述的這些測(cè)定法和全部此類測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用親和結(jié)合劑利用免疫沉淀制備。在一些此類實(shí)施方式中，所述親和結(jié)合劑為蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L、免疫蛋白特異性抗體或其片段，或所述親和結(jié)合劑的任
意組合。
[0036]在本文所述的這些測(cè)定法和全部此類測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，所使用的親和結(jié)合劑或免疫蛋白特異性抗體包括抗人IgG抗體。
[0037]在本文所述的這些測(cè)定法和全部此類測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，所使用的親和結(jié)合劑對(duì)免疫球蛋白免疫蛋白具有特異性，并結(jié)合至免疫球蛋白免疫蛋白的Fe片段上的抗原表位。
[0038]在本文所述的這些測(cè)定法和全部此類測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，所使用的親和結(jié)合劑未結(jié)合至固相載體。在本文所述的這些測(cè)定法和全部此類測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，所使用的親和結(jié)合劑結(jié)合至 固相載體。在一些此類實(shí)施方式中，所述固相載體包括超順磁微珠、微尺度瓊脂糖珠、或瓊脂糖樹(shù)脂珠。
[0039]在本文所述的這些測(cè)定法和全部此類測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，被檢測(cè)的免疫系統(tǒng)刺激性微生物為細(xì)菌、真菌或病毒。
[0040]在本文所述的這些測(cè)定法和全部此類測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，被檢測(cè)的免疫系統(tǒng)刺激性微生物屬于分類單元中的古細(xì)菌域、細(xì)菌域或真核生物域。
[0041]在本文所述的這些測(cè)定法和全部此類測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，患者樣品為血液樣品、血漿樣品、尿樣品、腦脊液樣品、粘膜樣品、糞便樣品、腸灌洗樣品、腸液樣品、關(guān)節(jié)液樣品、呼吸道痰樣品、或支氣管肺泡灌洗液樣品。在一些此類實(shí)施方式中，所述腸灌洗樣品為回腸灌洗樣品。
[0042]在本文所述的這些測(cè)定法和全部此類測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，被檢測(cè)的免疫系統(tǒng)刺激性微生物為先前未特征化的微生物。
[0043]在本文所述的這些測(cè)定法和全部此類測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，所述測(cè)序步驟使用鳥(niǎo)槍法克隆、16S rRNA/DNA擴(kuò)增和/或宏基因組測(cè)序進(jìn)行。
[0044]在本文所述的這些測(cè)定法和全部此類測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，使用微生物基因特異性引物進(jìn)行步驟(b)或步驟(c)的測(cè)序。
[0045]在本文所述的這些測(cè)定法和全部此類測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，使用非基因特異性引物進(jìn)行步驟(b)或步驟(c)的測(cè)序。
[0046]在本文所述的這些測(cè)定法和全部此類測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，制備免疫蛋白富集部分的患者樣品在提取核酸的步驟之前不進(jìn)行培養(yǎng)步驟。
[0047]在本文所述的這些測(cè)定法和全部此類測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，微生物不能使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)。[0048]在一些方面，本文還提供了用于從至少一個(gè)測(cè)試樣品獲取數(shù)據(jù)的系統(tǒng)，所述測(cè)試樣品包含由免疫蛋白富集樣品中提取的核酸，所述免疫蛋白富集樣品由至少一名患者處獲得，所述系統(tǒng)包含:測(cè)定模塊，其被配置為接收包含所述提取的核酸的所述至少一個(gè)測(cè)試樣品，并對(duì)所述至少一個(gè)測(cè)試樣品進(jìn)行至少一次測(cè)序分析，以產(chǎn)生測(cè)序數(shù)據(jù)輸出；存儲(chǔ)裝置，其被配置為存儲(chǔ)來(lái)自所述測(cè)定模塊的所述測(cè)序數(shù)據(jù)輸出；比較模塊，其被配置為接收包含所述提取的核酸的測(cè)試樣品的所述測(cè)序數(shù)據(jù)輸出，并對(duì)所述測(cè)序數(shù)據(jù)輸出進(jìn)行至少一次序列分析，從而確定下列條件之一存在與否，并產(chǎn)生比較數(shù)據(jù)輸出:(i )所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性為20%以上、或(ii)所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性低于20%;以及顯示模塊，其用于對(duì)部分基于來(lái)自所述比較模塊的所述比較數(shù)據(jù)輸出的內(nèi)容進(jìn)行顯示，其中，所述內(nèi)容包括表明所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性為20%以上的信號(hào)、或表明所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性低于20%的信號(hào)。[0049]在本文所述的這些系統(tǒng)和全部此類系統(tǒng)的一些實(shí)施方式中，所述顯示模塊上顯示的內(nèi)容進(jìn)一步包括表明建議接受特定治療方案的患者的信號(hào)。
[0050]定義
[0051]為了方便起見(jiàn)，將本文在說(shuō)明書(shū)、實(shí)施例和所附的權(quán)利要求中所使用的特定術(shù)語(yǔ)收集于此。除非另有說(shuō)明或在上下文中有所暗示，下列術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)包括下文提供的含義。除非另有明確說(shuō)明或從上下文中可明顯看出，下列術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)不排除在其所屬領(lǐng)域已具有的含義。提供所述定義以輔助描述【具體實(shí)施方式】，而由于本發(fā)明的范圍僅受權(quán)利要求所限，因此并不意味著限制所請(qǐng)求保護(hù)的發(fā)明。除非另有定義，本文使用的所有科技術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】中的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。
[0052]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“炎癥性腸病(IBD)”包括任意類型、病因或病機(jī)(etiology orpathogenesis)的炎癥性腸病。其包括但不僅限于:潰瘍性結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎、息肉型結(jié)腸炎(colitispolyposa)、透壁性結(jié)腸炎(transmural colitis)、節(jié)段性結(jié)腸炎(segmentalcolitis)、Crohn’ s病、未定型結(jié)腸炎、淋巴細(xì)胞性結(jié)腸炎、缺血性結(jié)腸炎、改道性結(jié)腸炎、Behcet’ s綜合征、感染性結(jié)腸炎等。
[0053]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“自身免疫疾病”是指免疫介導(dǎo)的、源于自身組織受攻擊的病癥，其中，受試者的自身抗體與宿主組織反應(yīng)，或免疫效應(yīng)因子T細(xì)胞與內(nèi)源性自身肽發(fā)生自體反應(yīng)并引起組織破壞，但也可涉及對(duì)微生物的免疫響應(yīng)。此類病癥包括但不僅限于:自身免疫性糖尿病(I型糖尿病、胰島素依賴型糖尿病)、ANCA陽(yáng)性血管炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、Sjogren’ s病或綜合征、皮肌炎、牛皮癬、原發(fā)性硬化性膽管炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、多發(fā)性硬化、強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosingspondylitis)、自身免疫性腦脊髓炎、重癥肌無(wú)力(MG)、自身免疫性淋巴組織增生綜合征(ALPS)、Hashimoto’ s 甲狀腺炎、Goodpasture’ s 綜合征、天皰瘡(pemphigus)(例如，尋常天皰瘡(pemphigus vulgaris))、Grave’ s病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血友病、自身免疫性血小板減少性紫癜(thrombocytopenic purpura)、具有抗膠原抗體的硬皮病、混合性結(jié)締組織病、多發(fā)性肌炎、惡性貧血(pernicious anemia)、特發(fā)性Addison’s病、自身免疫相關(guān)性不孕不育(autoimmune-associated infertility)、腎小球腎炎(例如，新月體性腎小球腎炎(crescentic glomerulonephritis)、增生性腎小球腎炎)、大皰性類天皰瘡(bullous pemphigoid)、自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎(uveoretinitis)、腎小球腎炎、以及Guillain-Barre綜合征。在一個(gè)實(shí)施方式中，自身免疫性疾病選自由如下疾病所組成的組:多發(fā)性硬化、I型糖尿病、Hashimoto’s甲狀腺炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性肝炎、溶血性貧血、自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴組織增生綜合征(ALPS)、自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎、腎小球腎炎、Guillain-Barre綜合征、牛皮癬和重癥肌無(wú)力。
[0054]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“直接檢測(cè)”是指本文所述的方法在如下方面的能力:直接從免疫蛋白富集部分測(cè)定微生物的存在和類別(identity)(例如，通過(guò)測(cè)序)，而無(wú)需使用用于對(duì)微生物進(jìn)行間接測(cè)試(如針對(duì)微生物的IgG ELISA)的測(cè)定法。本文所述的方法采用“直接檢測(cè)”，該“直接檢測(cè)”具有如下附加優(yōu)勢(shì):通過(guò)利用對(duì)微生物的先天性和/或適應(yīng)性免疫響應(yīng)，能夠以無(wú)偏倚的方式識(shí)別先前未特征化的微生物。這在某些情況下是非常有用的，例如，當(dāng)抗微生物的IgG抗體未知時(shí)、當(dāng)微生物無(wú)法使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)培養(yǎng)以增強(qiáng)檢測(cè)時(shí)、和/或當(dāng)沒(méi)有抗微生物抗體的現(xiàn)有ELISA測(cè)試時(shí)。
[0055]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“免疫系統(tǒng)刺激性微生物”是指細(xì)菌、真菌或病毒，所述微生物由受試者的先天性或獲得性免疫系統(tǒng)識(shí)別，從而在受試者產(chǎn)生針對(duì)該微生物的免疫介導(dǎo)的響應(yīng)。免疫系統(tǒng)刺激性微生物可以來(lái)自分類單元中的古細(xì)菌域、細(xì)菌域或真核生物域。通常，如在本文中定義的術(shù)語(yǔ)，免疫系統(tǒng)刺激性微生物是“致病的”，然而在一些情況下，典型的非致病性微生物(例如，共生細(xì)菌)仍然可以在受試者群體的子集(如患有炎癥性腸病的受試者)中產(chǎn)生免疫介導(dǎo)的響應(yīng)。因此,術(shù)語(yǔ)“免疫系統(tǒng)刺激性微生物”在本文中不與“致病的”互換使用。在一個(gè)實(shí)施方式中，免疫刺激性微生物不為馬病原體，如里氏埃里希氏體(Ehrlichia risticii)。
[0056]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“患者樣品”或“生物樣品”指的是從患者處獲得的流體樣品、細(xì)胞樣品、組織樣品或器官樣品。在一些實(shí)施方式中，從受試者處獲得細(xì)胞或細(xì)胞群、或一定量的組織或體液。“患者樣品”經(jīng)?？砂▉?lái)自動(dòng)物的細(xì)胞，但該術(shù)語(yǔ)也可以指非細(xì)胞的生物材料，如可用于檢測(cè)微生物的存在或類別的血液、唾液或尿液的非細(xì)胞部分。生物樣品包括但不僅限于:活組織切片、刮取物(如口腔刮取物)、全血、血漿、血清、尿液、唾液、細(xì)胞培養(yǎng)物、活組織切片、粘膜樣品、糞便、腸灌洗物、關(guān)節(jié)液、腦脊液、膽汁樣品、呼吸道分泌物(如痰)、支氣管肺泡灌洗液樣品等。生物樣品或組織樣品可以指由個(gè)體分離的組織或流體，包括但不僅限于，例如，血、血漿、血清、尿、糞便、痰、脊髓液、胸膜液(pleural fluid)、淋巴液；皮膚、呼吸道、腸道和泌尿生殖道的外層；眼淚、唾液；和器官。樣品可包括冷凍組織。術(shù)語(yǔ)“樣品”還涵蓋任何由對(duì)此類樣品進(jìn)行進(jìn)一步加工而衍生的材料。衍生樣品可包括例如由樣品提取的核酸或蛋白；或經(jīng)由將所述樣品進(jìn)行如核酸擴(kuò)增或mRNA逆轉(zhuǎn)錄，或?qū)μ囟ê怂帷⒌鞍?、其它?xì)胞質(zhì)組分或核組分進(jìn)行分離和/或純化等技術(shù)而獲得的核酸或蛋白。
[0057]術(shù)語(yǔ)“患者”、“受試者”和“個(gè)體”在本文中可互換使用，并且是指動(dòng)物，特別是人，對(duì)于所述受試者，期望對(duì)由其獲得的生物樣品中免疫系統(tǒng)刺激性微生物的存在進(jìn)行分析。在一些實(shí)施方式中，受試者需要對(duì)疾病或失調(diào)進(jìn)行診斷，例如對(duì)炎癥性腸病進(jìn)行診斷，其中，使用本文所述的測(cè)定法和方法對(duì)生物樣品進(jìn)行分析。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“受試者”或“患者”還指人類和非人類的動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)“非人類的動(dòng)物”包括所有脊椎動(dòng)物，例如，哺乳動(dòng)物，如非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(特別是高等靈長(zhǎng)類動(dòng)物)、綿羊、狗、嚙齒類動(dòng)物(如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、豬、貓、兔、牛、和任何家畜或?qū)櫸?；以及非哺乳?dòng)物，如雞，兩棲類，爬行動(dòng)物等。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述受試者為人。在一些實(shí)施方式中，所述受試者不是馬。
[0058]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“免疫蛋白富集部分”是指部分純化(例如，通過(guò)免疫沉淀)的樣品，所述部分純化使得期望的免疫蛋白(例如，免疫球蛋白、補(bǔ)體、或先天性或適應(yīng)性免疫響應(yīng)的其它可溶性/循環(huán)組分)在樣品中的水平與衍生所述樣品的初始患者樣品相比提高至少10%。在一些實(shí)施方式中，與衍生所述樣品的患者樣品相比，富集部分中的免疫蛋白水平提高至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%、至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍以上。
[0059]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”是指通常存在于受試者血液或其它體液中的抗體，被用于識(shí)別和中和外來(lái)抗原(如細(xì)菌或病毒)。通常，免疫球蛋白包含兩條大的重鏈和兩條小的輕鏈，并且由白血細(xì)胞制造。哺乳動(dòng)物中已知存在五種不同的抗體同種型(isotype)(BP, IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)，其各自發(fā)揮不同的作用，并幫助針對(duì)遇到的各個(gè)不同類型的外來(lái)對(duì)象引導(dǎo)適當(dāng)?shù)拿庖唔憫?yīng)。
[0060]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白(保護(hù)有機(jī)體不受抗原的作用)及其天然存在的變體?！翱贵w”通常包含彼此間通過(guò)二硫鍵連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)。每條重鏈均由重鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈均由輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域CL組成。重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分成高可變區(qū)(稱作互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R))，散布于較保守的區(qū)域(稱為框架區(qū)(FR))之中。每條可變重鏈和可變輕鏈由3個(gè)⑶R和4個(gè)FR組成，由氨基末端到羧基末端按以下順序排列:FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合域?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白結(jié)合至宿主組織或因子，包括多種免疫系統(tǒng)細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典的補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)。
[0061]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“先前未特征化的微生物”是指具有未知功能的微生物或先前未曾識(shí)別或測(cè)序的新型微生物。根據(jù)本文所述方法的實(shí)施方式，使用隨機(jī)引物對(duì)此類微生物進(jìn)行測(cè)序。隨后將序列與已知的微生物序列(例如，微生物序列數(shù)據(jù)庫(kù)，如GenBank或宏基因組文庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù))進(jìn)行比較，從而允許識(shí)別(例如，使用搜索引擎(如BLAST)或比對(duì)工具(如ClustalW))。例如，如果與數(shù)據(jù)庫(kù)中的另一微生物同源性很低或沒(méi)有同源性(例如，低于20%),則被識(shí)別為先前未特征化的微生物。在一些實(shí)施方式中，先前未特征化的微生物將與數(shù)據(jù)庫(kù)中的微生物 具有序列同源性，然而數(shù)據(jù)庫(kù)并未表明微生物的功能是已知的。
[0062]本文所使用的短語(yǔ)“不進(jìn)行培養(yǎng)步驟”表示在對(duì)核酸進(jìn)行提取和測(cè)序前，并未使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)免疫蛋白部分進(jìn)行培養(yǎng)以擴(kuò)增樣品中的微生物數(shù)量。
[0063]本文所使用的短語(yǔ)“不能使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)”是指在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下(例如，細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件包括:例如，在37°C下、在連續(xù)振搖的情況下，在溶菌肉湯(LB培養(yǎng)基)中生長(zhǎng)至少14h)并不生長(zhǎng)或擴(kuò)增的微生物。例如，微生物可具有高于或低于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下所使用的溫度的最佳生長(zhǎng)溫度、或微生物需要在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中并不存在的必需營(yíng)養(yǎng)素，因此不能通過(guò)使微生物在標(biāo)準(zhǔn)條件下生長(zhǎng)或增殖來(lái)提高檢測(cè)效果。類似地，在病毒微生物的情況下，“不能使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)”可以是指例如，缺乏病毒在其中進(jìn)行增殖的宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉微生物(如細(xì)菌和病毒)的標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)技術(shù)和條件，并可容易地將這一知識(shí)應(yīng)用于本文所述的測(cè)定法和方法中。
[0064]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“已知的微生物序列”是指例如，微生物基因序列的數(shù)據(jù)庫(kù)，如GenBank，并且可使用搜索工具(如BLAST)來(lái)對(duì)樣品序列進(jìn)行識(shí)別，從而在數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢核酸序列同源性。在一些實(shí)施方式中，將已知序列與宏基因組文庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比較。術(shù)語(yǔ)“對(duì)照樣品”包括無(wú)可檢測(cè)的疾病的個(gè)體或多個(gè)個(gè)體的核酸，所述核酸已經(jīng)使用本文所述的測(cè)定法和方法進(jìn)行制備和測(cè)序。
[0065]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“包含/包括(comprising或comprises)”表示對(duì)本發(fā)明必要的組合物、方法及其各自的組成部分，并且無(wú)論是否必要都仍然對(duì)未指定的要素保持開(kāi)放。
[0066]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“基本由…組成(consisting essentially of)”對(duì)于給定實(shí)施方式所需的那些元素。該術(shù)語(yǔ)允許存在實(shí)質(zhì)上不影響本發(fā)明實(shí)施方式的基礎(chǔ)和新穎性或起作用的特征的額外元素。
[0067]術(shù)語(yǔ)“由…組成(consisting of )”涉及本文所述的組合物、方法及其各自的組成部分，排除沒(méi)有在實(shí)施方式描述中詳述的任何要素。
[0068]除非上下文中明確地另有所指，在本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求中所使用的單數(shù)形式“一(a/an)”和“該/所述(the)”涵蓋復(fù)數(shù)的所指物。因此，例如，“方法(method)”的所指物包括一種或多種方法、和/或本文所述的類型的步驟、和/或?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員而言在閱讀本發(fā)明后變得顯而易見(jiàn)的內(nèi)容等。
[0069]除非另有說(shuō)明，本 文所述方法的實(shí)施將采用屬于本領(lǐng)域之內(nèi)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)的常規(guī)技術(shù)。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的解釋。參見(jiàn)，例如，Sambrook，F(xiàn)ritsch&Maniatis, 1989年，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版；寡核苷酸合成(M.J.Gait主編，1984年)；多核苷酸雜交(B.D.Harnes&S.J.Higgins主編，1984年)；分子克隆實(shí)用指南(B.Perbal, 1984年);酶學(xué)方法系列叢書(shū)(Academic Press公司);精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(Ausubel 等主編，1995 年)。
[0070]可以理解的是，以下的詳細(xì)描述和實(shí)例僅是說(shuō)明性的，不應(yīng)被視為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。對(duì)所公開(kāi)的實(shí)施方式所做的各種改變和修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的，其可在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下作出。另外，出于描述和公開(kāi)的目的，將說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例中提及的全部專利、專利申請(qǐng)以及出版物通過(guò)引用明確并入本文，例如，在這些出版物中描述的可以與本發(fā)明相聯(lián)系使用的方法學(xué)。這些出版物僅僅由于它們的公開(kāi)早于本申請(qǐng)的申請(qǐng)日而提供。在這一方面不應(yīng)當(dāng)視作承認(rèn)本發(fā)明人沒(méi)有權(quán)利借助于先前的發(fā)明或因?yàn)槿魏纹渌蚨鴮⒐_(kāi)的內(nèi)容提前。所有關(guān)于這些文件的日期的聲明或這些文件的內(nèi)容的表述是基于 申請(qǐng)人:可得的信息，并且不構(gòu)成關(guān)于這些文件的日期或這些文件的內(nèi)容的正確性的任何承認(rèn)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0071]圖1A-圖1C為顯示回腸灌洗樣品中的細(xì)菌比例的一系列餅狀圖。圖1A示出第一患者的回腸灌洗樣品；圖1B示出使用未包覆珠進(jìn)行免疫沉淀的相同回腸灌洗樣品(即，對(duì)照)；圖1C示出通過(guò)使用抗人IgG包覆珠進(jìn)行回腸灌洗樣品的免疫沉淀而制備的IgG富集部分。在IgG富集部分和對(duì)照非包覆珠部分之間，觀測(cè)到10個(gè)PCR循環(huán)的豐度差異(SP，IgG珠中的富集與對(duì)照珠中相比超出1000倍)。在由腸灌洗和灌入(input-lavage)進(jìn)行如本文所述的免疫沉淀程序后，由抗IgG珠和對(duì)照珠中分離DNA ;使用附著有適當(dāng)?shù)你暯幼?adaptor)和接頭(linker)的擴(kuò)增16S DNA的V2區(qū)域的引物來(lái)產(chǎn)生文庫(kù)，隨后在454測(cè)序儀上對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。圖1A-圖1C顯示基于V2同源序列并使用公共數(shù)據(jù)庫(kù)的分配至個(gè)體操作分類單元(operational taxonomic units, 0TU)的序列的相對(duì)豐度，所述數(shù)據(jù)庫(kù)如萬(wàn)維網(wǎng)上的greengenes.lbl.gov (在相比于對(duì)照沉淀灌洗和灌入的抗IgG免疫沉淀灌洗中)。為允許定性比較，對(duì)照珠免疫沉淀的DNA比IgG珠的DNA擴(kuò)增更多倍。在灌洗中的細(xì)菌群落在組成上與以對(duì)照珠沉淀的細(xì)菌群落非常相似，但與由IgG珠下拉(pull down)的細(xì)菌群落相比非常不同。因此，如本文所使用的術(shù)語(yǔ)，IgG富集部分中的細(xì)菌為免疫系統(tǒng)刺激性微生物。[0072]圖2A-圖2C為顯示回腸灌洗樣品中的細(xì)菌比例的一系列餅狀圖。圖2A示出第二患者的回腸灌洗樣品；圖2B示出使用未包覆珠進(jìn)行免疫沉淀的相同回腸灌洗樣品(即，對(duì)照)；圖2C示出通過(guò)使用抗人IgG包覆珠進(jìn)行回腸灌洗樣品的免疫沉淀而制備的IgG富集部分。在由腸灌洗和灌入進(jìn)行如本文所述的免疫沉淀程序后，由抗IgG珠和對(duì)照珠中分離DNA ;使用附著有適當(dāng)?shù)你暯幼雍徒宇^的擴(kuò)增16S DNA的V2區(qū)域的引物來(lái)產(chǎn)生文庫(kù)，隨后在454測(cè)序儀上對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。圖2A-圖2C顯示基于V2同源序列并使用公共數(shù)據(jù)庫(kù)的分配至個(gè)體操作分類單元0TU的序列的相對(duì)豐度，所述數(shù)據(jù)庫(kù)如萬(wàn)維網(wǎng)上的greengenes.lbl.gov (在相比于對(duì)照沉淀灌洗和灌入的抗IgG免疫沉淀灌洗中)。為允許定性比較，對(duì)照珠免疫沉淀的DNA比IgG珠的DNA擴(kuò)增更多倍。在灌洗中的細(xì)菌群落在組成上與以對(duì)照珠沉淀的細(xì)菌群落非常相似，但與由IgG珠下拉的細(xì)菌群落相比非常不同。因此，如本文所使用的術(shù)語(yǔ)，IgG富集部分中的細(xì)菌為免疫系統(tǒng)刺激性微生物。[0073]圖3為示出來(lái)自患有炎癥性腸病的患者的小腸分泌物的IgG包覆的細(xì)菌可以以本文所述的方法的實(shí)施方式，使用16S rDNA進(jìn)行特異性下拉和測(cè)序的圖。由16S rDNA的特異性引物，通過(guò)基于SYBR綠的定量實(shí)時(shí)PCR對(duì)16S rDNA的豐度(表示附著于抗IgG珠和對(duì)照珠的細(xì)菌的豐度)進(jìn)行定量。IgG富集部分中的細(xì)菌相對(duì)于對(duì)照(灌洗，未包覆珠)而言是特異性的，并以兩個(gè)以上的數(shù)量級(jí)(logs)(或大于100倍)富集。免疫沉淀物可包含活體微生物，包括可培養(yǎng)的細(xì)菌。免疫沉淀物也可包含不可培養(yǎng)的微生物，這可需要下一代測(cè)序以及鳥(niǎo)槍法、宏基因組、下一代測(cè)序。[0074]圖4A-圖4C表明，本文所述的免疫沉淀方法的實(shí)施方式可用于在使用常規(guī)方法被認(rèn)為是無(wú)菌的樣品中檢測(cè)微生物(如病毒)。如本文所述，使用抗IgG或?qū)φ諏?duì)來(lái)自HCV感染患者(圖4A和圖4C中的個(gè)體患者)的血清進(jìn)行免疫沉淀，并由抗hlgG免疫沉淀物和對(duì)照沉淀物分離RNA。對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并使用特異性引物測(cè)試HCV cDNA是否存在。如圖4C中所示(與圖4A為相同樣品)，在抗hlgG免疫沉淀中檢測(cè)到HCV信號(hào)的184倍和117倍的富集，對(duì)照沉淀物中則幾乎不存在信號(hào)。這些附圖表明，本文所述的免疫沉淀程序還可應(yīng)用于“無(wú)菌”環(huán)境(如外周血);并且表明了，如本文所述，使用特異性檢測(cè)這一 HCV陽(yáng)性供體內(nèi)的HCV RNA的引物，能夠沉淀完全的病毒?？呻S后通過(guò)任何基于測(cè)序的手段檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，例如，在病毒的情況下使用宏基因組手段、或?qū)τ诩?xì)菌的情況使用宏基因組手段或基于16S的手段等。[0075]圖5為示出用于本文所述的測(cè)定法和方法的示例性系統(tǒng)的方框圖。[0076]圖6為示出用于本文所述的系統(tǒng)的編碼于計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)上的示例性指令的方框圖。
【具體實(shí)施方式】
[0077]本文提供了用于在患者樣品中檢測(cè)和/或識(shí)別免疫刺激性微生物的“MilP-Seq”(Microbe ImmunoPrecipitation and Sequencing)測(cè)定法和方法。本文還提供了對(duì)感染性疾病進(jìn)行診斷或?qū)颊邩悠分械南惹拔刺卣骰奈⑸镞M(jìn)行識(shí)別的方法。本文所述的測(cè)定法和方法與現(xiàn)有方法相比具有如下優(yōu)勢(shì):(i)不需要用于微生物擴(kuò)增的培養(yǎng)步驟；(ii)并非特異性針對(duì)特定微生物，可以用來(lái)識(shí)別先前未特征化的微生物；以及(iii)由于缺少微生物培養(yǎng)步驟，因此允許快速處理。
[0078]哺乳動(dòng)物宿主(人類和非人類)中生長(zhǎng)著(colonized)各種各樣的共生微生物或致病微生物。免疫系統(tǒng)是否對(duì)微生物產(chǎn)生響應(yīng)表示著微生物對(duì)于宿主是共生的還是致病的。目前的微生物學(xué)方法并未必然地將對(duì)生物體的免疫響應(yīng)作為直接識(shí)別生物體的手段而納入考量。微生物的存在通常由培養(yǎng)或類似類型的生物測(cè)定法確定。然而，僅僅存在微生物并未指明或確定微生物是否對(duì)宿主造成危害。例如，一些個(gè)體中的共生微生物在其它個(gè)體中可以為致病的。
[0079]相反，本文所述的測(cè)定法和方法利用免疫響應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的免疫蛋白對(duì)微生物進(jìn)行直接檢測(cè)，從而識(shí)別和區(qū)分介導(dǎo)特定疾病和失調(diào)的微生物，特別是對(duì)于不能對(duì)生物體進(jìn)行培養(yǎng)的疾病和失調(diào)而言。此外，本文所述的方法適合于范圍廣泛的生物樣品(如體液)的直接分析。
[0080]更具體而言，本文所述的測(cè)定法和方法針對(duì)微生物的檢測(cè)，所述微生物刺激免疫系統(tǒng)并誘發(fā)免疫系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或組件產(chǎn)生免疫蛋白。通過(guò)明確靶向以免疫復(fù)合物的形式存在的免疫蛋白所結(jié)合的微生物，本文所述的測(cè)定法和方法允許僅對(duì)來(lái)自宿主的生物樣品中的誘發(fā)免疫響應(yīng)的微生物進(jìn)行檢測(cè)和/或識(shí)別，而并不對(duì)存在但不引起對(duì)宿主的危害的微生物(例如，共生微生物)進(jìn)行檢測(cè)和/或識(shí)別。因此，通過(guò)關(guān)注結(jié)合至微生物的免疫蛋白，而非僅僅對(duì)微生物進(jìn)行檢測(cè)，本文所述的測(cè)定法和方法提供有針對(duì)性的和無(wú)偏倚的手段來(lái)對(duì)所述誘發(fā)免疫響應(yīng)的微生物進(jìn)行識(shí)別和富集。
[0081]免疫蛋白和免疫復(fù)合物
[0082]本文所述的測(cè)定法和方法針對(duì)微生物的檢測(cè)，所述微生物刺激免疫系統(tǒng)并誘發(fā)免疫系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或組件產(chǎn)生免疫蛋白。因此，在一些實(shí)施方式中，本文所述的測(cè)定法和方法涉及對(duì)一種或多種免疫蛋白或免疫復(fù)合物進(jìn)行檢測(cè)。
[0083]本文所使用的短語(yǔ)“免疫系統(tǒng)刺激性微生物”或“刺激免疫系統(tǒng)的微生物”是指既被受試者或宿主的先天性或獲得性免疫系統(tǒng)識(shí)別、又在受試者中誘發(fā)免疫介導(dǎo)的響應(yīng)的微生物(如細(xì)菌、真菌或病毒)。免疫系統(tǒng)刺激性微生物可以來(lái)自分類單元中的古細(xì)菌域、細(xì)菌域或真核生物域。通常情況下，如在本文中定義的術(shù)語(yǔ)，免疫系統(tǒng)刺激性微生物是“致病的”的，然而在一些情況下，典型的非致病性微生物(例如，共生細(xì)菌)仍然可以在受試者群體的子集(例如，患有炎癥性腸病的受試者)中產(chǎn)生免疫介導(dǎo)的響應(yīng)。因此，術(shù)語(yǔ)“免疫系統(tǒng)刺激性微生物”在本文中不與“致病的”互換使用。
[0084]基本上來(lái)說(shuō)，任何響應(yīng)外來(lái)微生物而活化或分泌的蛋白、或參與免疫介導(dǎo)的除去或結(jié)合微生物的蛋白可用 于與本文所述的測(cè)定法和方法結(jié)合來(lái)制備免疫蛋白富集部分。在免疫響應(yīng)期間，分泌或產(chǎn)生一些可以結(jié)合至微生物或固定微生物的蛋白。結(jié)合至微生物時(shí)，無(wú)論是特異性(例如，抗體)還是非特異性(例如，補(bǔ)體級(jí)聯(lián)(complement cascade)的組分)地，此類免疫蛋白形成“免疫復(fù)合物”，其被用于本文所述的測(cè)定法和方法中以促進(jìn)對(duì)引起免疫響應(yīng)的微生物進(jìn)行檢測(cè)和/或識(shí)別。
[0085]本文所使用的“免疫復(fù)合物”是指免疫蛋白(如抗體或補(bǔ)體分子)與可溶性抗原(如微生物)相結(jié)合的整體。此類包含結(jié)合的微生物的免疫復(fù)合物可使用本文所述的測(cè)定法和方法來(lái)進(jìn)行識(shí)別和/或沉淀。在本文所述的方面的一些實(shí)施方式中，免疫蛋白為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的蛋白(例如，免疫球蛋白)。在本文所述的方法的其它實(shí)施方式中，免疫蛋白為先天性免疫系統(tǒng)的免疫蛋白(例如，補(bǔ)體組分)。
[0086]補(bǔ)體系統(tǒng)
[0087]在本文所述的方面的一些實(shí)施方式中，補(bǔ)體可以為使用本文所述的測(cè)定法和方法來(lái)檢測(cè)或靶向的免疫蛋白或免疫蛋白富集部分的組分。補(bǔ)體系統(tǒng)是指輔助抗體(例如，免疫球蛋白)和免疫系統(tǒng)細(xì)胞來(lái)從生物體中清除病原體的生化級(jí)聯(lián)系統(tǒng)。這是在傳統(tǒng)上稱為先天性免疫系統(tǒng)的免疫系統(tǒng)的一部分，不具有適應(yīng)性(即，在個(gè)體的一生中不發(fā)生變化)。然而，它可以對(duì)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)組分進(jìn)行招募和活化，并且可以通過(guò)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)組分進(jìn)行招募和活化。
[0088]補(bǔ)體系統(tǒng)包括血液中的小型蛋白，所述蛋白由數(shù)種觸發(fā)物(trigger)之一刺激，并誘導(dǎo)系統(tǒng)中的蛋白酶切割特定蛋白以釋放細(xì)胞因子，并起始進(jìn)一步分裂的放大級(jí)聯(lián)反應(yīng)。這一活化級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最終結(jié)果為細(xì)胞殺傷性膜攻擊復(fù)合物(membrane attack complex)的響應(yīng)和激活得以放大。超過(guò)25種蛋白和蛋白片段組成了補(bǔ)體系統(tǒng)，包括血清蛋白、漿膜蛋白(serosal protein)和細(xì)胞膜受體。補(bǔ)體系統(tǒng)通常被分為經(jīng)典補(bǔ)體途徑、替代補(bǔ)體途徑、以及甘露糖結(jié)合凝集 素途徑。任何可以結(jié)合或移除微生物(如細(xì)菌、真菌或病毒)的補(bǔ)體系統(tǒng)的蛋白均可用于使用本文所述的測(cè)定法和方法制備供使用的免疫蛋白富集部分。
[0089]經(jīng)典補(bǔ)體途徑的組分包括C1-復(fù)合物(由1分子的Clq、2分子的Clr和2分子的Cls組成，從而形成Clqr2s2),其在Clq結(jié)合至與抗原復(fù)合的IgG或IgM時(shí)形成、或在Clq直接結(jié)合至病原體表面時(shí)形成；C4及其片段(C4a和C4b) ;C2及其片段(C2a和C2b);經(jīng)典途徑C3轉(zhuǎn)化酶，包含C4b和C2a ；C3及其片段(C3a和C3b);C5轉(zhuǎn)化酶(包含C4b、C2a和C3b);C5及其片段(C5a和C5b) ；C6 ；C7 ；C8 ；C9 ;以及膜攻擊復(fù)合物(包含C5b、C6、C7、C8和C9)。C3b也可以結(jié)合至病原體表面。因此，在本文所述的測(cè)定法和方法的一些實(shí)施方式中，免疫蛋白為C1-復(fù)合物，Clq, C3b,或包含C5b、C6、C7、C8和C9的膜攻擊復(fù)合物。
[0090]替代補(bǔ)體途徑的組分包括C3及其片段(C3a和C3b)，所述片段由C3自發(fā)水解直接觸發(fā)而形成，原因?yàn)橥ㄟ^(guò)縮合反應(yīng)導(dǎo)致的硫酯鍵斷裂；B因子；C3bB復(fù)合物，由B因子與結(jié)合至細(xì)胞膜的C3b相結(jié)合而形成；D因子；片段Ba和Bb，由B因子通過(guò)D因子切割形成；C3bBb或替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶；C3bBb3b，其將C5裂解為C5a和C5b ；C5及其片段(C5a和C5b )；C6 ；C7 ；C8 ;C9 ;以及膜攻擊復(fù)合物(包含C5b、C6、C7、C8和C9)。IgA與替代途徑的活化相聯(lián)系。在本文所述的測(cè)定法和方法的一些實(shí)施方式中，免疫蛋白為C3b，C3bB復(fù)合物，或包含C5b、C6、C7、C8和C9的膜攻擊復(fù)合物。
[0091]甘露糖結(jié)合凝集素途徑包括甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)，這是與MASP-1(甘露聚糖結(jié)合凝集素相關(guān)的絲氨酸蛋白酶)和MASP-1I (兩種蛋白酶酶原)形成復(fù)合物的具有2-6個(gè)頭部的分子。MBL包含識(shí)別碳水化合物的頭部，其結(jié)合至特定排列于病原體磷脂雙分子層上的甘露糖殘基，如微生物的碳水化合物或糖蛋白組分上的甘露糖殘基，所述微生物包括細(xì)菌，如沙門(mén)氏菌(Salmonella)、李斯特菌(Listeria)和奈瑟氏球菌(Neisseria)菌株；真菌病原體，如白色念珠菌(Candida albicans)和新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)；以及病毒，如HIV-1和呼吸道合胞病毒(RSV)。由MBL對(duì)病原體上的碳水化合物進(jìn)行識(shí)別使得MASP-1和MASP-1I活化，從而將補(bǔ)體組分C4和C2切割為C4a、C4b、C2a和C2b。在本文所述的測(cè)定法和方法的一些實(shí)施方式中，免疫蛋白為甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)。
[0092]免瘡球蛋白
[0093]在本文所述的方面的一些實(shí)施方式中，免疫球蛋白可以是使用本文所述的測(cè)定法和方法來(lái)檢測(cè)或靶向的免疫蛋白或免疫蛋白富集部分的組分。從本質(zhì)上講，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的免疫球蛋白均可用于制備免疫球蛋白富集部分(即，免疫蛋白富集部分)。 [0094]免疫球蛋白為具有抗體分子特征性的免疫球蛋白折疊的多肽家族，通常包含兩個(gè)β折疊和保守的二硫鍵。免疫球蛋白超家族的成員參與細(xì)胞性和非細(xì)胞性的體內(nèi)相互作用的許多方面，包括在免疫系統(tǒng)中的廣泛角色(例如，抗體、Τ細(xì)胞受體分子等)、參與細(xì)胞粘附(例如ICAM分子)、以及細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如，受體分子，如TOGF受體)。
[0095]在一些實(shí)施方式中，用作本文所述的測(cè)定法和方法中的免疫蛋白的免疫球蛋白為抗體分子。在一些此類實(shí)施方式中，所述免疫球蛋白為IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一些此類實(shí)施方式中，免疫球蛋白為IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在一些此類實(shí)施方式中，免疫球蛋白為IgAl或IgA2。
[0096]所有的抗體免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu)基于由兩條輕多肽鏈和兩條重多肽鏈組成的單元。每條輕鏈包含稱為輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的兩個(gè)區(qū)域。同樣，免疫球蛋白重鏈包含稱為重鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)的兩個(gè)區(qū)域。
[0097]重鏈或輕鏈的恒定區(qū)由稱為重鏈或輕鏈恒定區(qū)基因(CM)區(qū)段(segment)的基因組序列進(jìn)行編碼。特定重鏈基因區(qū)段的使用限定了免疫球蛋白的類型。例如，在人類中，μ恒定區(qū)基因區(qū)段限定了 IgM類抗體；而Yl、Y2、口或Y 4恒定區(qū)基因區(qū)段的使用則限定了 IgG類抗體，以及由IgGl至IgG4的IgG亞類。同樣，α 1或α 2恒定區(qū)基因區(qū)段的使用限定了 IgA類抗體，以及IgAl和IgA2亞類。δ和ε恒定區(qū)基因區(qū)段則分別限定了 IgD和IgE類抗體。
[0098]免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)中一起含有抗體的抗原結(jié)合域。可變區(qū)要求抗體具有允許與范圍廣泛的抗原相結(jié)合的多樣性。結(jié)合至循環(huán)的抗原的抗體可形成免疫復(fù)合物，這可使用本文所述的測(cè)定法和方法進(jìn)行富集。
[0099]其它免疫蛋白
[0100]也可考慮將其它在響應(yīng)微生物(如細(xì)菌、病毒或真菌)時(shí)誘發(fā)并可與微生物結(jié)合、并可用于形成免疫蛋白富集部分的免疫蛋白用于本文所述的方法和測(cè)定法中。此類免疫蛋白應(yīng)當(dāng)能夠與微生物相結(jié)合，從而形成如本文所述的術(shù)語(yǔ)的免疫復(fù)合物，其可包括但不僅限于:c-反應(yīng)蛋白(CRP)，存在于血液中，并且可與在死亡或?yàn)l臨死亡的細(xì)胞和某些類型的細(xì)菌表面上表達(dá)的磷酸膽堿相結(jié)合；血清淀粉樣蛋白P (SAP);膠原凝集素(collectin),包括表面活性蛋白A(SP-A)、表面活性蛋白D(SP-D)、肝膠原凝集素1 (CL-L1)、胎盤(pán)膠原凝集素1 (CL-P1)、共凝集素(conglutinin)、43kDa的膠原凝集素(CL-43)和46kDa的膠原凝集素(CL-46 )，其包含C-型凝集素域(也稱為碳水化合物識(shí)別域(CRD ))，并被用于選擇性結(jié)合至微生物的特定碳水化合物復(fù)合物；肽聚糖(peptidoglycan)識(shí)別蛋白(PGR) ;LRR、XA21D ；防御素(例如，防御素α 1、中性粒細(xì)胞防御素1、防御素αΙΒ、防御素α 3、中性粒細(xì)胞防御素3、防御素α 4、防御素5、防御素6、0_防御素1、β _防御素2、β -防御素103、β-防御素107、β-防御素110、β-防御素136);脂多糖結(jié)合蛋白(LBP);N0D蛋白，其通過(guò)C-末端富含亮氨酸的區(qū)域與微生物相互作用(N0D1，其識(shí)別含有胞壁酰二肽NAG-NAM- y -D-谷氨?；?內(nèi)消旋-二氨基庚二酸的肽聚糖，其為常見(jiàn)的革蘭氏陰性菌以及少數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌中肽聚糖單體的部分；以及N0D-2，其識(shí)別含有胞壁酰二肽NAG-NAM-L-丙氨?；?異谷氨酰胺的肽聚糖，其存在于幾乎所有細(xì)菌中)；NALPS (NALP1、NALP2、NALP3、NALP4、NALP5、NALP6、NALP7、NALP8、NALP9、NALP10、NALP11、NALP12、NALP13 和 NALP14)、IPAF、以及 NAIP5/Bircle。
[0101]在本文所述的方面的一些實(shí)施方式中，由響應(yīng)微生物(如細(xì)菌、病毒或真菌)而誘發(fā)、可與微生物相結(jié)合從而形成免疫復(fù)合物、并可用于形成免疫蛋白富集部分的免疫蛋白屬于稱為“模式識(shí)別受體”或PRR的分子組。
[0102]模式識(shí)別受體或PRR是指可以特異性結(jié)合至微生物分子的保守部分(由相關(guān)微生物所共有，對(duì)于這些生物體的生存必不可少)的多種受體分子，且并未發(fā)現(xiàn)與非微生物細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)有關(guān)聯(lián)。這些獨(dú)特的微生物分子在本文中稱為“病原體相關(guān)的分子模式(PAMP)”或“微生物相關(guān)的分子模式(MAMP)”?？梢杂蒔RR識(shí)別的微生物相關(guān)的分子模式的實(shí)例包括但不僅限于:革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的脂多糖(LPS);細(xì)菌的脂蛋白和脂肽；革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜中的孔蛋白(porin);革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁中大量存在、革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中存在程度較低的肽聚糖；革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)的脂磷壁酸；抗酸(acid-fast)細(xì)胞壁 中發(fā)現(xiàn)的脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan);富含甘露糖的聚糖(glycan)(甘露糖或果糖作為末端糖的短糖鏈)，在微生物的糖蛋白和糖脂中常見(jiàn)，但在人類的糖蛋白和糖脂中罕見(jiàn)；在細(xì)菌鞭毛中發(fā)現(xiàn)的鞭毛蛋白；細(xì)菌和病毒核酸，因?yàn)榧?xì)菌和病毒的基因組中含有高頻率的非甲基化胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸或CpG序列(缺少甲基或CH3基團(tuán)并與鳥(niǎo)嘌呤相鄰的胞嘧啶)，而哺乳動(dòng)物DNA的CpG序列頻率較低且大部分被甲基化(可以掩蔽模式識(shí)別受體的識(shí)別)，并且人類的DNA和RNA通常不會(huì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)體(endosome)(微生物的DNA和RNA的模式識(shí)別受體位于其中)；N_甲酰甲硫氨酸，細(xì)菌蛋白中的常見(jiàn)氨基酸；雙鏈病毒RNA，為許多病毒在其復(fù)制的一些階段所特有；來(lái)自具有RNA基因組的多種病毒的單鏈病毒RNA ;酵母細(xì)胞壁中的脂磷壁酸、糖脂和酵母多糖；以及磷酸膽堿和微生物膜中的其它常見(jiàn)脂質(zhì)。
[0103]可以用作免疫蛋白或用于形成免疫蛋白富集部分而在本文所述的方法和測(cè)定法中使用的PRR的實(shí)例包括但不僅限于:甘露糖受體，其結(jié)合至富含甘露糖的聚糖(甘露糖或果糖作為末端糖的短糖鏈，在微生物的糖蛋白和糖脂中常見(jiàn)，但在人類的糖蛋白和糖脂中罕見(jiàn))；清道夫受體(scavenger receptor),其可以結(jié)合至細(xì)菌細(xì)胞壁組分(如LPS、肽聚糖和磷壁酸)，并且包括例如⑶36、⑶68和SRB-1 ;調(diào)理素受體，如在血漿中循環(huán)的急性期蛋白(acute phase protein),如甘露糖結(jié)合凝集素和C_反應(yīng)蛋白(CRP)(結(jié)合至細(xì)菌膜中的磷酸膽堿和真菌膜中的磷脂酰乙醇胺)、在肺部的肺泡內(nèi)發(fā)現(xiàn)的表面活性蛋白，如SP-A和SP-D ；N-甲酰蛋氨酸受體，如FPR和FPRL1 ;CD14，其促進(jìn)TLR-4響應(yīng)LPS的能力；含CARD(半胱天冬酶活化和招募結(jié)構(gòu)域)的蛋白，如RIG-1 (視黃酸誘導(dǎo)基因-1)和MDA-5 (黑色素瘤分化相關(guān)基因-5)，其為細(xì)胞質(zhì)的傳感器，識(shí)別在病毒感染的細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒雙鏈和單鏈RNA分子，并觸發(fā)稱為干擾素的細(xì)胞因子(阻斷在感染的宿主細(xì)胞內(nèi)的病毒復(fù)制)的合成；以及Toll樣受體或TLR家族的成員，其直接或間接地與不同微生物分子相結(jié)合。
[0104]TLR家族的不同成員對(duì)于不同的MAMP具有結(jié)合特異性，如TLR-2識(shí)別肽聚糖、細(xì)菌脂蛋白、脂磷壁酸(LTA)和孔蛋白；TLR-4識(shí)別革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的脂多糖(LPS)、真菌甘露聚糖、病毒包膜蛋白、寄生磷脂和熱休克蛋白；TLR-5識(shí)別細(xì)菌鞭毛；TLR-l/TLR-2對(duì)與寄生蟲(chóng)中的糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白和細(xì)菌脂肽特異性結(jié)合；TLR-2/TLR-6對(duì)與革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁的脂磷壁酸(LTA)、細(xì)菌脂肽和肽聚糖結(jié)合；TLR-3，與雙鏈病毒RNA結(jié)合；TLR-7，與單鏈病毒RNA (如艾滋病中)(富含鳥(niǎo)嘌呤/尿嘧啶核苷酸對(duì))結(jié)合；TLR-8，與單鏈病毒RNA結(jié)合；TLR-9，與在細(xì)菌和病毒基因組中發(fā)現(xiàn)的未甲基化的胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸序列(CpG DNA)結(jié)合。
[0105]患者和患者樣品
[0106]若生物樣品包含免疫蛋白，如補(bǔ)體蛋白、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、或病原體識(shí)別受體(PRR)，則來(lái)自患者的生物樣品可以使用本文所述的測(cè)定法和方法從待分析個(gè)體的任何器官或組織中獲得。在一些實(shí)施方式中，此類樣品可以進(jìn)一步處理，以對(duì)樣品中期望的免疫蛋白進(jìn)行富集，從而產(chǎn)生如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“免疫蛋白富集樣品”。在其它實(shí)施方式中，可在制備免疫蛋白富集部分之前對(duì)生物樣品進(jìn)行進(jìn)一步分離或純化。例如，可以通過(guò)例如以抗凝血?jiǎng)?如肝素)處理全血樣品、離心樣品直至細(xì)胞沉淀以允許從上層水層中去除血漿，從而從全血樣品中分離血漿和血清?？梢詮纳飿悠坊蚋鶕?jù)如上文所述或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式處理過(guò)的樣品中檢測(cè)蛋白和核酸。
[0107]用于本文所述的 方法和測(cè)定法的生物樣品的一些非限制性實(shí)例包括血液樣品、尿樣品、精液樣品、淋巴液樣品、腦脊液樣品、血漿樣品、血清樣品、膿液(pus )樣品、羊水樣品、體液樣品、糞便樣品、腸灌洗樣品、活檢樣品、拭子(swab )樣品、口腔漱洗樣品、組織樣品、皮膚分泌物樣品，或此類樣品的組合。對(duì)于本文所述的方法，生物樣品優(yōu)選來(lái)自全血、血漿、腸灌洗樣品、腦脊液、關(guān)節(jié)液、血清、和/或呼吸道樣品，如呼吸道分泌物(如痰)或呼吸道灌洗液(如支氣管肺泡灌洗液)。術(shù)語(yǔ)“生物樣品”包括由初始樣品衍生的樣品，例如，在進(jìn)一步處理后用于本文所述的測(cè)定法和方法的生物樣品。此類衍生樣品例如可包括由樣品提取的核酸或蛋白；或經(jīng)由將所述樣品進(jìn)行如核酸擴(kuò)增或mRNA逆轉(zhuǎn)錄，或?qū)μ囟ê怂?、蛋白、其它?xì)胞質(zhì)組分或核組分進(jìn)行分離和/或純化等技術(shù)而獲得的核酸或蛋白。
[0108]術(shù)語(yǔ)“患者”、“受試者”和“個(gè)體”在本文中可互換使用，是指動(dòng)物，特別是人，對(duì)于所述受試者，期望對(duì)由其獲得的生物樣品中免疫系統(tǒng)刺激性微生物的存在進(jìn)行分析。在一些實(shí)施方式中，受試者需要對(duì)疾病或失調(diào)進(jìn)行診斷，例如對(duì)炎癥性腸病、感染性疾病或自身免疫性失調(diào)進(jìn)行診斷，其中，使用本文所述的方法和測(cè)定法對(duì)生物樣品進(jìn)行分析。
[0109]制備免疫蛋白g集部分
[0110]用于本文所述的方法的免疫蛋白富集部分通常通過(guò)免疫沉淀來(lái)制備，免疫沉淀是指使用特異性結(jié)合至特定蛋白抗原的抗體，將蛋白抗原或蛋白復(fù)合物(例如，與微生物結(jié)合的免疫蛋白(如IgG)、PRR、或補(bǔ)體)由溶液中沉淀出來(lái)的技術(shù)。對(duì)免疫蛋白進(jìn)行免疫沉淀的方法在本領(lǐng)域是公知的和/或在例如美國(guó)專利N0.4，618，589中有所描述(以引用的方式將其整體并入本文)。本文中提供了關(guān)于免疫沉淀方法的注意事項(xiàng)的一般概述，并且，如本文所證實(shí)的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地改進(jìn)這些注意事項(xiàng)來(lái)為用于檢測(cè)結(jié)合的微生物的期望的免疫蛋白進(jìn)行免疫沉淀方案的優(yōu)化。
[0111]免疫沉淀是一種基于親和性的分子“下拉”方法，該方法允許本領(lǐng)域技術(shù)人員使用任何親和結(jié)合劑(所述親和結(jié)合劑例如直接綴合至聚合物載體，對(duì)一個(gè)或多個(gè)特定生物分子靶標(biāo)具有特異性親和性)對(duì)復(fù)合物進(jìn)行純化。免疫沉淀的基本過(guò)程包括三個(gè)階段。第一階段涉及制備抗原溶液或裂解物。第二階段涉及預(yù)清除抗原溶液或裂解物的非特異性背景結(jié)合；第三階段涉及免疫復(fù)合物的形成和純化。純化后，可以采用許多方法中的任一種來(lái)對(duì)通過(guò)免疫沉淀過(guò)程“下拉”的抗原和材料進(jìn)行分析?？捎糜诨谟H和性的分子下拉與免疫沉淀技術(shù)的多種程序在Harlow，E.和Lane，D.(編輯)，“抗體:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，第7章，ColdSpring Harbor Press，紐約(1988)中有詳細(xì)描述，以引用的方式將其內(nèi)容整體并入本文。
[0112]在本文所述的方法的各個(gè)方面和實(shí)施方式中，免疫沉淀可使用由患者獲得的待用作用于進(jìn)行免疫沉淀的溶液的任何生物樣品進(jìn)行。在本文中還涵蓋了如下情況:在一些實(shí)施方式中，通過(guò)將包含細(xì)胞或組織的患者樣品與溫和的清潔劑接觸而由該樣品制備裂解物。溫和的清潔劑在除去膜、干擾多種弱分子間相互作用及從細(xì)胞中釋放大多數(shù)抗原這些方面有效，并且不破壞感興趣的抗原(如結(jié)合至微生物的免疫蛋白)的構(gòu)象或生化活性。通過(guò)以不與感興趣的抗原(例如本文所述的免疫蛋白)結(jié)合的抗體對(duì)抗原溶液進(jìn)行預(yù)處理而使非特異性結(jié)合的蛋白的干擾最小化，以除去非特異性結(jié)合的蛋白。
[0113]用于使用本文所述的方法對(duì)微生物進(jìn)行分析和測(cè)定的完整蛋白復(fù)合物(如患者樣品中存在的免疫復(fù)合物)的免疫沉淀通過(guò)選擇親和結(jié)合劑(如抗體或其片段)起作用，其靶向已知的蛋白(例如免疫蛋白，如補(bǔ)體蛋白、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、或病原體識(shí)別受體(PRR))，該已知蛋白被認(rèn)為是復(fù)合物的組件(member )。通過(guò)使用抗體或其片段祀向這一已知組件，使得如下成 為可能:將整個(gè)蛋白復(fù)合物從溶液中拉出，從而識(shí)別和/或檢測(cè)該免疫復(fù)合物中的未知組分(如結(jié)合至免疫蛋白的微生物)。在本文所述的方法中使用的免疫復(fù)合物的免疫沉淀可以通過(guò)向裂解物或患者樣品中加入親和結(jié)合劑(如，在一些實(shí)施方式中為抗體或其片段，所述抗體或其片段對(duì)所富集的免疫蛋白具有特異性)而實(shí)現(xiàn)?？贵w對(duì)于其各自的抗原具有高親和力，因此迅速形成抗體-抗原復(fù)合物。在本文所述的方法的一些實(shí)施方式中，用于對(duì)免疫復(fù)合物進(jìn)行免疫沉淀的親和結(jié)合劑例如可包括對(duì)于一類或一組目標(biāo)免疫蛋白(例如，全部人類IgG分子，無(wú)論任何亞類)具有特異性的蛋白或分子；或?qū)τ诰哂泄餐慕Y(jié)構(gòu)域的一組免疫蛋白具有特異性的蛋白或分子。
[0114]因此，本文所述的免疫沉淀步驟可用于產(chǎn)生在本文所述的測(cè)定法和方法中所使用的免疫蛋白富集部分。“免疫蛋白富集部分”是指部分純化(例如，通過(guò)免疫沉淀)的樣品，所述部分純化使得期望的或目標(biāo)免疫蛋白(例如，免疫球蛋白、補(bǔ)體、PRR、或先天性或適應(yīng)性免疫相應(yīng)的其它可溶性/循環(huán)組分)在樣品中的水平與衍生所述樣品的初始患者樣品相比提高至少10%。在一些實(shí)施方式中，與衍生所述樣品的患者樣品相比，富集部分中的免疫蛋白水平提高至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%、至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍以上。由此產(chǎn)生的免疫蛋白富集部分隨后用于本文所述的測(cè)定法和方法中，從而對(duì)任何結(jié)合至目標(biāo)免疫蛋白的微生物進(jìn)行識(shí)別。[0115]任何對(duì)于目標(biāo)免疫蛋白具有親和性和特異性的親和結(jié)合劑均可以用于本文所述的免疫沉淀方法?！坝H和結(jié)合劑”為對(duì)于目標(biāo)免疫蛋白、免疫蛋白類、或免疫蛋白家族具有高親和性和特異性的試劑(如蛋白(例如抗體或其片段))，其可用于制備在本文所述的測(cè)定法和方法中使用的免疫蛋白富集部分。對(duì)用于制備免疫蛋白富集部分的親和結(jié)合劑的選擇涉及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的注意事項(xiàng)，如具有期望特異性和親和性的親和結(jié)合劑的可利用性、由所述親和結(jié)合劑靶向的不同免疫蛋白的數(shù)量和/或類型、具有同等特異性和/或親和性的不同親和結(jié)合劑的相對(duì)成本等。
[0116]相應(yīng)地，在本文所述的方法的一些實(shí)施方式中，使用抗體或其片段作為親和結(jié)合劑制備免疫蛋白富集部分。適于制備免疫蛋白富集部分并進(jìn)行如本文所述的MilP-Seq方法和測(cè)定法的免疫沉淀步驟的抗體優(yōu)選為單克隆特異性抗體，可包括但不僅限于:小鼠、大鼠、兔、驢、山羊、人或嵌合抗體(chimeric antibody),并且可以包括單鏈抗體、Fab片段、F(ab')片段、由Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段、和/或任何上述抗體的抗原結(jié)合片段。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，用于本文所述的方法的抗體及其抗原結(jié)合片段的優(yōu)點(diǎn)包括針對(duì)任何期望的免疫蛋白、免疫蛋白類、或免疫蛋白家族而產(chǎn)生所述抗體及其抗原結(jié)合片段的能力。
[0117]術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指由大體上均質(zhì)的抗體群中獲得的抗體，即，除了可能少量存在的可能的自然發(fā)生的突變以外，抗體群中所包含的各個(gè)抗體均是相同的。單克隆抗體針對(duì)單一抗原(如免疫蛋白)具有高度特異性。此外，與通常包括針對(duì)抗原的不同決定簇(表位)(例如，免疫蛋白(如IgG分子或PRR)上的多個(gè)位點(diǎn))的不同抗體的多克隆抗體制劑不同，每一單克隆抗體均針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。修飾語(yǔ)“單克隆”不應(yīng)解釋為要求由任何特定方法進(jìn)行抗體生產(chǎn)。例如，根據(jù)本發(fā)明所使用的單克隆抗體可以通過(guò)Kohler等，Nature256:495 (1975)首先描述的雜交瘤方法制備，或者可以通過(guò)重組DNA法(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利N0.4，816，567)制備?！皢慰寺】贵w”也可以通過(guò)使用例如Clackson等，Nature352:624-628 (1991)或 Marks 等，J.Mol.Biol.222:581-597 (1991)中所描述的技術(shù)由噬菌體抗體文庫(kù)中分離。存在許多用于獲取對(duì)在本文所述的免疫沉淀步驟中使用的免疫蛋白具有特異性的單克隆抗體或其片段的商業(yè)來(lái)源，所述商業(yè)來(lái)源包括但不僅限于:BDBiosciences、eBioscienc es、RnD Systems、Invitrogen、BioLegend、Abeam 等。
[0118]在一些實(shí)施方式中，用于本文所述的方法的免疫沉淀步驟的抗體可以是雙特異性抗體或多特異性抗體。此類抗體例如在期望具有針對(duì)免疫蛋白富集部分中的兩種以上免疫蛋白的特異性的情況下是有用的。在一些此類實(shí)施方式中，可以使用具有IgG樣結(jié)構(gòu)的雙特異性抗體，其中，一個(gè)抗原結(jié)合區(qū)(由VH和VL結(jié)構(gòu)域組成)特異性結(jié)合至一種免疫蛋白；另一個(gè)抗原結(jié)合區(qū)(也由VH和VL結(jié)構(gòu)域組成)特異性結(jié)合至另一種免疫蛋白。在一些實(shí)施方式中，每一可變區(qū)(2個(gè)VH區(qū)和2個(gè)VL區(qū))被替換為dAb或單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。包含于IgG樣結(jié)構(gòu)中的dAb或單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域可具有相同特異性或不同特異性。在一些實(shí)施方式中，IgG樣結(jié)構(gòu)是四價(jià)的，并可具有兩種、三種或四種特異性。IgG樣結(jié)構(gòu)的抗原結(jié)合片段(例如，F(xiàn)ab、F(ab' )2、Fab'、Fv、scFv)可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備。在其它實(shí)施方式中，雙特異性抗體包括交聯(lián)抗體或“雜綴合物(heteroconjugate)”抗體。例如，雜綴合物中的抗體之一可結(jié)合至親和素(avidin)、另一抗體則結(jié)合至生物素。此類抗體例如已被提出用于使免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不需要的細(xì)胞(美國(guó)專利號(hào)4676980);以及用于治療HIV感染(W0 91/00360.W0 92/200373、以及EP 03089)。雜綴合物抗體可以使用任何方便的交聯(lián)方法制得。合適的交聯(lián)劑在本領(lǐng)域中是公知的，并在美國(guó)專利N0.4，676，980中和許多交聯(lián)技術(shù)一同公開(kāi)。
[0119]在一些實(shí)施方式中，用于在本文所述的方法的免疫沉淀步驟中使用的抗體可包括“抗體片段(antibody fragment)” 或“其抗體片段(antibody fragment thereof)”。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“抗體片段”或“其抗體片段”是指僅包含完整抗體的一部分的蛋白片段，通常包含完整抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，并因此保留結(jié)合抗原(如免疫蛋白)的能力。所涵蓋的用于本文所述的方法的抗體片段的實(shí)例包括:(i)Fab片段，具有VL、CL、VH和CH1結(jié)構(gòu)域；(ii)Fab/片段，為在CH1結(jié)構(gòu)域的C-末端具有一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基的Fab片段；(iii)具有VH和CH1結(jié)構(gòu)域的Fd片段；(iv)具有VH和CH1結(jié)構(gòu)域并在CH1結(jié)構(gòu)域的C-末端具有一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基的Fd’片段；(v)具有抗體單臂上的VL和VH結(jié)構(gòu)域的Fv片段；(vi )由 VH 結(jié)構(gòu)域組成的 dAb 片段(Ward 等，Nature341, 544-546 (1989))； (vii )分離的 CDR區(qū)；(viii)F(ab' ) 2片段，為包含兩個(gè)Fab'片段(這兩個(gè)片段在鉸鏈區(qū)由二硫橋連接)的二價(jià)片段;(ix)單鏈抗體分子(例如單鏈 Fv ；scFv) (Bird 等,Science242:423-426 (1988)和Huston等，PNAS (USA)85:5879-5883 (1988)); (x)具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的“雙抗體”，其包含在同一多肽鏈上連接至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)(參見(jiàn)，例如，EP 404, 097 ；W0 93/11161 ;以及 Hollinger 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90:6444-6448(1993)) ;(xi)包含一對(duì)串聯(lián)Fd區(qū)段(VH-CH1-VH-CH1)的“線性抗體”，其與互補(bǔ)的輕鏈多肽形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)(Zapata等，Protein Eng.8 (10):1057-1062 (1995)和美國(guó)專利N0.5，641，870)。 [0120]在本文所述的方法的一些實(shí)施方式中，免疫富集部分使用不是抗體或抗原結(jié)合片段的蛋白分子作為親和結(jié)合劑而制備，所述蛋白分子例如為蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L
坐寸。
[0121]蛋白A是40_60kDa的MSCRAMM表面蛋白，最初發(fā)現(xiàn)于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的細(xì)胞壁中。蛋白A包含5個(gè)同源Ig結(jié)合域，折疊成一個(gè)三螺旋束，其中每一個(gè)都能夠結(jié)合來(lái)自許多不同的哺乳動(dòng)物的蛋白，尤其是IgG。蛋白A在多數(shù)免疫球蛋白的Fc區(qū)域內(nèi)與重鏈結(jié)合，并且在人VH3抗體家族的情況下還在Fab區(qū)域內(nèi)與重鏈結(jié)合。蛋白A以高親和性與人IgGl、IgG2和IgG4以及小鼠IgG2a和IgG2b結(jié)合。蛋白A以中等親和性至高親和性與人IgM、IgA和IgE以及小鼠IgG3和IgGl結(jié)合。蛋白A與人IgG3或I⑶不起反應(yīng)，也不與小鼠IgM、IgA或IgE起反應(yīng)。因此，在本文所述的方法的一些實(shí)施方式中，當(dāng)本文所述的方法中的目標(biāo)免疫蛋白為人IgGl、人IgG2、人IgG3或它們的任意組合時(shí)，使用蛋白A作為親和結(jié)合劑。在本文所述的方法的一些實(shí)施方式中，當(dāng)本文所述的方法中的目標(biāo)免疫蛋白為人IgA、人IgM、人IgE或它們的任意組合時(shí)，使用蛋白A作為親和結(jié)合劑。在本文所述的方法的一些實(shí)施方式中，當(dāng)本文所述的方法中的目標(biāo)免疫蛋白為人IgGl、人IgG2、人IgG3、人IgA、人IgM、人IgE或它們的任意組合時(shí)，使用蛋白A作為親和結(jié)合劑。
[0122]蛋白G為在C族和G族鏈球菌中表達(dá)的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，與蛋白A很相似，但具有不同的特異性。蛋白G為65-kDa (G148蛋白G)和58kDa (C40蛋白G)的細(xì)胞表面蛋白。天然分子還結(jié)合白蛋白，然而，由于血清白蛋白是抗體源的主要污染物，因此白蛋白結(jié)合位點(diǎn)已從重組型蛋白G中移除。蛋白G以高親和性與所有人類IgG亞類結(jié)合，即，人IgGl、人IgG2、人IgG3和人IgG4，但不與人IgG、IgM、IgA、IgD和IgE結(jié)合。因此，在本文所述的方法的一些實(shí)施方式中，當(dāng)本文所述的方法中的目標(biāo)免疫蛋白為人IgGl、人IgG2、人IgG3、人IgG4或它們的任意組合時(shí)，使用蛋白G作為親和結(jié)合劑。
[0123]蛋白Α/G是聯(lián)合了蛋白A和蛋白G兩者的IgG結(jié)合域的重組融合蛋白。蛋白A/G包含4個(gè)來(lái)自蛋白A的Fc結(jié)合域和2個(gè)來(lái)自蛋白G的Fc結(jié)合域。與蛋白A相比，蛋白A/G的結(jié)合比較不依賴于pH值，但除此以外具有蛋白A和蛋白G的額外特性。蛋白Α/G與人IgG的所有亞類(即，人IgGl、人IgG2、人IgG3和人IgG4)以及IgA、IgE、IgM和IgD (與IgD的程度較低)結(jié)合。相應(yīng)地，在本文所述的方法的一些實(shí)施方式中，當(dāng)本文所述方法中的目標(biāo)免疫蛋白為人IgGl、人IgG2、人IgG3、人IgG4、IgA、IgE、IgM、IgD或它們的任意組合時(shí)，使用蛋白A/G作為親和結(jié)合劑。
[0124]蛋白L最早由大消化鏈球菌(Peptostreptococcus magnus)細(xì)菌的表面分離，并發(fā)現(xiàn)其通過(guò)L鏈相互作用與免疫球蛋白結(jié)合。蛋白L不包含任何鏈間二硫環(huán)，也并非由二硫鍵連接的亞基組成。與結(jié)合至免疫球蛋白Fc區(qū)域的蛋白A和蛋白G不同，蛋白L通過(guò)輕鏈kappa相互作用與抗體結(jié)合。由于在結(jié)合相互作用中不涉及重鏈的任何部分，因此蛋白L結(jié)合的抗體類比蛋白A或蛋白G范圍更廣。蛋白L與典型的全部抗體類結(jié)合，包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。單鏈可變片段(scFv)和Fab片段也與蛋白L結(jié)合。蛋白L結(jié)合限于包含kappa輕鏈的抗體,并且在此類抗體中僅與kappa輕鏈的特定亞型結(jié)合。例如，蛋白L與人Vk 1.Vk III和Vk IV亞型結(jié)合，但不與Vk II亞型結(jié)合。因此，在本文所述的方法的一些實(shí)施方式中，當(dāng)目標(biāo)免疫蛋白為包含人Vk 1.Vk III和Vk IV亞型輕鏈的任何人Ig分子(IgG、IgM、IgA、IgE和IgD)時(shí)，使用蛋白L作為親和結(jié)合劑。
[0125]在本文所述的方法的一些實(shí)施方式中，對(duì)目標(biāo)免疫蛋白具有特異性的親和結(jié)合劑(例如，蛋白G、蛋白A、對(duì)特定蛋白或蛋白類/家族/族具有特異性的抗體或其片段)被固定于固相基底(例如超順磁微珠或微尺度瓊脂糖珠或瓊脂糖樹(shù)脂珠(非磁性))上。隨后可通過(guò)以下方法對(duì)免疫蛋白復(fù)合物進(jìn)行純化:將親和性珠懸浮液(如蛋白A或蛋白G珠懸浮液)或預(yù)包覆有對(duì)免疫蛋白具有特異性的抗體或其片段的珠(如抗-1gG、抗-1gA、或抗補(bǔ)體組分的預(yù)包覆珠，例如MACS順磁珠(Miltenyi Biotec.))加入含有抗體-抗原復(fù)合物的溶液中。例如，當(dāng)免疫蛋白富集部分包含IgG或IgA作為欲沉淀的免疫蛋白、并且使用蛋白A或蛋白G作為親和結(jié)合劑時(shí)，由于蛋白A和蛋白G對(duì)于抗體的Fc部分具有高親和性，因此發(fā)生純化。
[0126]在其它實(shí)施方式中，將親和結(jié)合劑(如蛋白G、蛋白A、對(duì)特定蛋白或蛋白類/家族/族具有特異性的抗體或其片段)直接加入包含待富集的免疫蛋白(如免疫球蛋白、PRR、補(bǔ)體蛋白)的樣品中。在此類實(shí)施方式中，親和結(jié)合劑未附著至固相載體，因此，例如，親和結(jié)合劑自由浮動(dòng)于包含待富集的免疫蛋白的樣品周圍，并與它們的目標(biāo)結(jié)合。隨后，將包覆有第二親和結(jié)合劑(如對(duì)第一親和結(jié)合劑具有特異性的蛋白Α/G)的珠添加至親和結(jié)合劑(例如抗體或其片段)與免疫蛋白復(fù)合物的混合物。目前與其免疫蛋白目標(biāo)相結(jié)合的親合結(jié)合劑(例如抗體或其片段)隨后可由第二親和結(jié)合劑與珠結(jié)合。
[0127]在目標(biāo)免疫復(fù)合物通過(guò)例如免疫蛋白Α/G-抗體相互作用而結(jié)合至珠之后，通過(guò)離心收集珠，并通過(guò)洗滌珠除去未結(jié)合的蛋白。可以通過(guò)如下方式對(duì)珠進(jìn)行清洗:使用如裂解緩沖液的溶液沖洗珠并通過(guò)抽吸除去裂解物和洗滌緩沖液。完全除去洗滌緩沖液對(duì)于降低背景和提高免疫測(cè)定法的有效性是很重要的。
[0128]適合用于實(shí)施本文所述的MilP-Seq方法的免疫沉淀步驟的珠或其它固相載體平臺(tái)可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何形式或材料?？梢允褂酶叨嗫仔原傊侵?也被稱為瓊脂糖樹(shù)脂或衆(zhòng)料(slurry)),由于瓊脂糖顆粒(大小50至150微米)的幾乎全部海綿狀結(jié)構(gòu)均可用于親和性結(jié)合劑(如抗體或其片段)的附著，該珠具有非常高的潛在結(jié)合能力。
[0129]超順磁珠也可以用于本文所述的Milp-Seq測(cè)定法和方法的一些實(shí)施方式中。此類磁珠為固體，，取決于不同的珠類型，通常是球形的，并且，親和結(jié)合劑(如抗體或其片段、蛋白A、蛋白G等)的結(jié)合被限制于各珠的表面。磁珠明顯小于瓊脂糖珠(1至4μπι)，并且，雖然這些珠不具備增加結(jié)合能力的多孔中心這一優(yōu)點(diǎn)，較高的每體積的磁珠數(shù)總體使得磁珠具有用于最佳結(jié)合的有效表面面積與體積的比值?？缮藤?gòu)的磁珠可根據(jù)大小的均一程度分為單分散珠和多分散珠。單分散珠也稱為微珠，表現(xiàn)出精確的均一'I"生，因此，全部珠具有相同的物理特性(包括結(jié)合能力和對(duì)磁鐵的吸引水平)。多分散珠盡管與單分散珠大小相似，但顯示出寬范圍的大小可變性(1至4μπΟ，其可以影響所述多分散珠的結(jié)合能力和磁場(chǎng)捕獲。雖然可用于本文所述的測(cè)定法和方法的免疫沉淀步驟的這兩種類型的珠均是可商購(gòu)的，然而質(zhì)量更高的單分散超順磁珠憑借其一致的尺寸、形狀和性能而更加適合用于自動(dòng)化方案。單分散性超順磁珠和多分散性超順磁珠由許多公司提供，包括但不僅限于Invitrogen、Thermo Scientific 以及 Millipore。
[0130]在免疫復(fù)合物的形成和純化完成后，可立即對(duì)產(chǎn)生的免疫沉淀的蛋白或免疫蛋白復(fù)合物進(jìn)行進(jìn)一步分析，或?qū)⑵浯鎯?chǔ)以用于后續(xù)分析。通常，在傳統(tǒng)免疫沉淀方法中，下一步驟為通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白。然而，在本文所述的MilP-Seq方法中，接下來(lái)通過(guò)如下方式對(duì)免疫沉淀的免疫復(fù)合物在核酸水平上進(jìn)行分析:裂解免疫沉淀的免疫復(fù)合物的微生物組分或細(xì)胞，從裂解的微生物 組分中提取核酸，并對(duì)提取的核酸進(jìn)行測(cè)序。
[0131]對(duì)微生物核酸進(jìn)行提取
[0132]從樣品(如來(lái)自如本文所述的免疫沉淀的免疫復(fù)合物的微生物組分的裂解提取物)中提取核酸的方法是本領(lǐng)域中的常規(guī)方法，其包括例如如下方法:苯酚-氯仿沉淀、基于離心柱(spin column)的核酸純化、乙醇沉淀和柱純化。這些方法是本領(lǐng)域中公知的，并且，用于核酸純化的試劑盒可容易地由商業(yè)來(lái)源(如QIAGEN?、Mo-Biol?以及
SIGMA-ALDRICH*)獲得。
[0133]對(duì)提取的核酸進(jìn)行測(cè)序
[0134]由免疫蛋白富集部分中提取的核酸可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任何方法(包括例如，鳥(niǎo)槍法克隆和下一代測(cè)序法)進(jìn)行測(cè)序。
[0135]在本文所述的方法和測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，對(duì)提取的核酸的測(cè)序通過(guò)Sanger測(cè)序方法或其變體進(jìn)行。這一過(guò)程涉及制備樣品(通常為PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增產(chǎn)物或擴(kuò)增子)。在本文所述的方法和測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，從免疫蛋白富集部分中提取的核酸在測(cè)序前不進(jìn)行擴(kuò)增。隨后對(duì)所提取的核酸樣品或其擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)(即，ABI’ s BigDye終止子循環(huán)反應(yīng)(terminator cycle reaction)),在該反應(yīng)中，DNA聚合酶摻入2' ,3' -二脫氧-dNTP終止子，產(chǎn)生早期鏈終止DNA片段。采用電泳分析對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行分析，測(cè)序結(jié)果示于色譜圖中。在自動(dòng)測(cè)序儀中，一輪ABI的96通道毛細(xì)管電泳(CE)分析產(chǎn)生總數(shù)為96X700、或67k堿基(kbp)的讀段(read)。在CE測(cè)序中，對(duì)每個(gè)序列制備測(cè)序樣品，并隨后加載于96孔板中。有文獻(xiàn)報(bào)道，微芯片上的CE允許更快和更簡(jiǎn)單的結(jié)果，但操作模式基本上類似于自動(dòng)化CE測(cè)序儀。
[0136]在本文所述的方法和測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，對(duì)提取的核酸使用的測(cè)序方法為焦磷酸測(cè)序(pyrosequencing)。焦磷酸測(cè)序在多種出版物和專利(包括例如，美國(guó)專利N0.6，210, 891,7, 264，929和7，335，762)中已有所描述。在焦磷酸測(cè)序中，通過(guò)使用沉積于PTP孔中的1百萬(wàn)或2百萬(wàn)珠進(jìn)行乳液PCR來(lái)制備模板。硫酸化酶(sulphurylase)和熒光素酶(luciferase)附著的較小的珠圍繞于模板珠周圍，并且個(gè)體磷酸脫氧核苷酸(dNTP)被依次分配于各個(gè)孔中。當(dāng)與模板互補(bǔ)的dNTP摻入增長(zhǎng)鏈時(shí)，焦磷酸鹽(ppi)被釋放，并轉(zhuǎn)化為ATP。ATP將熒光素氧化為氧化熒光素并釋放出光。檢測(cè)器檢測(cè)釋放的光并將該事件與摻入的dNTP建立聯(lián)系。這一技術(shù)提供了約400個(gè)堿基的讀段，并可檢測(cè)約6個(gè)堿基的均聚物鏈。[0137]在本文所述的方法和測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，使用連接反應(yīng)(ligation)對(duì)提取的核酸進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)連接反應(yīng)進(jìn)行的測(cè)序已在多種出版物和專利中有所描述，包括美國(guó)專利N0.5,912, 148和6，130,073。在“通過(guò)連接反應(yīng)進(jìn)行的測(cè)序”中，約一百百萬(wàn)個(gè)乳液PCR模板珠沉積在載玻片上，并將通用引物退火至模板上。將含有兩組探測(cè)堿基(interrogation base)(每組探測(cè)堿基具有與其相連的選定的染料)的探針加入模板，與目標(biāo)序列互補(bǔ)的探針則與之退火。探針內(nèi)的16種不同的二核苷酸以4種不同的染料進(jìn)行編碼。根據(jù)四色成像，連接的二核苷酸探針被化學(xué)裂解，產(chǎn)生磷酸基團(tuán)。雜交、連接、成像和裂解的循環(huán)總共重復(fù)七次，從而可識(shí)別正確的兩個(gè)堿基序列。然后，從模板中移除通用引物，并使用η-l引物進(jìn)行第二輪連接,所述連接使得探測(cè)堿基之一連結(jié)至51末端(sets theinterrogation base one base to the51 end)。再進(jìn)行七輪雜交、連接、成像和裂解，并再進(jìn)行3輪的移除和連接，產(chǎn)生以色彩空間編碼的35數(shù)據(jù)位的字符串(string)。將這些字符串與參比基因組進(jìn)行比對(duì)，從而解碼該DNA序列。
[0138]存在兩種采用可逆終止子來(lái)完成供本文所述的方法和測(cè)定法使用的DNA測(cè)序的技術(shù)。在第一種技術(shù)中，DNA片段的橋式擴(kuò)增隨機(jī)分布在載玻片的8個(gè)通道上，高密度的正向和反向引物與這些片段共價(jià)連接。固相擴(kuò)增由個(gè)體單鏈模板產(chǎn)生約8000萬(wàn)個(gè)分子簇。引物退火至模板中各分子簇的游離末端。聚合酶延伸并隨后由四種可逆終止子組終止DNA合成，各終止子標(biāo)記有不同染料。未摻入的可逆終止子被洗滌去除，并使用四色成像完成堿基識(shí)別。通過(guò)化學(xué)裂解除去阻斷和染料基團(tuán)，以使得可以進(jìn)行另一循環(huán)。在使用可逆終止子的第二種技術(shù)中，數(shù)百萬(wàn)的未擴(kuò)增的ssDNA模板被制備為帶有聚(dA)尾，該聚(dA)尾與共價(jià)結(jié)合至載玻片上的聚(dT)引物雜交。對(duì)于一通測(cè)序(one pass sequencing),這一引物-模板復(fù)合物是足夠的；但對(duì)于雙通測(cè)序(two pass sequencing),模板鏈被拷貝，原始模板被移除并將引物朝向表面退火。與第一可逆終止子技術(shù)不同，可逆終止子均標(biāo)記有相同的染料，并以預(yù)定的順序各自進(jìn)行分配。摻入事件引發(fā)熒光信號(hào)。美國(guó)專利N0.7，169，560描述了利用這種可逆引物技術(shù)的方法。
[0139]在本文所述的方法和測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，將如下測(cè)序用于所提取的核酸:利用標(biāo)記有熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的分子的DNA聚合酶，通過(guò)在cognate dNTP (其末端磷酸基團(tuán)處標(biāo)記有FRET分子)的摻入過(guò)程中產(chǎn)生的FRET信號(hào)進(jìn)行的測(cè)序。標(biāo)記的dNTP在與模板鏈具有正確互補(bǔ)性時(shí)摻入，而由于兩個(gè)FRET分子之間的相互作用的FRET標(biāo)記了堿基延伸事件，由此產(chǎn)生序列讀段。此方法的優(yōu)點(diǎn)在于，實(shí)時(shí)記錄DNA聚合，并合成不作任何修飾的常規(guī)DNA，從而可記錄更長(zhǎng)的DNA讀段(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利N0.7，329，492、美國(guó)專利 N0.7，361，466 ；Eid, J.等，(2009 年):323 (5910):133_8)。
[0140]為了提高速度和降低成本的這些目標(biāo)，已經(jīng)在包括通過(guò)雜交、通過(guò)合成(3’ -延伸)、通過(guò)連接、通過(guò)聚合酶克隆(polony)聚合、通過(guò)納米孔、通過(guò)染料標(biāo)記的dNTP的聚合酶摻入、以及通過(guò)其它一些方法對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序的方面有所進(jìn)展。DNA測(cè)序技術(shù)的快速進(jìn)步(例如454’ s高通量焦磷酸測(cè)序(454 Life Science) (Margulies等，(2005)Nature437, 376-380 ；Wheeler 等，(2008) Nature452，872-826 ；Ronaghi 等，(1996) AnalBiochem242,84-89 ；Ronaghi 等(1998) Science281，363-365);通過(guò)在表面上由單一克隆進(jìn)行合成的 Illumina/Solexa 測(cè)序(Illumina) (Margulies 等，(2005) Nature437,376-380 ；Wheeler 等，(2008) Nature452,872-826) ；ABI 公司的 SOLiD 技術(shù)(“SupportedOligonucleotide Ligation and Detection，，, Applied Biosystems) (Cloonan 等，(2008)Nat Methods5,613-619);基因組學(xué)分析；和生物信息學(xué)技術(shù))已經(jīng)大大開(kāi)辟研究人員獲得復(fù)雜生物系統(tǒng)的深入的分子圖片的機(jī)會(huì)。各種類型的高通量DNA測(cè)序已被開(kāi)發(fā)，并已被用于解析(delineate)核酸序列。此類方法應(yīng)用于測(cè)序儀中，所述測(cè)序儀例如包括454GenomeSequencer FLX 儀器(Roche Applied Science)、Illumina (Solexa) GenomeAnalyzer>Applied Biosystems 的 ABI SOLiD 系統(tǒng)、Helicos 單分子測(cè)序裝置(HeliScope)、以及1n Torrent Systems Inc.的1n半導(dǎo)體測(cè)序。另見(jiàn)，例如，美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)N0.20110111401和N0.20110098193。可以理解的是，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)通過(guò)本文所述的方法提取的核酸所進(jìn)行的分析可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為適當(dāng)?shù)娜魏涡聹y(cè)序方法進(jìn)行。
[0141]鳥(niǎo)槍法克隆
[0142]在本文所述的方法和測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，使用鳥(niǎo)槍法對(duì)提取的核酸進(jìn)行測(cè)序。在鳥(niǎo)槍法測(cè)序中，DNA被隨機(jī)破壞為許多小區(qū)段，并使用鏈終止法對(duì)所述小區(qū)段進(jìn)行測(cè)序以獲得“讀段”。通過(guò)進(jìn)行數(shù)輪這一片段化和測(cè)序過(guò)程來(lái)獲得目標(biāo)DNA的多個(gè)重疊讀段。計(jì)算機(jī)程序隨后使用不同讀段的重疊末端以將其匯編為連續(xù)序列。
[0143]通常情況下，將長(zhǎng)度往往超過(guò)100，000個(gè)堿基(1001*)的大分子DNA進(jìn)行片段化和縮減(reduced),從而成為許多約l_4kb的亞克隆的文庫(kù)，以用于擴(kuò)增(propagation)和序列分析。多數(shù)大規(guī)模DNA測(cè)序策略依賴于多步過(guò)程，使目標(biāo)分子隨機(jī)片段化為這些更小的碎片，然后在反應(yīng)中將這些碎片酶連(連接)至克隆載體，所述反應(yīng)將一個(gè)或多個(gè)DNA片段插入各載體分子的單個(gè)位點(diǎn)(Fitzgerald等,Nucleic Acids Res.14:3753 (1992))。將這一連接混合物引入到大腸桿菌(E.coli)的特定菌株，其中，各細(xì)菌細(xì)胞對(duì)載體及載體上所攜帶的任何DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。將可能包含或不包含插入物的載體DNA從各細(xì)胞系中純化，并用作酶促測(cè)序反應(yīng)的模板(Sanger等，Proc Natl Acad Sci USA74:5463 (1977);Prober 等，Science238:336 (1987) ;Tabor 和 Richarson, Proc Natl Acad Sci USA92:6339 (1995)，將這些文獻(xiàn)全部以引用的方式并入本文)。通過(guò)自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析，以確定亞克隆的DNA片段的線性序列(Smith等，Nature321:674 (1986)，以引用的方式并入本文)。使用計(jì)算機(jī)算法來(lái)對(duì)來(lái)自于亞克隆片段文庫(kù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行匯編，通常產(chǎn)生原始DNA分子80-95%的序列信息。使用“間隙填補(bǔ)(Gap filling)”技術(shù)確定目標(biāo)DNA剩余的5-20%ο
[0144]下一代測(cè)序
[0145]在本文所述的方法和測(cè)定法中，本文所考慮的用于對(duì)提取的核酸進(jìn)行測(cè)序的另一種方法為“下一代測(cè)序”。這些技術(shù)產(chǎn)生較短的讀段(25-500bp)，但在相對(duì)較短的時(shí)間(如一天)內(nèi)產(chǎn)生幾十萬(wàn)或上百萬(wàn)的讀段。由于這些技術(shù)的數(shù)據(jù)量高且進(jìn)行全基因組測(cè)序所需時(shí)間相對(duì)較短，因而優(yōu)于鳥(niǎo)槍法測(cè)序。主要缺點(diǎn)是精確度通常較低(雖然這一點(diǎn)由高覆蓋度而得以補(bǔ)償)。
[0146]下一代測(cè)序法通常采用并行化進(jìn)行測(cè)序過(guò)程的高通量技術(shù)，一次產(chǎn)生數(shù)千或數(shù)百萬(wàn)的序列。高通量測(cè)序技術(shù)的目的在于最大可能地降低使用標(biāo)準(zhǔn)染料終止子法的DNA測(cè)序的成本。下一代測(cè)序法和機(jī)器的一些非限制性實(shí)例包括但不僅限于:大規(guī)模平行標(biāo)簽測(cè)序(MPSS)、454 焦憐酸測(cè)序、454GenomeSequencer FLX 儀(Roche Applied Science)、Illumina (Solexa)測(cè)序、SOLiD 測(cè)序、Applied Biosystems ABI SOLiD 系統(tǒng)、Helicos 單分子測(cè)序裝置(HeliScope)以及1n Torrent System Inc.的1n半導(dǎo)體測(cè)序。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將這些測(cè)序方法以及任何新測(cè)序方法應(yīng)用于本文所述的測(cè)定法和方法中。
[0147]宏基因組
[0148]如本領(lǐng)域已知的，術(shù)語(yǔ)“宏基因組”定義了給定生境(habitat)(例如，患者樣品)的全部有機(jī)體的基因組的總體(參見(jiàn)例如，Handelsman等，(1998) Chemistry and Biology5:245-249)。特別是，術(shù)語(yǔ)“宏基因組”涉及來(lái)自微生物的基因組核酸，優(yōu)選DNA，所述微生物包括可培養(yǎng)的微生物 和不可培養(yǎng)的微生物(即，不能通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法分離、且不能在標(biāo)準(zhǔn)人工培養(yǎng)基中活性復(fù)制無(wú)限的時(shí)間周期的有機(jī)體)。特別地，宏基因組的提取部分中的任何特定的微生物基因組的表現(xiàn)度(representation)不被該微生物的可培養(yǎng)性影響或不依賴于該微生物的可培養(yǎng)性。因此，不可培養(yǎng)的微生物和可培養(yǎng)的微生物的核酸實(shí)質(zhì)上在宏基因組的提取部分中均有所表現(xiàn)。
[0149]相應(yīng)地，在本文所述的方法和測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，宏基因組涉及由患者樣品中直接獲取(extrusion) DNA以及這些DNA在培養(yǎng)的宿主細(xì)胞(通常為細(xì)菌)中的表達(dá)和擴(kuò)增。宏基因組被首先開(kāi)發(fā)并用于識(shí)別新型細(xì)菌門(mén)(Pacel997)，其基于識(shí)別為其關(guān)注的系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記物的基因(如16s rDNA基因)的特異性克隆。
[0150]宏基因組更近期的發(fā)展關(guān)注在未進(jìn)行任何選擇和/或識(shí)別的情況下克隆的總體宏基因組，從而建立隨機(jī)“宏基因組DNA文庫(kù)”。這提供了，在不進(jìn)行任何特定選擇的情況下獲取整個(gè)細(xì)菌多樣性的遺傳潛力的路徑。通過(guò)已被克隆的環(huán)境DNA片段，宏基因組DNA文庫(kù)由數(shù)十萬(wàn)彼此不同的克隆組成。在這一方面，已對(duì)大DNA片段(超過(guò)30KB)進(jìn)行克隆，從而(i)對(duì)需要分析的克隆數(shù)量進(jìn)行限制；以及(ii)使得能夠恢復(fù)針對(duì)由多酶法合成的新型代謝產(chǎn)物的整個(gè)生物合成途徑。
[0151 ] 將序列與已知微生物的序列進(jìn)行比較
[0152]在本文所述的測(cè)定法和方法的一些實(shí)施方式中，將使用任何上述方法或在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法所提取的核酸的序列與已知的微生物序列進(jìn)行比較，所述已知的微生物序列例如為微生物基因序列的數(shù)據(jù)庫(kù)，如GenBank或GreenGenes (萬(wàn)維網(wǎng)網(wǎng)址為greengenes.lbl.gov)(作為16S序列及其注釋的文庫(kù))；并且，可使用搜索工具(如BLAST)在數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢核酸序列同源性，從而對(duì)樣品序列進(jìn)行識(shí)別。在一些此類實(shí)施方式中，數(shù)據(jù)庫(kù)包含來(lái)源于微生物群的宏基因組數(shù)據(jù)。
[0153]如果進(jìn)行比較的序列的同源性低于20%，則確定所提取并測(cè)序的核酸來(lái)自先前未特征化的微生物；而如果進(jìn)行比較的序列的同源性高于20%，則確定所述同源性高于20%的微生物來(lái)自于相同的微生物家族。
[0154]疾病和失調(diào)
[0155]在一些方面和實(shí)施方式中，本文所述的方法和測(cè)定法在對(duì)患有疾病或失調(diào)的受試者或患者中的免疫刺激性微生物的存在進(jìn)行識(shí)別和診斷方面是有用的。
[0156]炎癥性腸病
[0157]在一些實(shí)施方式中，本文所述的測(cè)定法和方法可用于診斷炎癥性腸病和/或識(shí)別在患有炎癥性腸病的受試者中引發(fā)免疫響應(yīng)的微生物。
[0158]炎癥性腸病(IBD)被定義為病因不明的慢性、復(fù)發(fā)性腸炎癥。仍未充分了解IBD的病因?qū)W。然而，基于對(duì)患者的研究和來(lái)自結(jié)腸炎的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的研究，在如下方面存在著越來(lái)越多的共識(shí):結(jié)腸炎為由對(duì)非致病性腸道細(xì)菌的異常響應(yīng)導(dǎo)致的腸感染。IBD的發(fā)病機(jī)制中涉及細(xì)菌的一些最引人注目的證據(jù)來(lái)自表明取自Crohn’ s病患者的回腸粘膜活檢樣品中存在E.coli的研究。盡管缺乏傳統(tǒng)的細(xì)菌致病性標(biāo)記物，這些有機(jī)體能侵入腸細(xì)胞系并宿于巨噬細(xì)胞內(nèi)而不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其它使用廣泛特異性16S核糖體探針進(jìn)行原位雜交來(lái)檢測(cè)所有種類的細(xì)菌的研究發(fā)現(xiàn)，UC和CD中的粘液層內(nèi)存在的未識(shí)別的細(xì)菌增加。另外，不希望受理論約束或 限制，IBD的遺傳基礎(chǔ)與所描述的關(guān)于響應(yīng)感染性試劑(如麻風(fēng)(leprosy))的遺傳基礎(chǔ)相重疊，提高了如下可能性:IBD作為對(duì)外源感染性試劑的響應(yīng)而產(chǎn)生(N Engl J Med2010)。
[0159]炎癥性腸病包括例如Crohn’ s病、潰瘍性結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎、淋巴細(xì)胞性結(jié)腸炎、缺血性結(jié)腸炎、改道性結(jié)腸炎、Behcet’ s綜合征或未定型結(jié)腸炎。然而，最常見(jiàn)的炎癥性腸病為Crohn’s病和潰瘍性結(jié)腸炎。這些疾病可能由腸中不受限制的炎癥響應(yīng)活化而導(dǎo)致。這一炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)某種程度上通過(guò)促炎性細(xì)胞因子的活化和淋巴細(xì)胞亞群的選擇性活化而延續(xù)。對(duì)于IBD患者，腸內(nèi)壁的潰瘍和炎癥導(dǎo)致腹痛、腹瀉和直腸出血等癥狀。潰瘍性結(jié)腸炎在大腸中發(fā)生，而在Crohn’ s病中可涉及整個(gè)胃腸道(GI tract)以及小腸和大腸。對(duì)于大多數(shù)患者而言，IBD為癥狀持續(xù)數(shù)月至數(shù)年的慢性病癥。這一疾病最常見(jiàn)于青年成人，但可在任何年齡發(fā)生。這一疾病在全世界均有發(fā)現(xiàn)，但最常見(jiàn)于工業(yè)化國(guó)家，如美國(guó)、英國(guó)和北歐。該病在猶太血統(tǒng)的人中尤其常見(jiàn)，并且其發(fā)病率也具有種族差異。IBD的臨床癥狀為間歇性的直腸出血、疫攣性腹痛、體重減輕和腹瀉。IBD的診斷根據(jù)臨床癥狀、鋇灌腸劑的使用進(jìn)行，但直接目測(cè)觀察(乙狀結(jié)腸鏡或結(jié)腸鏡檢查)是最準(zhǔn)確的測(cè)試。拖延性IBD是結(jié)腸癌的危險(xiǎn)因素，IBD治療可包括藥物和手術(shù)。
[0160]一些UC患者僅患有直腸疾病(直腸炎)，而其他患者可以患有限于直腸和相鄰的左側(cè)結(jié)腸的疾病(直腸乙狀結(jié)腸炎(proctosigmoiditis))。在一些個(gè)體中，UC發(fā)生于整個(gè)結(jié)腸(全結(jié)腸炎)。UC的癥狀通常更嚴(yán)重且疾病更廣泛(疾病涉及結(jié)腸更大的部分)。類似地，患有限于直腸的直腸炎或僅限于左端結(jié)腸(直腸乙狀結(jié)腸炎)的UC的患者的預(yù)后優(yōu)于疾病涉及整個(gè)結(jié)腸的受試者的預(yù)后。
[0161]在一些情況下，使用口服藥物或灌腸劑進(jìn)行的短暫周期性治療可能足以在潰瘍性結(jié)腸炎患者中引起緩解，即，如疼痛、出血和體重減輕的癥狀消失。對(duì)于患有更廣泛的疾病的患者而言，發(fā)炎的腸道的失血可導(dǎo)致貧血，并可能需要通過(guò)補(bǔ)充鐵、甚至輸血進(jìn)行治療。在少數(shù)情況下，當(dāng)炎癥變得非常嚴(yán)重時(shí)，結(jié)腸可急性擴(kuò)張到大尺寸。這種病癥被稱為中毒性巨結(jié)腸(toxic megacolon)。中毒性巨結(jié)腸患者極度病重，伴有發(fā)燒、腹痛、腹脹、脫水和營(yíng)養(yǎng)不良。除非病人利用藥物迅速改善，否則通常需要進(jìn)行手術(shù)以防止結(jié)腸破裂。
[0162]Crohn’ s病可發(fā)生于胃腸道的所有區(qū)域。由于炎癥和纖維化，很多該病的患者中發(fā)生腸梗阻。肉芽腫(Granulomas)和瘺管(fistula)形成是Crohn’ s病的常見(jiàn)并發(fā)癥。Crohn’ s病的患者在嚴(yán)重情況下可能需要靜脈輸送營(yíng)養(yǎng)、手術(shù)和結(jié)腸造口(colostomy)來(lái)對(duì)疾病進(jìn)行適當(dāng)治療。
[0163]炎癥性腸病患者患結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)也有所提高。在IBD8-10年后，癌癥的風(fēng)險(xiǎn)開(kāi)始
顯著上升。
[0164]一旦作出陽(yáng)性診斷，可使用消炎藥物(如水楊酸鹽/酯)對(duì)IBD進(jìn)行藥理學(xué)治療。水楊酸鹽/酯制劑在治療輕度至中度疾病中有效，并且在長(zhǎng)期攝入藥物時(shí)可減少疾病發(fā)作(flare)頻率。水楊酸鹽/酯的例子包括柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、奧沙拉嗪(olsalazine)和美沙拉嗪(mesalamine)。這些藥物通常以高劑量口服給予，以實(shí)現(xiàn)最大治療效果。在不響應(yīng)水楊酸鹽/酯或皮質(zhì)激素(corticosteroids)的IBD患者中，使用抑制免疫系統(tǒng)的藥物。免疫抑制劑的例子包括硫唑嘌呤(azathioprine)和6_巰基嘌呤(6-mercaptopurine)。
[0165]自身免疫失調(diào)
[0166]在本文的多個(gè)方面和實(shí)施方式中描述的方法和測(cè)定法對(duì)于識(shí)別與誘發(fā)或?qū)е伦陨砻庖呤д{(diào)或自身免疫疾病的新型微生物也可特別有利。廣義上所稱的“自身免疫疾病”是指這樣一類疾病:在該疾病中，受試者的自身抗體與宿主組織反應(yīng)，或免疫效應(yīng)因子T細(xì)胞與內(nèi)源性自身肽發(fā)生自體反應(yīng)并 引起組織破壞。由此產(chǎn)生了針對(duì)受試者自身抗原(稱為自體抗原(se 1 f-antigen ))的免疫響應(yīng)。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“自體抗原”是指正常宿主組織的抗原。正常宿主組織不包括癌細(xì)胞。不希望受理論限制或束縛，認(rèn)為某些自身免疫疾病在疾病的起始或進(jìn)展或病因?qū)W中，可能涉及額外的、目前尚未識(shí)別的微生物病因?qū)W試劑、觸發(fā)子或組分(如細(xì)菌、真菌或病毒)。相應(yīng)地，本文所述的方法可用于患有自身免疫疾病或具有自身免疫疾病易感性的受試者中，其中，免疫蛋白富集部分由受試者的樣品獲得，核酸由該部分中提取，并對(duì)提取的核酸進(jìn)行測(cè)序以識(shí)別受試者中的任何免疫刺激性微生物。
[0167]相應(yīng)地，本文所述的方法和測(cè)定法的一些實(shí)施方式中，受試者患有自身免疫疾病或具有自身免疫疾病易感性，所述自身免疫疾病包括但不僅限于:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫性腦脊髓炎、重癥肌無(wú)力(MG)、Hashimoto’ s甲狀腺炎、Goodpasture’ s綜合征、天皰瘡(例如，尋常天皰瘡)、Grave’ s病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少性紫癜、具有抗膠原蛋白的抗體的硬皮病、混合性結(jié)締組織病、多發(fā)性肌炎、惡性貧血、特發(fā)性Addison’ s病、自身免疫相關(guān)性不孕不育、腎小球腎炎(例如，新月體性腎小球腎炎、增生性腎小球腎炎)、大皰性類天皰瘡、Sjogren’s綜合征、胰島素抵抗、以及自身免疫性糖尿病(1型糖尿病、胰島素依賴型糖尿病)。自身免疫性疾病已被認(rèn)為還涵蓋動(dòng)脈粥樣硬化和阿爾茨海默病。在本文所述的方面的一個(gè)實(shí)施方式中，自身免疫疾病選自于由如下疾病所組成的組:多發(fā)性硬化、I型糖尿病、Hashimoto’s甲狀腺炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、胃炎(gastritis)、自身免疫性肝炎、溶血性貧血、自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴淋巴組織增生綜合征(ALPS)、自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎、腎小球腎炎、Guillain-Barre綜合征、牛皮癖和重癥肌無(wú)力。
[0168]系統(tǒng)
[0169]在其它方面和實(shí)施方式中，本文還提供系統(tǒng)(和用于使計(jì)算機(jī)系統(tǒng)運(yùn)行的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì))，用以執(zhí)行用于在患者樣品中檢測(cè)和/或識(shí)別免疫系統(tǒng)刺激性微生物的方法。 [0170]本文所提供的系統(tǒng)的實(shí)施方式可以通過(guò)功能模塊來(lái)進(jìn)行描述，所述功能模塊由記錄在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上的計(jì)算機(jī)可執(zhí)行指令所定義，并且所述功能模塊在執(zhí)行時(shí)使計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法步驟。為了清楚起見(jiàn)，將本文所述的模塊按功能進(jìn)行區(qū)分。然而，應(yīng)該理解的是，模塊/系統(tǒng)不必對(duì)應(yīng)于分散的(discreet)代碼塊，所描述的功能可以通過(guò)存儲(chǔ)在多種介質(zhì)上的不同代碼部分執(zhí)行以及可以在不同時(shí)間執(zhí)行。此外，應(yīng)該理解的是，這些模塊可以執(zhí)行其它功能，因此所述模塊并不僅限于具有任何特定功能或功能組合。
[0171]所述計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)#30可以是能由計(jì)算機(jī)訪問(wèn)的任何可用的有形介質(zhì)。計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)包括在用于存儲(chǔ)信息(如計(jì)算機(jī)可讀指令、數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)、程序模塊或其它數(shù)據(jù))的任何方法或技術(shù)中使用的易失性的(vo 1 at i 1 e )和非易失性的、可移動(dòng)的和不可移動(dòng)的有形介質(zhì)。計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)包括但不僅限于:RAM (隨機(jī)存取存儲(chǔ)器)、ROM (只讀存儲(chǔ)器)、EPR0M (可擦除可編程只讀存儲(chǔ)器)、EEPR0M (電可擦除可編程只讀存儲(chǔ)器)、USB存儲(chǔ)器、閃存存儲(chǔ)器或其它存儲(chǔ)器技術(shù)、⑶-ROM (光盤(pán)只讀存儲(chǔ)器)、DVD (數(shù)字通用盤(pán))或其它光學(xué)存儲(chǔ)介質(zhì)、磁帶盒、磁帶、磁盤(pán)存儲(chǔ)器或其它磁性存儲(chǔ)介質(zhì)、云服務(wù)器存儲(chǔ)系統(tǒng)、其它類型的易失性和非易失性存儲(chǔ)器、以及任何其它可用于存儲(chǔ)所期望的信息并可通過(guò)計(jì)算機(jī)訪問(wèn)的有形介質(zhì)，以及前述介質(zhì)的任何合適的組合。
[0172]一個(gè)或多個(gè)計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)上體現(xiàn)的計(jì)算機(jī)可讀數(shù)據(jù)可以定義指令，例如，作為一個(gè)或多個(gè)程序的一部分，即，作為由計(jì)算機(jī)執(zhí)行的結(jié)果，指示計(jì)算機(jī)執(zhí)行一個(gè)或多個(gè)本文所述的功能，和/或不同的實(shí)施方式、變型和它們的組合。此類指令可以使用多種編程語(yǔ)言中的任何一種編寫(xiě)，例如，Java、J#、Visual Basic、C、C#、C++、Fortran、Pascal、Eiffel、C0B0L匯編語(yǔ)言等，或使用多種所述編程語(yǔ)言的組合中的任何一種編寫(xiě)。體現(xiàn)了這樣的指示的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)可以駐存于系統(tǒng)或本文所述的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)組件之中，或可跨越分布于一個(gè)或多個(gè)此類組件中。
[0173]所述計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)可以是可傳輸?shù)?，這樣使得存儲(chǔ)于其上的指令可以被加載至任何計(jì)算機(jī)資源，以執(zhí)行本文所討論的本發(fā)明的方面。此外，應(yīng)當(dāng)理解的是，如上所述，計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中存儲(chǔ)的指令并不僅限于體現(xiàn)為在主機(jī)上運(yùn)行的一個(gè)應(yīng)用程序的一部分的指令。相反，所述指令可以體現(xiàn)為可用于對(duì)計(jì)算機(jī)進(jìn)行編程以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的各個(gè)方面的任何類型的計(jì)算機(jī)代碼(例如，軟件或微代碼)。計(jì)算機(jī)可執(zhí)行指令可以用合適的計(jì)算機(jī)語(yǔ)言或幾種語(yǔ)言的組合進(jìn)行編寫(xiě)?；居?jì)算生物學(xué)方法對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的，并在例如 Setubal 和 Meidanis 等，Introduction to Computational BiologyMethods (PWS Publishing Company, Boston, 1997 年)；Salzberg, Searles, Kasif,(主編)，Computational Methods in Molecular Biology,(Elsevier,Amsterdam,1998年);Rashidi和Buehler,Bioinformatics Basics -Application in Biological Science and Medicine(CRC Press, London, 2000 年)；以及 Ouelette 和 Bzevanis, Bioinformatics:A PracticalGuide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley&Sons, Inc.,第 2 版，2001 年)中有所描述。
[0174] 在本文所述的系統(tǒng)的一些實(shí)施方式中，功能模塊至少包括:測(cè)定系統(tǒng)#40、存儲(chǔ)裝置#30、比較模塊#80、以及顯示模塊#110。功能模塊可以在一個(gè)或多個(gè)計(jì)算機(jī)上執(zhí)行，或通過(guò)使用一個(gè)或多個(gè)計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)執(zhí)行。測(cè)定系統(tǒng)具有計(jì)算機(jī)可執(zhí)行指令，從而以計(jì)算機(jī)可讀的形式提供例如序列信息。
[0175]測(cè)定系統(tǒng)#40可以包含用于對(duì)免疫系統(tǒng)刺激性微生物進(jìn)行測(cè)序的任何系統(tǒng)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，此類系統(tǒng)可包括但不僅限于:下一代測(cè)序平臺(tái)、高通量測(cè)序平臺(tái)、PCR或定量PCR機(jī)器或裝置等。
[0176]在測(cè)定系統(tǒng)中測(cè)定的信息可通過(guò)存儲(chǔ)裝置#30讀取。本文所使用的“存儲(chǔ)裝置”旨在包括任何合適的計(jì)算或處理設(shè)備或其它被配置或調(diào)整用于存儲(chǔ)數(shù)據(jù)或信息的裝置。適合用于本發(fā)明的電子設(shè)備的實(shí)例可以包括獨(dú)立的計(jì)算設(shè)備、數(shù)據(jù)通信網(wǎng)絡(luò)(包括局域網(wǎng)(LAN)、廣域網(wǎng)(WAN)、互聯(lián)網(wǎng)、內(nèi)聯(lián)網(wǎng)以及外聯(lián)網(wǎng))、本地和遠(yuǎn)程服務(wù)器、以及本地和分布式計(jì)算機(jī)處理系統(tǒng)。存儲(chǔ)裝置還包括但不僅限于:磁性存儲(chǔ)介質(zhì)(如軟盤(pán)，硬盤(pán)存儲(chǔ)介質(zhì))、遠(yuǎn)程或本地服務(wù)器、磁帶、光存儲(chǔ)介質(zhì)(例如CD-ROM、DVD)、電子存儲(chǔ)介質(zhì)(如RAM、ROM、EPROM、EEPR0M)等、普通硬盤(pán)以及這些類別的混合(如磁性/光存儲(chǔ)介質(zhì))。存儲(chǔ)裝置被調(diào)整或配置為在其上記錄核酸序列信息。此類信息可通過(guò)數(shù)字化形式提供，該形式例如可通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)、在磁盤(pán)(diskette)上、通過(guò)USB (通用串行總線)、或通過(guò)任何其它合適的通信模式來(lái)傳輸和電子閱讀。
[0177]本文所使用的“存儲(chǔ)”是指對(duì)存儲(chǔ)裝置上的信息進(jìn)行編碼的過(guò)程。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地采用任何目前已知的方法來(lái)將信息記錄于已知的介質(zhì)上，以生成包含有關(guān)免疫刺激性微生物的信息的產(chǎn)品。
[0178]在一些實(shí)施方式中，存儲(chǔ)在存儲(chǔ)裝置中、待通過(guò)比較模塊讀取的參比數(shù)據(jù)例如為由從患者樣品獲得的免疫蛋白富集部分獲得的序列數(shù)據(jù)。
[0179]“比較模塊”#80可使用多種可獲得的軟件程序和格式進(jìn)行如下比較:將測(cè)定系統(tǒng)中測(cè)定的序列信息數(shù)據(jù)與一種或多種參比樣品和/或存儲(chǔ)的參比數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。在本文所述的系統(tǒng)的一些實(shí)施方式中，比較模塊被配置為使用模式識(shí)別技術(shù)(pattern recognitiontechnique),從而將來(lái)自一個(gè)或多個(gè)條目(entries)的信息與一個(gè)或多個(gè)參考數(shù)據(jù)模式進(jìn)行比較。比較模塊可以被配置為使用現(xiàn)有的可商購(gòu)的或可自由使用的軟件來(lái)進(jìn)行模式比較，并可為所實(shí)施的特定的數(shù)據(jù)比較進(jìn)行優(yōu)化。比較模塊提供了涉及免疫系統(tǒng)刺激性微生物的核酸序列的計(jì)算機(jī)可讀信息。
[0180]比較模塊或本發(fā)明任何其它的模塊可以包括操作系統(tǒng)(例如，UNIX)，在該操作系統(tǒng)上運(yùn)行相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)、萬(wàn)維網(wǎng)應(yīng)用程序、以及萬(wàn)維網(wǎng)服務(wù)器。萬(wàn)維網(wǎng)應(yīng)用程序包括生成數(shù)據(jù)庫(kù)語(yǔ)言語(yǔ)句所需的可執(zhí)行代碼(如結(jié)構(gòu)化查詢語(yǔ)言(SQL)語(yǔ)句)。一般來(lái)說(shuō)，可執(zhí)行文件將包括嵌入式SQL語(yǔ)句。此外，萬(wàn)維網(wǎng)應(yīng)用程序可包括配置文件，該配置文件包含對(duì)于各種軟件實(shí)體的指針和地址，所述軟件實(shí)體包括服務(wù)器以及各種外部和內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)(必須通過(guò)服務(wù)用戶請(qǐng)求訪問(wèn))。配置文件還將對(duì)服務(wù)器資源的請(qǐng)求定向至相應(yīng)的硬件-這在服務(wù)器分布在兩個(gè)以上分離的計(jì)算機(jī)上時(shí)可能是必要的。在一個(gè)實(shí)施方式中，萬(wàn)維網(wǎng)服務(wù)器支持TCP/IP協(xié)議。諸如此類的本地網(wǎng)絡(luò)有時(shí)也被稱為“內(nèi)聯(lián)網(wǎng)(Intranets)”。此類內(nèi)聯(lián)網(wǎng)的優(yōu)勢(shì)在于，其允許方便地與駐存在萬(wàn)維網(wǎng)上的公共領(lǐng)域數(shù)據(jù)庫(kù)(例如，GenBank或瑞士Pro萬(wàn)維網(wǎng)站點(diǎn))進(jìn)行溝通。因此，在一些實(shí)施方式中，使用由Web瀏覽器和Web服務(wù)器提供的HTML界面，用戶可以直接訪問(wèn)駐存在互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)上的數(shù)據(jù)(例如通過(guò)超文本鏈接)。
[0181]比較模塊提供了計(jì)算機(jī)可讀的比較結(jié)果，該結(jié)果可通過(guò)預(yù)定義的標(biāo)準(zhǔn)或由用戶定義的標(biāo)準(zhǔn)以使用計(jì)算機(jī)可讀的形式進(jìn)行處理，從而提供部分基于比較結(jié)果的內(nèi)容，該內(nèi)容可以根據(jù)用戶的需求使用顯示模塊#110進(jìn)行存儲(chǔ)和輸出。
[0182]基于比較結(jié)果的內(nèi)容可以是免疫系統(tǒng)刺激性微生物的類別。或者，基于比較結(jié)果的內(nèi)容可以是免疫系統(tǒng)刺激性微生物類別的缺乏，表明該微生物是先前未特征化的微生物。
[0183]在本文所述的系統(tǒng)的一些實(shí)施方式中，基于比較結(jié)果的內(nèi)容顯示在計(jì)算機(jī)顯示器#120上。在本文所述的系統(tǒng)的一些實(shí)施方式中，基于比較結(jié)果的內(nèi)容通過(guò)可打印介質(zhì)#130,#140顯示。顯示模塊可以是任何適當(dāng)?shù)难b置，所述裝置被配置為從計(jì)算機(jī)處接收、并將計(jì)算機(jī)可讀信息顯示給用戶。非限制性的實(shí)例包括，例如，基于下列的通用計(jì)算機(jī):IntelPENTIUM 型處理器、Motorola PowerPC、Sun UltraSPARC、Hewlett-Packard PA-RISC 處理器，以及可由 Advanced Micro Devices (AMD), Sunnyvale, California 購(gòu)得的多種處理器、平板或移動(dòng)電話設(shè)備、或任何其它類型的處理器、視覺(jué)顯示裝置如平板顯示器、陰極射線管等，以及各種類型的計(jì)算機(jī)打印機(jī)。
[0184]在本文所述的系統(tǒng)的一些實(shí)施方式中，萬(wàn)維網(wǎng)瀏覽器被用來(lái)提供用于顯示基于比較結(jié)果的內(nèi)容的用戶界面。應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的其它模塊可以調(diào)整為具有Web瀏覽器界面。通過(guò)Web瀏覽器，用戶可以創(chuàng)建從比較模塊中檢索數(shù)據(jù)的請(qǐng)求。因此，用戶通常會(huì)指向并點(diǎn)擊用戶界面元素(如常規(guī)使用于圖形用戶界面中的按鈕、下拉菜單、滾動(dòng)條等)。
[0185]因此，本文所述的方法提供系統(tǒng)(和用于引起計(jì)算機(jī)系統(tǒng)運(yùn)行的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì))以執(zhí)行用于在患者樣品中檢測(cè)和/或識(shí)別免疫系統(tǒng)刺激性微生物的方法，并任選地執(zhí)行對(duì)患有感染性疾病的患者進(jìn)行診斷。
[0186]對(duì)于在個(gè)體中所進(jìn)行的診斷方法，本文所述的系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)僅為本發(fā)明的示例性實(shí)施方式，并不旨在限制本發(fā)明的范圍。本文所述的系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)的變型是可能的，并旨在落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0187]機(jī)器的模塊或在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中所使用的模塊可以承擔(dān)多種配置。例如，可以在一臺(tái)機(jī)器上提供功能、或者所述功能可分布于多臺(tái)機(jī)器。
[0188]本文公開(kāi)的一些方面和實(shí)施方式可通過(guò)例如以下編號(hào)段落中的任一項(xiàng)加以說(shuō)明:
[0189]1.一種用于在患有疾病或失調(diào)的患者中對(duì)免疫刺激性微生物的存在進(jìn)行識(shí)別或檢測(cè)的方法，所述方法包括下列步驟:
[0190](a)由從患者樣品獲得的免疫蛋白富集部分中提取核酸；
[0191](b)對(duì)提取的核酸進(jìn)行測(cè)序；以及
[0192](c)將所述提取的核酸的序列與已知的微生物核酸序列進(jìn)行比較，以識(shí)別由所述免疫蛋白富集部分提取的核酸是否為微生物核酸，其中，若所述提取的核酸為微生物核酸，則所述患者被檢測(cè)為具有免疫刺激性微生物。
[0193]2.一種用于在患有疾病或失調(diào)的患者中對(duì)免疫刺激性微生物的存在進(jìn)行識(shí)別或檢測(cè)的方法，所述方法包括下列步驟:[0194](a)由患者樣品制備免疫蛋白g集部分；
[0195](b)由所述免疫蛋白富集部分提取核酸；
[0196](c)對(duì)提取的核酸進(jìn)行測(cè)序；以及
[0197](d)將所述提取的核酸的序列與已知的微生物核酸序列進(jìn)行比較，以識(shí)別由所述免疫蛋白富集部分提取的核酸是否為微生物核酸，其中，若所述提取的核酸為微生物核酸，則所述患者被檢測(cè)為具有免疫刺激性微生物。
[0198]3.如段1或2所述的方法，其中，所述患有疾病或失調(diào)的患者患有炎癥性腸病。
[0199]4.如段3所述的方法，其中，所述炎癥性腸病為Crohn' s病、潰瘍性結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎、淋巴細(xì)胞性結(jié)腸炎、缺血性結(jié)腸炎、改道性結(jié)腸炎、Behcet/ s綜合征或未定型結(jié)腸炎。
[0200]5.如段1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述患有疾病或失調(diào)的患者患有自身免疫失調(diào)。
[0201]6.如段1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述患有疾病或失調(diào)的患者患有硬化、敗
血癥或病毒血癥。
[0202]7.如段1-6中任一項(xiàng)所 述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用對(duì)免疫球蛋白、補(bǔ)體蛋白或病原體識(shí)別受體具有特異性的親和結(jié)合劑制備。
[0203]8.如段1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用對(duì)IgA、IgD、IgE、IgG、IgM具有特異性的親和結(jié)合劑或所述親和結(jié)合劑的任意組合制備。
[0204]9.如段1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用對(duì)IgG具有特異性的親和結(jié)合劑制備。
[0205]10.如段1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用親和結(jié)合劑利用免疫沉淀制備。
[0206]11.如段7-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述親和結(jié)合劑為蛋白A、蛋白G、蛋白Α/G、蛋白L、免疫蛋白特異性抗體或其片段，或所述親和結(jié)合劑的任意組合。
[0207]12.如段7-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述親和結(jié)合劑或免疫蛋白特異性抗體包括抗人IgG抗體、抗人IgA抗體、抗人IgD抗體、抗人IgE抗體、抗人IgM抗體,或所述親和結(jié)合劑或抗體的任意組合。
[0208]13.如段7-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述親和結(jié)合劑對(duì)免疫球蛋白免疫蛋白具有特異性，并結(jié)合至所述免疫球蛋白免疫蛋白的Fc片段上的抗原表位。
[0209]14.如段7-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述親和結(jié)合劑未結(jié)合至固相載體。
[0210]15.如段7-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述親和結(jié)合劑結(jié)合至固相載體。
[0211]16.如段15所述的方法，其中，所述固相載體包括超順磁微珠、微尺度瓊脂糖珠、或瓊脂糖樹(shù)脂珠。
[0212]17.如段1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中，被檢測(cè)的所述免疫系統(tǒng)刺激性微生物為細(xì)菌、真菌或病毒。
[0213]18.如段1-17中任一項(xiàng)所述的方法，其中，被檢測(cè)的所述免疫系統(tǒng)刺激性微生物屬于分類單元中的古細(xì)菌域、細(xì)菌域或真核生物域。
[0214]19.如段1-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述患者樣品為血液樣品、血漿樣品、尿樣品、腦脊液樣品、粘膜樣品、糞便樣品、腸灌洗樣品、腸液樣品、關(guān)節(jié)液樣品、呼吸道痰樣品或支氣管肺泡灌洗液樣品。
[0215]20.如段19所述的方法，其中，所述腸灌洗樣品為回腸灌洗樣品。
[0216]21.如段1-20中任一項(xiàng)所述的方法，其中，被檢測(cè)的所述免疫系統(tǒng)刺激性微生物為先前未特征化的微生物。
[0217]22.如段1-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述測(cè)序步驟使用鳥(niǎo)槍法克隆、16SrRNA/DNA擴(kuò)增和/或宏基因組測(cè)序進(jìn)行。
[0218]23.如段1-22中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(b)或步驟(c)中的所述測(cè)序使用微生物基因特異性引物進(jìn)行。
[0219]24.如段1-22中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(b)或步驟(c)中的所述測(cè)序使用非基因特異性引物進(jìn)行。
[0220]25.如段1-24中任一項(xiàng)所述的方法，其中，用于從中制備所述免疫蛋白富集部分的所述患者樣品在所述提取核酸的步驟之前并未進(jìn)行培養(yǎng)步驟。
[0221]26.一種用于在患者樣品中對(duì)免疫系統(tǒng)刺激性微生物進(jìn)行直接檢測(cè)的測(cè)定法，所述測(cè)定法包括下列步驟:
[0222](a)由從患者樣品制備的免疫蛋白富集部分中提取核酸；以及
[0223](b)對(duì)存在于所述免疫蛋白富集部分中的提取的核酸進(jìn)行測(cè)序，從而獲得存在于所述患者樣品中的任何免疫系統(tǒng)刺激性微生物的序列。
[0224]27.一種用于在患者樣品中對(duì)免疫系統(tǒng)刺激性微生物進(jìn)行直接檢測(cè)的測(cè)定法，所述測(cè)定法包括下列步驟:
[0225](a)從患者樣品制備免疫蛋白g集部分；
[0226](b)由所述免疫蛋白富集部分中提取核酸；以及
[0227](c)對(duì)存在于所述免疫蛋白富集部分中的提取的核酸進(jìn)行測(cè)序，從而獲得存在于所述患者樣品中的任何免疫系統(tǒng)刺激性微生物的序列。
[0228]28.如段26或27所述的測(cè)定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用對(duì)免疫球蛋白、補(bǔ)體蛋白或病原體識(shí)別受體具有特異性的親和結(jié)合劑制備。
[0229]29.如段26-28中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用對(duì)IgA、IgD、IgE、IgG、IgM具有特異性的親和結(jié)合劑或所述親和結(jié)合劑的任意組合制備。
[0230]30.如段26-29中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用對(duì)IgG具有特異性的親和結(jié)合劑制備。
[0231]31.如段26-30中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用親和結(jié)合劑利用免疫沉淀制備。
[0232]32.如段31所述的測(cè)定法，其中，所述親和結(jié)合劑為蛋白A、蛋白G、蛋白Α/G、蛋白L、免疫蛋白特異性抗體或其片段，或所述親和結(jié)合劑的任意組合。
[0233]33.如段31或32所述的測(cè)定法，其中，所述親和結(jié)合劑或免疫蛋白特異性抗體包括抗人IgG抗體。
[0234]34.如段28-33中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，所述親和結(jié)合劑對(duì)免疫球蛋白免疫蛋白具有特異性，并結(jié)合至所述免疫球蛋白免疫蛋白的Fc片段上的抗原表位。
[0235]35.如段28-34中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，所述親和結(jié)合劑未結(jié)合至固相載體。[0236]36.如段28-34中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，所述親和結(jié)合劑結(jié)合至固相載體。
[0237]37.如段36所述的測(cè)定法，其中，所述固相載體包括超順磁微珠、微尺度瓊脂糖珠、或瓊脂糖樹(shù)脂珠。
[0238]38.如段26-38中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，被檢測(cè)的所述免疫系統(tǒng)刺激性微生物為細(xì)菌、真菌或病毒。
[0239]39.如段26-39中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，被檢測(cè)的所述免疫系統(tǒng)刺激性微生物屬于分類單元中的古細(xì)菌域、細(xì)菌域或真核生物域。
[0240]40.如段26-40中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，所述患者樣品為血液樣品、血漿樣品、尿樣品、腦脊液樣品、粘膜樣品、糞便樣品、腸灌洗樣品、腸液樣品、關(guān)節(jié)液樣品、呼吸道痰樣品或支氣管肺泡灌洗液樣品。
[0241]41.如段40所述的測(cè)定法，其中，所述腸灌洗樣品為回腸灌洗樣品。
[0242]42.如段26-41中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，被檢測(cè)的所述免疫系統(tǒng)刺激性微生物為先前未特征化的微生物。
[0243]43.如段26-42中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，所述測(cè)序步驟使用鳥(niǎo)槍法克隆、16SrRNA/DNA擴(kuò)增和/或宏基因組測(cè)序進(jìn)行。
[0244]44.如段26-43中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，步驟(b)或步驟(c)中的所述測(cè)序使用微生物基因特異性 引物進(jìn)行。
[0245]45.如段26-43中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，步驟(b)或步驟(c)中的所述測(cè)序使用非基因特異性引物進(jìn)行。
[0246]46.如段26-45中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，用于從中制備所述免疫蛋白富集部分的所述患者樣品在所述提取核酸的步驟之前并未進(jìn)行培養(yǎng)步驟。
[0247]47.如段26-47中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，所述微生物不能使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)。
[0248]48.一種用于由至少一個(gè)測(cè)試樣品獲取數(shù)據(jù)的系統(tǒng)，所述測(cè)試樣品包含由免疫蛋白富集樣品中提取的核酸，所述免疫蛋白富集樣品由至少一名患者處獲得，所述系統(tǒng)包含:
[0249]a.測(cè)定模塊，所述測(cè)定模塊被配置用于接收包含所述提取的核酸的所述至少一個(gè)測(cè)試樣品，并對(duì)所述至少一個(gè)測(cè)試樣品進(jìn)行至少一次測(cè)序分析，以產(chǎn)生測(cè)序數(shù)據(jù)輸出；
[0250]b.存儲(chǔ)裝置，所述存儲(chǔ)裝置被配置用于存儲(chǔ)來(lái)自所述測(cè)定模塊的所述測(cè)序數(shù)據(jù)輸出；
[0251]c.比較模塊，所述比較模塊被配置用于接收包含提取的核酸的所述測(cè)試樣品的所述測(cè)序數(shù)據(jù)輸出，并對(duì)所述測(cè)序數(shù)據(jù)輸出進(jìn)行至少一次測(cè)序分析，以確定下列條件之一存在與否，并產(chǎn)生比較數(shù)據(jù)輸出:
[0252]1.所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性為20%以上；或者
[0253]i1.所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性低于20%;
[0254]以及
[0255]d.顯示模塊，所述顯示模塊用于對(duì)部分基于來(lái)自所述比較模塊的所述比較數(shù)據(jù)輸出的內(nèi)容進(jìn)行顯示，其中，所述內(nèi)容包括表明所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性為20%以上的信號(hào)；或者表明所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性低于20%的信號(hào)。
[0256]49.如段46所述的系統(tǒng)，其中，所述顯示模塊上顯示的內(nèi)容進(jìn)一步包括表明建議接受特定治療方案的患者的信號(hào)。
[0257]實(shí)施例
[0258]本文提供了對(duì)先天或適應(yīng)性免疫系統(tǒng)響應(yīng)的微生物進(jìn)行直接識(shí)別的測(cè)定法和方法。哺乳動(dòng)物宿主(人類和非人類)中生長(zhǎng)著多種多樣的共生微生物或致病微生物。免疫系統(tǒng)的響應(yīng)是共生微生物或病原微生物的指紋。目前的微生物學(xué)方法并不必然將對(duì)生物體的免疫響應(yīng)作為直接識(shí)別生物體的手段而納入考量。免疫響應(yīng)被定義為基于免疫響應(yīng)的存在直接顯示微生物的證據(jù)。作為結(jié)果，微生物的存在通常通過(guò)培養(yǎng)或類似類型的生物測(cè)定法來(lái)確定。本文所述的測(cè)定法和方法將免疫響應(yīng)與微生物的直接檢測(cè)相結(jié)合，用于診斷和識(shí)別特定的感染性疾病、特別是其中的有機(jī)體無(wú)法被培養(yǎng)的疾病的目的。此外，這一方法能夠直接應(yīng)用于范圍廣泛的體液直接測(cè)定法。
[0259]在一些實(shí)施方式中，本文所述的測(cè)定法和方法包括通過(guò)多種不同手段(例如蛋白A或蛋白G瓊脂糖、IgG的Fc片段的特異性抗體)直接由體液(例如腸液、血液、關(guān)節(jié)液、腦脊液)對(duì)IgG分子進(jìn)行直接免疫沉淀。一旦沉淀，直接由免疫沉淀物提取核酸?？衫迷O(shè)計(jì)用于檢測(cè)特定微生物的引物對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序、或可進(jìn)行16S rRNA/DNA擴(kuò)增或鳥(niǎo)槍法克隆以及宏基因組測(cè)序，從而在跨越原核界和真核界的頻譜中搜索微生物。因此，本文所述的測(cè)定法和方法將免疫響應(yīng)的選擇性與DNA測(cè)序的靈敏度和特異性相結(jié)合。通過(guò)首先將核糖核酸轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)的DNA或使免疫沉淀針對(duì)免疫響應(yīng)的其它組分(如IgM、IgE、IgA和IgD或甚至先天性免疫響應(yīng)的組分(如補(bǔ)體))，這一方法可適于對(duì)這些核糖核酸進(jìn)行的測(cè)序。本文所述的測(cè)定法和方法也具有廣泛的獸醫(yī)應(yīng)用、以及在對(duì)遺傳物質(zhì)并非DNA而是RNA的有機(jī)體進(jìn)行識(shí)別中的應(yīng)用、并且適合逆轉(zhuǎn)錄。
[0260]例如，圖1A-圖1C和圖2A-圖2C表明，如使用一系列示出了回腸灌洗樣品中細(xì)菌比例的餅形圖所示的，由回腸灌洗樣品識(shí)別的微生物群隨它們被分離的方法不同而不同。圖1A示出患者的回腸灌洗樣品；圖1B示出使用未包覆珠進(jìn)行免疫沉淀的相同回腸灌洗樣品(即，對(duì)照)；圖1C示出通過(guò)使用抗人IgG包覆珠進(jìn)行回腸灌洗樣品的免疫沉淀而制備的IgG富集部分。在IgG富集部分和對(duì)照非包覆珠部分之間，觀測(cè)到10個(gè)PCR循環(huán)的豐度差異(即，IgG珠中的富集與對(duì)照珠中相比超出1000倍)。在由腸灌洗和灌入進(jìn)行如本文所述的免疫沉淀程序后，由抗IgG珠和對(duì)照珠中分離DNA ;使用附著有適當(dāng)?shù)你暯幼雍徒宇^的擴(kuò)增16S DNA的V2區(qū)域的引物來(lái)生成文庫(kù)，隨后在454測(cè)序儀上對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。圖1A-圖1C顯示基于V2同源序列并使用公共數(shù)據(jù)庫(kù)的分配至個(gè)體操作分類單元0TU的序列的相對(duì)豐度，所述數(shù)據(jù)庫(kù)如萬(wàn)維網(wǎng)上的greengenes.lbl.gov(在相比于對(duì)照沉淀灌洗和灌入的抗IgG免疫沉淀灌洗中)。為允許定性比較，對(duì)照未包覆珠免疫沉淀的DNA比IgG珠的DNA擴(kuò)增更多倍。在灌洗中的細(xì)菌群落在組成上與以對(duì)照珠沉淀的細(xì)菌群落非常相似，但與由IgG珠下拉的細(xì)菌群落相比非常不同。因此，如本文所使用的術(shù)語(yǔ)，IgG富集部分中識(shí)別的細(xì)菌為“免疫系統(tǒng)刺激性微生物”。對(duì)于在回腸灌洗樣品識(shí)別的細(xì)菌群落，圖2A-圖2C顯示了類似的結(jié)果。
[0261]本文所述的方法的優(yōu)點(diǎn)之一在于，它是用于識(shí)別微生物的非培養(yǎng)方法，免疫系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)臂(arm)對(duì)所述微生物產(chǎn)生特異性響應(yīng)，并因此與宿主具有生物相關(guān)性，而不需要在先或在后的培養(yǎng)步驟。所述測(cè)定法也可自動(dòng)化進(jìn)行，形成高通量模式。使用本文所述的方法和測(cè)定法對(duì)免疫系統(tǒng)刺激性微生物進(jìn)行測(cè)序的能力允許對(duì)微生物進(jìn)行直接檢測(cè)，從而用于對(duì)特定感染性疾病、尤其是其中的生物體無(wú)法培養(yǎng)的疾病進(jìn)行診斷和識(shí)別。例如，如圖3所示，使用本文所述的方法的實(shí)施方式，來(lái)自患有炎癥性腸病的患者的小腸分泌物的IgG包覆的細(xì)菌被特異性下拉并測(cè)序(使用來(lái)自免疫沉淀物的16s rDNA)。由16S rDNA的特異性引物，通過(guò)基于SYBR綠的定量實(shí)時(shí)PCR對(duì)16S rDNA的豐度(表示附著于抗IgG珠和對(duì)照珠的細(xì)菌的豐度)進(jìn)行定量。IgG富集部分中的細(xì)菌相對(duì)于對(duì)照(灌洗，未包覆珠)而言是特異性的，并以兩個(gè)以上的數(shù)量級(jí)(或大于100倍)富集。免疫沉淀物也可包含不可培養(yǎng)的微生物，這可需要下一代測(cè)序以及鳥(niǎo)槍法、宏基因組、下一代測(cè)序。
[0262]如圖4A-圖4C所示，本文所述的方法和測(cè)定法也可用于在使用常規(guī)方法時(shí)被認(rèn)為是無(wú)菌的樣品中識(shí)別病毒。如本文所述，使用抗IgG或?qū)φ諏?duì)來(lái)自HCV感染患者(圖4A和圖4C中的個(gè)體患者)的血清進(jìn)行免疫沉淀，并由抗hlgG免疫沉淀物和對(duì)照沉淀物分離RNA。對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并使用特異性引物測(cè)試HCV cDNA是否存在。如圖4C中所示(與圖4A為相同樣品)，在抗hlgG免疫沉淀物中檢測(cè)到HCV信號(hào)的184倍和117倍的富集，對(duì)照沉淀物中則幾乎不存在信號(hào)。這些附圖表明，本文所述的免疫沉淀程序還可應(yīng)用于“無(wú)菌”環(huán)境(如外周血)；并且表明了，如本文所述，使用特異性檢測(cè)這一 HCV陽(yáng)性供體內(nèi)的HCV RNA的引物，能夠沉淀完全的病毒?？呻S后通過(guò)任何基于測(cè)序的手段檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，例如，在病毒的情況下使用宏基因組手段、或?qū)τ诩?xì)菌的情況使用宏基因組手段或基于16S的手段等。
[0263]這些測(cè)定法和方法對(duì)于(新發(fā))感染性疾病的新型病原體識(shí)別以及常規(guī)(目前定義的)感染性疾病的診斷方法方面是有用的。本文所述的方法允許非?？焖俚脑\斷以及對(duì)生物體在體內(nèi)的生物學(xué)特性(例如抗 生素/抗病毒劑耐藥性)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)的機(jī)會(huì)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于在患有疾病或失調(diào)的患者中對(duì)免疫刺激性微生物的存在進(jìn)行識(shí)別或檢測(cè)的方法，所述方法包括下列步驟: (a)由患者樣品制備免疫蛋白g集部分； (b)由所述免疫蛋白富集部分提取核酸； (c)對(duì)提取的核酸進(jìn)行測(cè)序；以及 (d)將所述提取的核酸的序列與已知的微生物核酸序列進(jìn)行比較，以識(shí)別由所述免疫蛋白富集部分提取的核酸是否為微生物核酸，其中，若所述提取的核酸為微生物核酸，則所述患者被檢測(cè)為具有免疫刺激性微生物。
2.一種用于在患有疾病或失調(diào)的患者中對(duì)免疫刺激性微生物的存在進(jìn)行識(shí)別或檢測(cè)的方法，所述方法包括下列步驟: (a)由從患者樣品獲得的免疫蛋白富集部分中提取核酸； (b)對(duì)提取的核酸進(jìn)行測(cè)序；以及 (c)將所述提取的核酸的序列與已知的微生物核酸序列進(jìn)行比較，以識(shí)別由所述免疫蛋白富集部分提取的核酸是否為微生物核酸，其中，若所述提取的核酸為微生物核酸，則所述患者被檢測(cè)為具有免疫刺激性微生物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述患有疾病或失調(diào)的患者患有炎癥性腸病。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述炎癥性腸病為Crohn's病、潰瘍性結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎、淋巴細(xì)胞性結(jié)腸炎、缺血性結(jié)腸炎、改道性結(jié)腸炎、Behcet' s綜合征或未定型結(jié)腸炎。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述患有疾病或失調(diào)的患者患有自身免疫失調(diào)。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述患有疾病或失調(diào)的患者患有硬化、敗血癥或病毒血癥。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用對(duì)免疫球蛋白、補(bǔ)體蛋白或病原體識(shí)別受體具有特異性的親和結(jié)合劑制備。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用對(duì)1gA, 1gD, 1gE, 1gG, IgM具有特異性的親和結(jié)合劑或所述親和結(jié)合劑的任意組合制備。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用對(duì)IgG具有特異性的親和結(jié)合劑制備。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用親和結(jié)合劑利用免疫沉淀制備。
11.如權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述親和結(jié)合劑為蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L、免疫蛋白特異性抗體或其片段，或所述親和結(jié)合劑的任意組合。
12.如權(quán)利要求7-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述親和結(jié)合劑或免疫蛋白特異性抗體包括抗人IgG抗體、抗人IgA抗體、抗人IgD抗體、抗人IgE抗體、抗人IgM抗體，或所述親和結(jié)合劑或抗體的任意組合。
13.如權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述親和結(jié)合劑對(duì)免疫球蛋白免疫蛋白具有特異性，并結(jié)合至所述免疫球蛋白免疫蛋白的Fe片段上的抗原表位。
14.如權(quán)利要求7-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述親和結(jié)合劑未結(jié)合至固相載體。
15.如權(quán)利要求7-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述親和結(jié)合劑結(jié)合至固相載體。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述固相載體包括超順磁微珠、微尺度瓊脂糖珠、或瓊脂糖樹(shù)脂珠。
17.如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中，被檢測(cè)的所述免疫系統(tǒng)刺激性微生物為細(xì)菌、真菌或病毒。
18.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的方法，其中，被檢測(cè)的所述免疫系統(tǒng)刺激性微生物屬于分類單元中的古細(xì)菌域、細(xì)菌域或真核生物域。
19.如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述患者樣品為血液樣品、血漿樣品、尿樣品、腦脊液樣品、粘膜樣品、糞便樣品、腸灌洗樣品、腸液樣品、關(guān)節(jié)液樣品、呼吸道痰樣品或支氣管肺泡灌洗液樣品。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述腸灌洗樣品為回腸灌洗樣品。
21.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的方法，其中，被檢測(cè)的所述免疫系統(tǒng)刺激性微生物為先前未特征化的微生物。
22.如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述測(cè)序步驟使用鳥(niǎo)槍法克隆、16SrRNA/DNA擴(kuò)增和/或宏基因組測(cè)序進(jìn)行。
23.如權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(b)或步驟(c)中的所述測(cè)序使用微生物基因特異性引物進(jìn)行。
24.如權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(b)或步驟(c)中的所述測(cè)序使用非基因特異性引物進(jìn)行。
25.如權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述的方法，其中，用于從中制備所述免疫蛋白富集部分的所述患者樣品在所述提取核酸的步驟之前并未進(jìn)行培養(yǎng)步驟。
26.一種用于在患者樣品中對(duì)免疫系統(tǒng)刺激性微生物進(jìn)行直接檢測(cè)的測(cè)定法，所述測(cè)定法包括下列步驟: Ca)由從患者樣品制備的免疫蛋白富集部分中提取核酸；以及 (b)對(duì)存在于所述免疫蛋白富集部分中的提取的核酸進(jìn)行測(cè)序，從而獲得存在于所述患者樣品中的任何免疫系統(tǒng)刺激性微生物的序列。
27.一種用于在患者樣品中對(duì)免疫系統(tǒng)刺激性微生物進(jìn)行直接檢測(cè)的測(cè)定法，所述測(cè)定法包括下列步驟: (a)從患者樣品制備免疫蛋白g集部分； (b)由所述免疫蛋白富集部分中提取核酸；以及 (c)對(duì)存在于所述免疫蛋白富集部分中的提取的核酸進(jìn)行測(cè)序，從而獲得存在于所述患者樣品中的任何免疫系統(tǒng)刺激性微生物的序列。
28.如權(quán)利要求26或27所述的測(cè)定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用對(duì)免疫球蛋白、補(bǔ)體蛋白或病原體識(shí)別受體具有特異性的親和結(jié)合劑制備。
29.如權(quán)利要求26-28中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用對(duì)IgA、IgD、IgE、IgG、IgM具有特異性的親和結(jié)合劑或所述親和結(jié)合劑的任意組合制備。
30.如權(quán)利要求26-29中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用對(duì)IgG具有特異性的親和結(jié)合劑制備。
31.如權(quán)利要求26-30中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過(guò)使用親和結(jié)合劑利用免疫沉淀制備。
32.如權(quán)利要求31所述的測(cè)定法，其中，所述親和結(jié)合劑為蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L、免疫蛋白特異性抗體或其片段，或所述親和結(jié)合劑的任意組合。
33.如權(quán)利要求28-32中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，所述親和結(jié)合劑或免疫蛋白特異性抗體包括抗人IgG抗體。
34.如權(quán)利要求28-33中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，所述親和結(jié)合劑對(duì)免疫球蛋白免疫蛋白具有特異性，并結(jié)合至所述免疫球蛋白免疫蛋白的Fe片段上的抗原表位。
35.如權(quán)利要求28-34中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，所述親和結(jié)合劑未結(jié)合至固相載體。
36.如權(quán)利要求28-34中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，所述親和結(jié)合劑結(jié)合至固相載體。
37.如權(quán)利要求36所述的測(cè)定法，其中，所述固相載體包括超順磁微珠、微尺度瓊脂糖珠、或瓊脂糖樹(shù)脂珠。
38.如權(quán)利要求26-38中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，被檢測(cè)的所述免疫系統(tǒng)刺激性微生物為細(xì)菌、真菌或病毒。
39.如權(quán)利要求26-39中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，被檢測(cè)的所述免疫系統(tǒng)刺激性微生物屬于分類單元中的古細(xì)菌域、細(xì)菌域或真核生物域。
40.如權(quán)利要求26-40中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，所述患者樣品為血液樣品、血漿樣品、尿樣品、腦脊液樣品、粘膜樣品、糞便樣品、腸灌洗樣品、腸液樣品、關(guān)節(jié)液樣品、呼吸道痰樣品或支氣管肺泡灌洗液樣品。
41.如權(quán)利要求40所述的測(cè)定法，其中，所述腸灌洗樣品為回腸灌洗樣品。
42.如權(quán)利要求26-41中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，被檢測(cè)的所述免疫系統(tǒng)刺激性微生物為先前未特征化的微生物。
43.如權(quán)利要求26-42中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，所述測(cè)序步驟使用鳥(niǎo)槍法克隆、16S rRNA/DNA擴(kuò)增和/或宏基因組測(cè)序進(jìn)行。
44.如權(quán)利要求26-43中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，步驟(b)或步驟(c)中的所述測(cè)序使用微生物基因特異性引物進(jìn)行。
45.如權(quán)利要求26-43中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，步驟(b)或步驟(c)中的所述測(cè)序使用非基因特異性引物進(jìn)行。
46.如權(quán)利要求26-45中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，用于從中制備所述免疫蛋白富集部分的所述患者樣品在所述提取核酸的步驟之前并未進(jìn)行培養(yǎng)步驟。
47.如權(quán)利要求26-47中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中，所述微生物不能使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)。
48.一種用于由至少一個(gè)測(cè)試樣品獲取數(shù)據(jù)的系統(tǒng)，所述測(cè)試樣品包含由免疫蛋白富集樣品中提取的核酸，所述免疫蛋白富集樣品由至少一名患者處獲得，所述系統(tǒng)包含: a.測(cè)定模塊，所述測(cè)定模塊被配置用于接收包含所述提取的核酸的所述至少一個(gè)測(cè)試樣品，并對(duì)所述至少一個(gè)測(cè)試樣品進(jìn)行至少一次測(cè)序分析，以產(chǎn)生測(cè)序數(shù)據(jù)輸出； b.存儲(chǔ)裝置，所述存儲(chǔ)裝置被配置用于存儲(chǔ)來(lái)自所述測(cè)定模塊的所述測(cè)序數(shù)據(jù)輸出； c.比較模塊，所述比較模塊 被配置用于接收包含提取的核酸的所述測(cè)試樣品的所述測(cè)序數(shù)據(jù)輸出，并對(duì)所述測(cè)序數(shù)據(jù)輸出進(jìn)行至少一次測(cè)序分析，以確定下列條件之一存在與否，并產(chǎn)生比較數(shù)據(jù)輸出:. 1.所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性為20%以上；或者 ?.所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性低于20% ； 以及 d.顯示模塊，所述顯示模塊用于對(duì)部分基于來(lái)自所述比較模塊的所述比較數(shù)據(jù)輸出的內(nèi)容進(jìn)行顯示，其中，所述內(nèi)容包括表明所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性為20%以上的信號(hào)；或者表明所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性低于20%的信號(hào)。
49.如權(quán)利要求46所述的系統(tǒng)，其中，所述顯示模塊上顯示的內(nèi)容進(jìn)一步包括表明建議接受特定治療方案的 患者的信號(hào)。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103635591SQ201280015562
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2012年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月26日
【發(fā)明者】阿瑟·卡澤爾, 理查德·布隆伯格 申請(qǐng)人:布里格姆及婦女醫(yī)院股份有限公司, 因斯布魯克醫(yī)科大學(xué)