專利名稱：功能性微生物多樣性分析用引物和使用該引物的多重擴增的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及功能性微生物多樣性分析用引物和使用該引物的多重擴增，具體地說，涉及功能性微生物多樣性分析用針對β-葡萄糖苷水解酶基因的引物和使用所述引物的多重擴增。
背景技術(shù)：
β_葡萄糖苷水解酶是微生物降解纖維素反應中的限速酶，他作用于由葡聚糖內(nèi)切酶和葡聚糖外切酶分解纖維素產(chǎn)生的纖維二糖分子和一些更小的寡聚糖分子，將其水解生成葡萄糖分子供微生物利用，因此β-葡萄糖苷水解酶在自然界碳循環(huán)中發(fā)揮著重要的作用。自然界中能產(chǎn)生葡萄糖苷水解酶的微生物種類繁多，不同微生物的葡萄糖苷水解酶按其分子結(jié)構(gòu)特征分屬為配糖水解酶家族I (GHl)和配糖水解酶家族3 (GH3)兩類，同一家族中的葡聚糖苷酶基因同源性較高，這使葡萄糖苷水解酶基因具備了作為分子標記基因應用于復雜微生態(tài)環(huán)境中功能性微生物群落多樣性的研究。本研究通過數(shù)據(jù)庫獲得不同微生物β-葡萄糖苷水解酶基因序列，經(jīng)DNAMAN6. O軟件進行序列同源性比對后分別設(shè)計β_葡萄糖苷水解酶GHl家族的通用簡并引物，和β -葡萄糖苷水解酶GH3家族細菌、放線菌的通用簡并引物，以及β -葡萄糖苷水解酶GH3家族真菌的通用簡并引物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)缺陷，提供一種功能性微生物多樣性分析用引物和使用該引物的多重擴增，所述引物能良好的反應實驗對象中參與降解纖維素的功能性微生物的多樣性，可以適用于來源于土壤，沉積物，人畜胃腸道等環(huán)境樣品的分析。其技術(shù)方案為一種功能性微生物多樣性分析用引物，選擇通用簡并引物3對GH1F和GHlR-GC ；GH3BR 和 GH3BF-GC ；GH3ER 和 GH3EF-GC。進一步優(yōu)選，所述通用簡并引物為GHlF和GH1R-GC。進一步優(yōu)選，所述通用簡并引物為GH3BR和GH3BF-GC。進一步優(yōu)選，所述通用簡并引物為GH3ER和GH3EF-GC。一種多重擴增檢測方法所述方法用于來源土壤，沉積物，人畜胃腸道的環(huán)境樣品的分析，該方法包括本發(fā)明所述的引物進行擴增。具體方法如下β -葡萄糖苷水解酶GHl家族基因的PCR擴增(I)弓丨物選擇通用簡并引物GHlF和GHlR-GC(2)反應體系及反應參數(shù)模板為純化后的DNA
IOxPCRbufFer5μ
dNTP4μ
模板Ιμ
Taq 酶0.5pL
GHlF0.5μ
GHlR-GC0.5μ 加滅菌的去離子水補充反應體系，總體積為50 μ L(3)反 應條件
94°C預變性3min
94°C 變性Imin
47.3°C 退火Imin
72°C 延伸45 S
72°C終延伸IOmin35個循環(huán)后1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。β -葡萄糖苷水解酶GH3家族(細菌來源)基因的PCR擴增(I)引物選擇通用簡并引物GH3BR和GH3BF-GC(2)反應體系及反應參數(shù)模板為純化后的DNA
IOxPCR buffer5μ
dNTP4μ
模板I μι
Taq 酶0.5pL
GH3BR0.5μ
GH3BF-GC0.5μ 加滅菌的去離子水補充反應體系，總體積為50 μ L(3)反應條件
94°C預變性3min
94°C 變性Imin
52°C 退火Imin
72 延伸45S
72°C終延伸IOmin35個循環(huán)后1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。β -葡萄糖苷水解酶GH3家族(真菌來源)基因的PCR擴增(I)引物選擇通用簡并引物GH3ER和GH3EF-GC(2)反應體系及反應參數(shù)模板為純化后的DNAIOxPCRbuffer5μ
dNTP4μ
模板Ιμ
Taq 酶0.5μι
GH3ER0.5 μι
GH3EF-GC0.5μ
加滅菌的去離子水補充反應體系，總體積為50 μ L(3)反應條件
94°C預變性3min
94°C 變性Imin
57.2 °C 退火Imin
72°C 延伸45 S
72°C終延伸IOmin35個循環(huán)后1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。樣品DNA的提取改進的細菌基因組DNA的提取方法DNA 提取液的配制100mmol/L Tris-HCl, 100mmol/L EDTA，100mmol/L 磷酸鈉，I. 5mol/LNaCl, 1% CTAB, pH8. 0(I)稱取3g新鮮的堆肥樣品，加入13. 5mLDNA提取液中；(2)加入50 μ L的蛋白酶K(20mg/mL)，于225r/min搖床上37°C搖動30min ;再加入I. 5mL的20% SDS，65°C水浴I. 5h，每隔10 20min顛倒混勻一次；(3)室溫6，000r/min離心IOmin,收集上清轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，沉淀加入4. 5mL提取液和20%的SDS0. 5mL，渦旋震蕩20s，65°C水浴IOmin ；(4)室溫6，000r/min離心IOmin,收集上清合并于上次上清。重復上述操作，收集上清與前兩次上清合并；(5)上清與等體積的氯仿異戍醇(24 I體積比)充分混合,6，000r/min離心IOmin,吸取上層水相轉(zhuǎn)移至另一 50mL離心管中；(6)以0. 6倍體積的異丙醇室溫沉淀Ih,室溫16，000r/min離心15min,收集核酸
沉淀；(7)用預冷的70%乙醇洗滌沉淀，用200 μ L的TE溶解沉淀。真菌基因組DNA的提取(I)稱取0. 5g玻璃珠放入I. 5mL的離心管中，加入0. 4g的樣品，加入ImlBufferSLX/巰基乙醇。在漩渦震蕩器上震蕩5min ；(2)在70°C水浴中放置lOmin，每隔2 3min混勻一次。3000 5000r/min室溫離心5min,轉(zhuǎn)移800 μ L的上清液到一個新的2mL的離心管中,加入270 μ L的buffer SP2震蕩30S混合均勻；(3)冰浴5min,在13000r/min4°C離心5min,轉(zhuǎn)移上清到一個新的2mL的離心管中，加0. 7體積的異丙醇，充分混勻(來回顛倒離心管20次)，4°C 13000r/min離心IOmin用來沉淀DNA ；(4)小心棄掉上清，確定沒有將DNA沉淀吸出，用濾紙將液體吸干，加200 μ LElutionBuffer至離心管中，震蕩IOS后加入50 μ L的HTR Reagent (使用前要搖勻)，震蕩混勻IOS ；
(5)室溫放置2min, 13000r/min離心2min ;轉(zhuǎn)移上清至一新的I. 5mL的離心管中，加入等體積的XP2 Buffer，震蕩混勻IOS ；(6)將上述離心管中液體的700 μ L放置到提供的HiBind DNA column中，室溫10000r/min離心lmin，棄掉上清液，將柱子重新放回收集管中，重復一次后加300 μ L ΧΡ2Buffer,室溫 10000r/min 離心 Imin ；(7)倒掉上清液，再將柱子放回新的收集管中，再用700 μ L用無水乙醇稀釋過的SPffffash Buffer, 10000r/min 離心 lmin,倒掉上清液，重復再加 700 μ L 的 SPW Wash Buffer后離心；(8)棄掉液體將柱子放入一個空的收集管中13000r/min室溫離心2min,這一步驟很重要，處理不當會影響下游操作；(9)將柱子放置到新的I. 5mL的離心管中，加入30 μ L的去離子，13000r/min離心Imin洗脫DNA，重復一次。變性梯度凝膠電泳采用8%的聚丙烯酰胺凝膠，其中尿素濃度40% 70%。電泳采用D_code DGGE系統(tǒng)(Bio-Rad)，電泳緩沖液為1XTAE，在130V固定電壓下電泳17h，進行硝酸銀染色。條帶的克隆序列分析從DGGE膠中選擇特異條帶切下，用去離水沖洗凈后放入滅菌離心管中，加30 μ L的去離子水，放于4°C冰箱12-14h ；用測序引物(不帶GC夾子)再次擴增，擴增產(chǎn)物與PMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒DNA后進行雙酶切鑒定，將陽性克隆菌液送測序公司測序。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明提供的引物具有很好的通用性和實用性，能良好的反應實驗對象中參與降解纖維素的功能性微生物的多樣性，可以適用于來源于土壤，沉積物，人畜胃腸道等環(huán)境樣品的分析。


圖I是堆肥樣品總DNA中β -glucosidase基因GHl家族的PCR擴增結(jié)果圖；圖2是自然堆肥β -葡萄糖苷水解酶GHl家族DGGE圖譜；圖3是堆肥樣品總DNA中β -glucosidase基因GH3家族(細菌)的PCR擴增結(jié)果;圖4是自然堆肥β -葡萄糖苷水解酶GH3家族(細菌)DGGE圖譜；圖5堆肥樣品總DNA中β -glucosidase基因GH3家族(真菌)的PCR擴增結(jié)果；圖6自然堆肥β -葡萄糖苷水解酶GH31家族(真菌)DGGE圖譜。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖與具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細地說明。本發(fā)明通過數(shù)據(jù)庫獲得不同微生物β -葡萄糖苷水解酶基因序列，經(jīng)DNAMAN6. O軟件進行序列同源性比對后分別設(shè)計β_葡萄糖苷水解酶GHl家族的通用簡并引物(GH1F，GH1R，GH1R-GC)，和β -葡萄糖苷水解酶GH3家族細菌、放線菌的通用簡并引物(GH3BF，GH3BR, GH3BF-GC)以及β -葡萄糖苷水解酶GH3家族真菌的通用簡并引物(GH3EF，GH3ER，GH3EF-GC)。β -葡萄糖苷水解酶GHl家族基因陽性微生物群落的組成簡并引物擴增β -葡萄糖苷水解酶基因(GH-1家族)得到約400bp的目的片段，反應特異性好。結(jié)果顯示堆肥樣品DNA中目的條帶擴增效果見圖I。從圖2中可以觀察到堆肥第3-12天(即高溫期的前期)條帶與堆肥其他時期明顯不同。堆肥第14-26天(即高溫期的后期及降溫期)條帶圖譜變化不大，同高溫期的前期條帶圖譜差別明顯。在高溫堆肥處理農(nóng)業(yè)固體廢棄物過程中，高溫期前期多糖和淀粉類等易分解物質(zhì)降解迅速，而這一時期纖維素分解緩慢，隨著堆肥進程的發(fā)展易分解的有機質(zhì)分解殆盡后纖維素類物質(zhì)開始大量為微生物所分解利用。這解釋了本研究中堆肥高溫期β -葡萄糖苷水解酶GHl家族條帶的變化趨勢，即高溫期后期及降溫期條帶的指示菌與纖維素類物質(zhì)分解有關(guān)聯(lián)。堆肥第31天堆體進入腐熟期，之前出現(xiàn)的條帶消失且沒有新條帶出現(xiàn)，指示盡管該時期仍為纖維素類物質(zhì)快速分解期，但沒有或很少有葡萄糖苷水解酶GHl家族條帶指示菌參與，這在PCR結(jié)果中已有體現(xiàn)。β -葡萄糖苷水解酶GH3家族基因陽性微生物群落的組成簡并引物擴增β_葡萄糖苷水解酶基因(GH-3家族原核微生物來源)得到約370bp的目的片段，反應特異性好。結(jié)果顯示堆肥第20，22，26，31天樣品DNA中目的條帶擴增效果不明顯見圖3。從圖4中可以觀察到堆肥的不同時期即高溫期前期和高溫期后期及降溫腐熟期圖譜條帶區(qū)別明顯，結(jié)合PCR結(jié)果可知在纖維素物質(zhì)快速降解的時期(即高溫期中后期和降溫腐熟期)，具有β -葡萄糖苷水解酶基因GH-3家族的原核微生物沒有或有很少種類和數(shù)量的細菌參與纖維素物質(zhì)的分解。簡并引物擴增葡萄糖苷水解酶基因(GH-3家族真核微生物來源)得到約500bp的目的片段，反應特異性好。結(jié)果顯示堆肥第20，22，26，31天樣品DNA中目的條帶擴增特異性好見圖5。從圖6中可以觀察到堆肥的高溫期末期和降溫腐熟期條帶變化不大，降溫腐熟期條帶多樣性略有增加，這與一般好氧堆肥進程中真菌菌群的動態(tài)變化是一致的，即高溫期數(shù)量降低，降溫腐熟期數(shù)量及種類增加。表明具有β_葡萄糖苷水解酶基因GH-3家族的真菌在堆肥的高溫期后期和降溫期參與纖維素的分解，并取代細菌在堆肥的低溫階段即第二中溫期發(fā)揮重要的功能。附本發(fā)明所涉及的引物序列GH_3_E 家族上游引物GH3EF(750bp)5 — 3 :ggtggtcgcRRYtggga5 — 3 ggtggtcgc (ag) (ag) (ct)tgggaCN 102618632 A i^sdt6/6 矧
〔0083〕 T"絲 2t/s3ER(1210bp)
I--I0084I——I5 — 3 :ccaggcatcggWcatRtc〔0085U 5 丨 3 :ccaggcatcgg (ta) cat (ag) tc〔0§6U ^:ga(tc)atg(at)ccgatgcctgg〔0087U S-3-B 00〔0088〕 ±絲cml 蓉 S3BFI--I0089I——I5 — 3 :ttcggcgaaga (tc) cc〔0090U 5 — 3 :ttcggcgaagaYcc〔0091〕 ± 絲cml 蓉 S3BFGC
I--I0092I——I"CGcccGccGcGcGcGGcGGGcGGGGcGGGGGCACGGGttCggCgaagaYCC T* 絲cml 蓉§BR
〔0093U 5 丨 3 :acgcctt(ct) (ga) (at)a(agoc〔0094U 5 13 :acgccttYRWaRcc〔olu S-I 00〔0096Uhr^slF
I--I0097I——I5 — 3 :cctaccagat (tc) ga (ag) gg 16bp SocI--I0098I——I5 — 3 :cctaccagatYgaRgg 16bp 6°°0c〔0099〕 T*絲 SIR
I--lolos5 丨 3 :gaggaag (ag) tccca (ag) tg 16bp 64DCI--I0101U gig :§RRaaRRtcccaRtR 16bp 640c
OO
權(quán)利要求
1.一種功能性微生物多樣性分析用引物，其特征在于，選擇通用簡并引物3對GHlR-GC ；GH3BR 和 GH3BF-GC ；GH3ER 和 GH3EF-GC。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的功能性微生物多樣性分析用引物，其特征在于，所述通用簡并引物為GHlF和GH1R-GC。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的功能性微生物多樣性分析用引物，其特征在于，所述通用簡并引物為GH3BR和GH3BF-GC。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的功能性微生物多樣性分析用引物，其特征在于，所述通用簡并引物為GH3ER和GH3EF-GC。
5.一種多重擴增檢測方法，其特征在于，所述方法用于來源土壤，沉積物，人畜胃腸道的環(huán)境樣品的分析，該方法包括利用權(quán)利要求1-4任一項所述的引物進行擴增。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種功能性微生物多樣性分析用引物和使用該引物的多重擴增，涉及3對用于功能性微生物多樣性分析的針對β-葡萄糖苷水解酶基因的引物。經(jīng)DNAMAN6.0軟件進行序列同源性比對后分別設(shè)計β-葡萄糖苷水解酶GH1家族的通用簡并引物GH1F，GH1R，GH1R-GC，和β-葡萄糖苷水解酶GH3家族細菌、放線菌的通用簡并引物GH3BF，GH3BR，GH3BF-GC，以及β-葡萄糖苷水解酶GH3家族真菌的通用簡并引物GH3EF，GH3ER，GH3EF-GC，本發(fā)明提供的引物具有很好的通用性和實用性，能良好的反應實驗對象中參與降解纖維素的功能性微生物的多樣性，可以適用于來源于土壤，沉積物，人畜胃腸道等環(huán)境樣品的分析。
文檔編號C12N15/11GK102618632SQ20121001753
公開日2012年8月1日 申請日期2012年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月20日
發(fā)明者劉華晶, 徐杰, 李洪濤, 許修宏, 馬波 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學