專利名稱：AMF群落多樣性巢式PCR-DGGE檢測(cè)中DNA Marker的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)群落的變 性梯度凝膠電泳(DGGE)分子檢測(cè)中AMF專用DNA Marker的制備方法，屬于微生物分子生 態(tài)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，DNA Marker作為一種分子標(biāo)記，在分子生物學(xué)的各種電泳 過(guò)程中，扮演著及其重要的角色，它是由分子量不同的DNA片段混合制成。目前本領(lǐng)域應(yīng)用 的DNA Marker種類很多，如DL2000、DGL-2000、DGL-4000等。實(shí)驗(yàn)中Marker的使用，可以 檢測(cè)膠濃度是否合適、電泳條件是否合適、縮短摸索實(shí)驗(yàn)條件的時(shí)間、提高效率、減少試劑 浪費(fèi)且易尋找實(shí)驗(yàn)失敗的原因。同時(shí)有了標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker可以使實(shí)驗(yàn)進(jìn)程加快，尤其適合 樣品量大的實(shí)驗(yàn)過(guò)程而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加精確可靠。叢枝菌根真菌(AMF)是一類重要的土壤真菌類群，能與陸地上80%以上植物形成 菌根共生體，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增加植物體碳固持、增強(qiáng)植物抗旱、重金屬和有機(jī)污染、改 良土壤結(jié)構(gòu)、促進(jìn)根際養(yǎng)分循環(huán)、維持脆弱植被生態(tài)系統(tǒng)多樣性和穩(wěn)定性等作用。探索AMF 群落結(jié)構(gòu)特征是挖掘該微生物資源的前提條件，為AMF菌劑的資源化利用提供依據(jù)。在以 往的幾十年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要依據(jù)濕篩傾倒-蔗糖離心法及其AMF孢子形態(tài)特征進(jìn)行AMF 群落結(jié)構(gòu)多樣性的研究。西北農(nóng)林科技大學(xué)唐明教授分別發(fā)表在《生態(tài)學(xué)報(bào)》2007年27 5463-5470 “不同生態(tài)條件下油松(Pinus tabulaeformis)菌根根際土壤微生物群落”，《土 壤學(xué)報(bào)》2009年46 =721-724 “土壤因子對(duì)檸條和沙棘根際AM真菌多樣性及侵染狀況的影 響”，《西北植物學(xué)報(bào)》2007年27 1233-1238“土壤鉛和鋅對(duì)植物根際叢枝菌根真菌分布的影 響”和《生態(tài)學(xué)雜志》2007年沈=1389-1392 “四川遂寧地區(qū)石油污染土壤中叢枝菌根真菌” 等論文。對(duì)我國(guó)西北黃土高原干旱與半干旱地區(qū)、西北鹽堿地、重金屬和石油污染區(qū)等典型 生態(tài)脆弱環(huán)境下植被根際AMF群落組成進(jìn)行了深入的研究，積累了寶貴的資料，取得了顯 著的成果。然而AMF群落多樣性的形態(tài)學(xué)研究方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果易受人為因素影 響，很難全面的反映AMF群落的特征。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子生態(tài)學(xué)的出現(xiàn)為菌根學(xué) 研究注入了新鮮血液。變性梯度凝膠電泳(Denatured Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)，最初是美國(guó)科學(xué)家Lerman L. S.等于1984年發(fā)明的，起初主要用來(lái)檢測(cè)DNA片段 中的點(diǎn)突變。荷蘭萊頓大學(xué)的Muyzer G.等在1993年首次將其應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)多 樣性研究。此后十年間，該技術(shù)被廣泛用于微生物分子生態(tài)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，目前已經(jīng) 發(fā)展成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要分子生物學(xué)方法之一。在AMF群落分子多樣性研究 領(lǐng)域，2005年加拿大薩斯喀徹溫大學(xué)的Germida J. J.等在《土壤生物學(xué)與生物化學(xué)》2005 年37 =1589-1597 “一種PCR-DGGE技術(shù)檢測(cè)耕作土壤中叢枝菌根真菌”中首次報(bào)道了將巢 式PCR-DGGE (Nested PCR-DGGE)技術(shù)運(yùn)用到AMF群落結(jié)構(gòu)多樣性研究領(lǐng)域，結(jié)果認(rèn)為該方 法比傳統(tǒng)擴(kuò)繁捕獲孢子，再依據(jù)叢枝菌根真菌孢子大小、孢子壁結(jié)構(gòu)和孢子形狀等形態(tài)特征鑒定省時(shí)省力。但是，該電泳過(guò)程沒有Marker。希臘塞薩勒大學(xué)的Ipsilantis I.等 在《土壤生物學(xué)與生物化學(xué)》2009年41 =2466-2476 “橄欖廢棄物對(duì)叢枝菌根真菌群落結(jié) 構(gòu)和功能的影響”中使用PCR-DGGE技術(shù)研究了外界環(huán)境對(duì)AMF群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果認(rèn)為 NestedPCR-DGGE為研究AMF多樣性提供了有力、可靠、精確的技術(shù)支持。綜合國(guó)內(nèi)外研究進(jìn) 展，以唐明教授為學(xué)科帶頭人的研究團(tuán)隊(duì)探索運(yùn)用NestedPCR-DGGE和克隆測(cè)序技術(shù)研究 AMF群落結(jié)構(gòu)多樣性的條件和方法，在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中發(fā)現(xiàn)問(wèn)題并總結(jié)規(guī)律，使得該技術(shù)更 加可靠、快速有效，研究結(jié)果發(fā)表在SCI期刊《植物與土壤》2010年326 =415-424 “紙坊溝 流域沙棘和檸條根際叢枝菌根真菌(AMF)群落多樣性的PCR-DGGE分析”。然而，截止到目前，還沒有有關(guān)AMF群落Nested PCR-DGGE檢測(cè)DNAMarker產(chǎn)品的 研究。因此，獲得AMF群落分子檢測(cè)DNA Marker對(duì)運(yùn)用巢式PCR-DGGE技術(shù)研究AMF群落 結(jié)構(gòu)多樣性及其發(fā)揮AMF在陸地生態(tài)脆弱區(qū)植被生態(tài)恢復(fù)中的作用機(jī)制具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
為克服沒有AMF專用Marker給AMF群落多樣性巢式PCR-DGGE檢測(cè)帶來(lái)的實(shí)驗(yàn)誤 差和試劑浪費(fèi)。本發(fā)明公開了一種AMF群落多樣性巢式PCR-DGGE檢測(cè)中DNA Marker的制 備方法。本發(fā)明是通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)的a.提取土壤DNA，純化DNA樣品，選用3套引物進(jìn)行巢式PCR過(guò)程，得到的第三次 PCR產(chǎn)物之后，-20°C保存?zhèn)溆?；b. DGGE分析，選擇膠濃度30% _70%，等待膠凝固完全之后，拔掉梳子，然后將整 個(gè)板子安裝在DGGE支架之上，等電泳液溫度升至58-60°C時(shí)，將安裝有板子的DGGE支架放 入電泳槽中，用50微升注射器快速上樣，接通電源，電泳，電泳液溫度為58°C，電泳完畢，取 下電泳板子，將膠條放入EB中染色lOmin，拍照，將電泳位置有差異的條帶切下，放入無(wú)菌 的PCR小管中，編號(hào)，在無(wú)菌操作臺(tái)中，向PCR小管中加入30 μ 1無(wú)菌水，放置溫度4°C，24h, 使用不含GC夾板的第三對(duì)引物再次擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，純化，回收，-20°C備用；c.克隆轉(zhuǎn)化，使用北京天根生化技術(shù)有限公司的pGM-T載體進(jìn)行特異條帶的克 隆，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，使用NS31和GloI引物進(jìn)行菌液PCR， 利用北京天根生化公司的DP-103質(zhì)粒提取試劑盒提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，一部分測(cè)序，一部 分-20°C保存；d.再次驗(yàn)證條帶在DGGE膠片上的位置，使用NS31-GC和GloI為引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳；e.制作AMF群落多樣性巢式PCR-DGGE Marker,使用NS31-GC和GloI為引物，進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物按照等體積比例充分混合，3000rpm離心lmin，-20°C保存待用；f.結(jié)合序列分析結(jié)果，明確AMF群落多樣性巢式PCR-DGGE Marker中每條帶所代 表的AMF種屬，并命名使用。該AMF群落多樣性巢式PCR-DGGE DNA Marker的發(fā)明，在AMF群落結(jié)構(gòu)的Nested PCR-DGGE研究中有重要的應(yīng)用價(jià)值?？煽s短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，尤其適用實(shí)驗(yàn)樣品量大的實(shí)驗(yàn)過(guò)程。 依照本發(fā)明可以開發(fā)出一系列研究AMF群落的DNA Marker,使得巢式PCR-DGGE技術(shù)在AMF 分子群落研究中更加適用、快捷、準(zhǔn)確。


附圖1為本發(fā)明使用土壤DNA的提取純化結(jié)果瓊脂糖電泳圖。附圖2為本發(fā)明使用土壤DNAAMF巢式PCR結(jié)果瓊脂糖電泳圖。圖中為3個(gè)栽培種，分別為檸杞1號(hào)(1)，檸杞菜1號(hào)(C)和檸杞5號(hào)(5)。其中 1-1，1-2，1-3，1-4代表的是檸杞1號(hào)的4個(gè)樣地，檸杞菜1號(hào)和檸杞5號(hào)同理，下同。附圖3為本發(fā)明使用土壤DNAAMF巢式PCR產(chǎn)物的DGGE圖譜。DGGE電泳條件為120V lOmin，然后轉(zhuǎn)換為70V 13h，變性膠濃度為30 %-70 %， 電泳液溫度為58°C，采用的設(shè)備為美國(guó)BIO-RAD公司生產(chǎn)的D-Code Universal Mutation Detection System(Bio-Rad, USA)。附圖4為本發(fā)明選取的8條特異性條帶的AMF群落多樣性巢式PCR-DGGE圖譜。DGGE電泳條件為120V10min，然后轉(zhuǎn)換為70V 13h，變性膠濃度為30% -70%，電 泳液溫度為58°C，采用的設(shè)備為美國(guó)BIO-RAD公司生產(chǎn)的D-Code Universal Mutation Detection System(Bio-Rad, USA)。附圖5為本發(fā)明AMF群落多樣性巢式PCR-DGGE Marker制作中使用的pGM_T載體 結(jié)構(gòu)圖。附圖6為本發(fā)明進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化后在LB固體培養(yǎng)基上的單克隆菌落圖。附圖7為本發(fā)明進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化后在LB固體培養(yǎng)基上的篩選陽(yáng)性克隆的瓊脂糖 檢測(cè)電泳圖。附圖 8 為本發(fā)明 AMF 群落多樣性巢式 PCR-DGGE Marker, AMFMarker (TM-2010)的 DGGE電泳圖。圖示8個(gè)條帶代表AMF的不同菌株，DGGE電泳條件為120V10min，然后轉(zhuǎn)換為70V 13h，變性膠濃度為30% -70%,電泳液溫度為58°C，采用的設(shè)備為美國(guó)BIO-RAD公司生產(chǎn)的 D-Code Universal Mutation DetectionSystem(Bio-Rad, USA)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述a.提取土壤 DNAa. 1稱取10. Og 土壤樣品放入50ml無(wú)菌離心管中，a. 2向離心管中加入液氮，重復(fù)3次，每次間隔!3min，a. 3將土壤轉(zhuǎn)移至玻璃研缽中，充分研磨lOmin，a. 4 裝入無(wú)菌離心管中，加入 DNA 提取液0. lmol/L Tris-Hcl，0. lmol/L EDTA, 0. lmol/L Na3PO4,1. 5mol/L NaCl, 1% CTAB，pH8. 013. 5ml，加入濃度為 20mg/ml，50y 1 蛋白 酶K，購(gòu)買至TaKaLa公司，a. 5放入哈爾濱東聯(lián)儀器設(shè)備有限公司的搖床中，370C，225rpm,振動(dòng)90min，a. 6 取出并用 Iml 移液器(Eppendorf)加入 1. 5ml 20% SDS，65°C水浴 150min，每 間隔15min將離心管取出，上下顛倒3次，a. 7常溫條件下，6000g離心(Eppendorf 5804R) IOmin,將上清液轉(zhuǎn)移至另一 50ml 離心管中，
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a. 8加入4. 5ml DNA提取液和0. 5ml SDS,在小型渦旋器上振蕩10S，65°C水浴 10min，6000g離心lOmin，收集合并上清液，a. 9加入等體積氯仿-異戊醇V/V = 24 1，混合、充分搖勻，8000g離心lOmin， 吸取上層液體轉(zhuǎn)移至另一 50ml離心管中，加入0. 6倍體積的_20°C預(yù)冷異丙醇，置_20°C沉 淀 24h,a. 10 在 4°C條件下，10500rpm 離心 20min，用 IOml 移液器(Eppendorf)吸出液體； 使用無(wú)菌的1000 μ 1藍(lán)色槍頭挑出離心管底部一圈黑色沉淀物質(zhì)，并放入2. 5ml無(wú)菌離心
管中，a. 11向放有黑色沉淀的2. 5ml無(wú)菌離心管中加入Iml預(yù)冷的70%乙醇，3000rpm 離心30S，倒掉液體，以此重復(fù)5次，a. 12將洗滌后的含有DNA的2. 5ml離心管放置在冰塊之上，放入通風(fēng)櫥中，干燥3 至4h，確定管口無(wú)酒精味為止，a. 13 加入 100-200 μ 1 滅菌水，4°C放置 24h，a. 14使用北京天根生化公司的離心柱型普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒DP-209 進(jìn)行DNA純化快速的將單一的DNA條帶切下，放入2. 5ml無(wú)菌離心管中，并加入500 μ 1 溶膠液，50°C水浴lOmin，取出離心管，室溫靜置15min，向吸附柱中加入500μ 1平衡液， 12000rpm離心60S，倒掉收集管中廢液，將上一步所得溶液加入一個(gè)吸附管中，室溫放置 5min，12000rpm離心60S，倒掉收集管中廢液，向吸附柱中加入600 μ 1漂洗液，12000rpm離 心60S，倒掉廢液，重復(fù)3次，將吸附柱放置在通風(fēng)櫥中，放置池，無(wú)酒精味為止，向吸附膜懸 空加入30 μ 1無(wú)菌水，室溫放置5min，12000rpm離心2min，-20°C保存待用，a. 15 第一輪 PCR :20 μ 1 體系，PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4°C 4min 預(yù)變性，94°C 1 min， 54°C lmin，72°C 2min,30 個(gè)循環(huán)，72°C 7min,a. 16第二輪PCR :將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋20倍，充分搖勻，作為模板DNA，20y 1體 系，PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C 2min 預(yù)變性，94°C 45S，65°C lmin，72°C 45S，30 個(gè)循環(huán)，72°C 7min，a. 17第三輪PCR :將第二輪PCR產(chǎn)物稀釋20倍，充分搖勻，作為模板DNA，20y 1體 系，PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C 2min 預(yù)變性，94°C 45S，55 °C Imin，72 °C 45S，30 個(gè)循環(huán)，72 °C 7min，a. 18每輪的PCR反應(yīng)均采用天根公司預(yù)混上樣緩沖液的2XPCR mix反應(yīng)試劑 盒，加入DNA模板后，將PCR管放置在小型離心機(jī)上，快速離心15S，取出，均勻的放置在 PTC-200, Bio-Rad, USA PCR 儀上運(yùn)行，a. 19引物序列如下GeoA2 CCAgTAgTCATATgCTTgTCTCGeo11 :ACCTTgTTACgACTTTTACTTCCAMI gTTTCCCgTAAggCgCCgAANS31-GC :CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTggAgggCAAgTCTggTgCCGloI :gCCTgCTTTAAACACTCTAb. DGGE 分析b. 1制備梯度膠，室溫放置4h或者在30°C溫箱中放置30min，b. 2膠凝固完全之后，拔掉梳子，用注射器針頭將歪斜的空間隙膠條扶正，
b. 3將整個(gè)板子安裝在DGGE支架之上，等電泳液溫度升至58_60°C時(shí)，將安裝有板 子的DGGE支架放入電泳槽中，清洗膠孔，b. 4用50 μ 1注射器快速上樣PCR樣品30至40 μ 1，避免PCR產(chǎn)物擴(kuò)散，b. 5接通電源，120V電泳lOmin，然后70V電泳13h，電泳液溫度58°C，b. 6電泳完畢，取下電泳板子，將膠條放入EB中染色lOmin，拍照，b. 7將電泳位置有差異的條帶切下，放入無(wú)菌的PCR小管中，編號(hào)， b. 8在無(wú)菌操作臺(tái)中，向PCR小管中加入30 μ 1無(wú)菌水，放置在4°C，24h,使DNA從 膠里面析出。b. 9切取條帶的PCR過(guò)程使用不含GC夾板的第三對(duì)引物再次擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn) 物，使用DP-209DNA純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，回收，_20°C放置備用。c.克隆轉(zhuǎn)化c. 1目地片段的TA連接測(cè)序方法按北京天根生化公司pGM-T載體進(jìn)行目的PCR 片段 7 μ 1，pGM-T 載體 1,10XT4 DNA Ligation Buffer 1 μ 1, T4DNALigase 1 μ 1，16°C放 置12h ；取7μ 1鏈接產(chǎn)物加入到100 μ 1感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻，冰浴30min，置入42°C冰 浴90S，再冰浴2至3min，向其中加入500 μ 1 37°C預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，150rpm, 37°C振蕩培養(yǎng) 45min，取出，吸取100 μ 1加入到含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，無(wú)菌掛產(chǎn)涂布均勻， 37°C培養(yǎng) 12 至 24h，c. 2使用培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基胰化蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g,NaCl lg, IOOml純 水，充分搖勻，使用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 2，121°C滅菌20min，感受態(tài)細(xì)胞為北京天根 生化公司DH5a ；c. 3采用菌液PCR檢測(cè)，每個(gè)目標(biāo)條帶選擇3個(gè)單克隆進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性克隆放入裝 有500 μ 1液體含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基的離心管中，無(wú)菌封口膜封閉管口，放在離心管 架上，于恒溫?fù)u床上37°C，150rpm搖菌12至Mh，觀察有微量菌體沉淀在離心管管底或菌液 渾濁，即可將菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，c. 4提取質(zhì)粒采用北京天根生化公司質(zhì)粒提取試劑盒(DP10;3)進(jìn)行取100 μ 1培 養(yǎng)的菌液加入無(wú)菌離心管，室溫SOOOrpm離心;3min收集菌體，棄去上清液，加入7ml裂解 液，上下翻轉(zhuǎn)6次，室溫放置5min，使用0. 3倍的異丙醇沉淀質(zhì)粒，8000rpm離心2min，無(wú)水 乙醇清洗3次，將吸附柱放入另一無(wú)菌離心管中，加入30 μ 1無(wú)菌水，SOOOrpm離心2min，得 到質(zhì)粒DNA，DNA-20°C保存；d.再次驗(yàn)證條帶在DGGE膠片上的位置d. 1再次重復(fù)切取的代表性8條帶在DGGE膠片上的位置，確保準(zhǔn)確性，d. 2使用NS31-GC和GloI引物，PCR程序?yàn)榈谌啍U(kuò)增程序，20 μ 1體系，d. 3每條帶擴(kuò)增2管，共40 μ 1，使用50 μ 1微量進(jìn)樣器上樣，DGGE電泳過(guò)程按照b 步驟進(jìn)行；e.制作AMF群落多樣性巢式PCR-DGGE Marker e. 1使用NS31-GC和GloI引物在第三輪擴(kuò)增程序下進(jìn)行擴(kuò)增8條帶的DNA，e. 2將不同條帶的PCR產(chǎn)物等體積混合，放入無(wú)菌2. 5ml離心管中，充分混勻，e. 33000rpm 離心(Eppendorf 5424) lmin，無(wú)菌封口膜封閉管口，-20°C保存，得到 AMF DNAMarker，
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f.命名Marker，將獲得的AMF群落多樣性巢式PCR-DGGE Marker命名為AMF TM-2010。
權(quán)利要求
1. AMF群落多樣性巢式PCR-DGGE檢測(cè)中DNA Marker的制備方法，其特征在于是通過(guò) 以下方法實(shí)現(xiàn)的1. a.提取土壤DNA，純化DNA樣品，選用3套引物進(jìn)行巢式PCR過(guò)程，得到的第三次PCR 產(chǎn)物之后，-20°C保存?zhèn)溆?；l.b. DGGE分析，選擇膠濃度30% -70%，等待膠凝固完全之后，拔掉梳子，然后將整個(gè) 板子安裝在DGGE支架之上，等電泳液溫度升至58-60°C時(shí)，將安裝有板子的DGGE支架放入 電泳槽中，用50微升注射器快速上樣，接通電源，電泳，電泳液溫度為58°C，電泳完畢，取下 電泳板子，將膠條放入EB中染色lOmin，拍照，將電泳位置有差異的條帶切下，放入無(wú)菌的 PCR小管中，編號(hào)，在無(wú)菌操作臺(tái)中，向PCR小管中加入30 μ 1無(wú)菌水，放置溫度4°C，Μι，使 用不含GC夾板的第三對(duì)引物再次擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，純化，回收，-20°C備用；I.e.克隆轉(zhuǎn)化，使用北京天根生化技術(shù)有限公司的pGM-T載體進(jìn)行特異條帶的克隆， 轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，使用NS31和GloI引物進(jìn)行菌液PCR，利用北 京天根生化公司的DP-103質(zhì)粒提取試劑盒提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，一部分測(cè)序，一部分-20°C 保存；l.d.再次驗(yàn)證條帶在DGGE膠片上的位置，使用NS31-GC和GloI為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳；1. e.制作AMF群落多樣性巢式PCR-DGGE Marker,使用NS31-GC和GloI為引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物按照等體積比例充分混合，3000rpm離心lmin，-20°C保存待用；1.f.結(jié)合序列分析結(jié)果，明確AMF群落多樣性巢式PCR-DGGEMarker中每條帶所代表 的AMF種屬，并命名使用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的AMF群落多樣性巢式PCR-DGGE檢測(cè)中DNAMarker的制備方 法，其特征在于是通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)的2. a.提取土壤DNA2. a. 1稱取10. Og 土壤樣品放入50ml無(wú)菌離心管中， 2. a. 2向離心管中加入液氮，重復(fù)3次，每次間隔:3min， 2. a. 3將土壤轉(zhuǎn)移至玻璃研缽中，充分研磨lOmin，2. a. 4 裝入無(wú)菌離心管中，加入 DNA 提取液0. lmol/L Tris-Hcl,0. lmol/LEDTA, 0. lmol/L Na3PO4,1. 5mol/L NaCl, 1% CTAB, pH8. 0 13. 5ml，加入濃度為 20mg/ml，50y 1 蛋 白酶K，購(gòu)買至TaKaLa公司，2. a. 5放入哈爾濱東聯(lián)儀器設(shè)備有限公司的搖床中，37°C，225rpm，振動(dòng)90min， 2. a. 6 取出并用 Iml 移液器(Eppendorf)加入 1. 5ml 20% SDS，65°C水浴 150min，每間 隔15min將離心管取出，上下顛倒3次，2. a. 7常溫條件下，6000g離心(Eppendorf 5804R) lOmin，將上清液轉(zhuǎn)移至另一 50ml離 心管中，2. a. 8加入4. 5ml DNA提取液和0. 5ml SDS，在小型渦旋器上振蕩10S，65°C水浴lOmin， 6000g離心lOmin，收集合并上清液，2. a. 9加入等體積氯仿-異戊醇V/V = 24 1，混合、充分搖勻，8000g離心lOmin，吸 取上層液體轉(zhuǎn)移至另一 50ml離心管中，加入0. 6倍體積的_20°C預(yù)冷異丙醇，置_20°C沉淀 24h,2. a. 10在4°C條件下，10500rpm離心20min，用IOml移液器(Eppendorf)吸出液體；使 用無(wú)菌的1000 μ 1藍(lán)色槍頭挑出離心管底部一圈黑色沉淀物質(zhì)，并放入2. 5ml無(wú)菌離心管 中，2. a. 11向放有黑色沉淀的2. 5ml無(wú)菌離心管中加入Iml預(yù)冷的70%乙醇，3000rpm離 心30S，倒掉液體，以此重復(fù)5次，2. a. 12將洗滌后的含有DNA的2. 5ml離心管放置在冰塊之上，放入通風(fēng)櫥中，干燥3至 4h，確定管口無(wú)酒精味為止，2. a. 13 加入 100-200 μ 1 滅菌水，4°C放置 24h,2. a. 14使用北京天根生化公司的離心柱型普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒DP-209 進(jìn)行DNA純化快速的將單一的DNA條帶切下，放入2. 5ml無(wú)菌離心管中，并加入500 μ 1 溶膠液，50°C水浴lOmin，取出離心管，室溫靜置15min，向吸附柱中加入500 μ 1平衡液， 12000rpm離心60S，倒掉收集管中廢液，將上一步所得溶液加入一個(gè)吸附管中，室溫放置 5min，12000rpm離心60S，倒掉收集管中廢液，向吸附柱中加入600 μ 1漂洗液，12000rpm離 心60S，倒掉廢液，重復(fù)3次，將吸附柱放置在通風(fēng)櫥中，放置池，無(wú)酒精味為止，向吸附膜懸 空加入30 μ 1無(wú)菌水，室溫放置5min，12000rpm離心2min，-20°C保存待用，2. a. 15 第一輪 PCR :20 μ 1 體系，PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4 °C 4min 預(yù)變性，94 "C Imin, 540C lmin，72°C 2min,30 個(gè)循環(huán)，72°C 7min,2. a. 16第二輪PCR 將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋20倍，充分搖勻，作為模板DNA，20 μ 1體系， PCR 反應(yīng)程序?yàn)?940C 2min 預(yù)變性，94°C 45S，65°C lmin，72°C 45S，30 個(gè)循環(huán)，72°C 7min，a. 17第三輪PCR 將第二輪PCR產(chǎn)物稀釋20倍，充分搖勻，作為模板DNA，20 μ 1體系， PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C 2min 預(yù)變性，94°C 45S，55°C lmin，72°C 45S，30 個(gè)循環(huán)，72°C 7min，2. a. 18每輪的PCR反應(yīng)均采用天根公司預(yù)混上樣緩沖液的2XPCR mix反應(yīng)試劑盒，加 入DNA模板后，將PCR管放置在小型離心機(jī)上，快速離心15S，取出，均勻的放置在PTC-200， Bio-Rad, USAPCR 儀上運(yùn)行， 2. a. 19引物序列如下 GeoA2 CCAgTAgTCATATgCTTgTCTC Geo11:ACCTTgTTACgACTTTTACTTCC AMI gTTTCCCgTAAggCgCCgAANS31-GC CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGG GGTTggAgggCAAgTCTggTgCC GloI :gCCTgCTTTAAACACTCTA 2. b. DGGE 分析2. b. 1制備梯度膠，室溫放置4h或者在30°C溫箱中放置30min， 2. b. 2膠凝固完全之后，拔掉梳子，用注射器針頭將歪斜的空間隙膠條扶正， 2. b. 3將整個(gè)板子安裝在DGGE支架之上，等電泳液溫度升至58-60°C時(shí)，將安裝有板子 的DGGE支架放入電泳槽中，清洗膠孔，2. b. 4用50 μ 1注射器快速上樣PCR樣品30至40 μ 1，避免PCR產(chǎn)物擴(kuò)散， 2. b. 5接通電源，120V電泳lOmin，然后70V電泳13h，電泳液溫度58°C， 2. b. 6電泳完畢，取下電泳板子，將膠條放入EB中染色lOmin，拍照，·2. b. 7將電泳位置有差異的條帶切下，放入無(wú)菌的PCR小管中，編號(hào)， 2. b. 8在無(wú)菌操作臺(tái)中，向PCR小管中加入30 μ 1無(wú)菌水，放置在4°C，24h,使DNA從膠 里面析出。·2. b. 9切取條帶的PCR過(guò)程使用不含GC夾板的第三對(duì)引物再次擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物， 使用DP-209DNA純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，回收，_20°C放置備用。 2. c.克隆轉(zhuǎn)化·2. c. 1目地片段的TA連接測(cè)序方法按北京天根生化公司pGM-T載體進(jìn)行目的PCR片 段 7μ l，pGM-T 載體 1，10XT4 DNA Ligation Buffer 1 μ 1,T4DNA Ligase lyl，16°C放置 12h ；取7μ 1鏈接產(chǎn)物加入到100μ 1感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻，冰浴30min，置入42°C冰浴 90S，再冰浴2至;3min，向其中加入500 μ 1 37°C預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，150rpm，37°C振蕩培養(yǎng) 45min，取出，吸取100 μ 1加入到含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，無(wú)菌掛產(chǎn)涂布均勻， 37°C培養(yǎng) 12 至 24h，·2. c. 2使用培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基胰化蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g,NaCllg, IOOml純水， 充分搖勻，使用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 2，121°C滅菌20min，感受態(tài)細(xì)胞為北京天根生化 公司DH5 α ；·2. c. 3采用菌液PCR檢測(cè)，每個(gè)目標(biāo)條帶選擇3個(gè)單克隆進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性克隆放入裝有 500 μ 1液體含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基的離心管中，無(wú)菌封口膜封閉管口，放在離心管架 上，于恒溫?fù)u床上37°C，150rpm搖菌12至Mh，觀察有微量菌體沉淀在離心管管底或菌液渾 濁，即可將菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，·2. c. 4提取質(zhì)粒采用北京天根生化公司質(zhì)粒提取試劑盒(DP10;3)進(jìn)行取100 μ 1培養(yǎng) 的菌液加入無(wú)菌離心管，室溫SOOOrpm離心^iin收集菌體，棄去上清液，加入7ml裂解液， 上下翻轉(zhuǎn)6次，室溫放置5min，使用0. 3倍的異丙醇沉淀質(zhì)粒，8000rpm離心2min，無(wú)水乙醇 清洗3次，將吸附柱放入另一無(wú)菌離心管中，加入30 μ 1無(wú)菌水，SOOOrpm離心2min，得到質(zhì) 粒 DNA，DNA-20°C保存；·2. d.再次驗(yàn)證條帶在DGGE膠片上的位置·2. d. 1再次重復(fù)切取的代表性8條帶在DGGE膠片上的位置，確保準(zhǔn)確性， 2. d. 2使用NS31-GC和GloI引物，PCR程序?yàn)榈谌啍U(kuò)增程序，20 μ 1體系， 2. d. 3每條帶擴(kuò)增2管，共40 μ 1，使用50 μ 1微量進(jìn)樣器上樣，DGGE電泳過(guò)程按照b步 驟進(jìn)行；·2. e.制作AMF群落多樣性巢式PCR-DGGE Marker ·2. e. 1使用NS31-GC和GloI引物在第三輪擴(kuò)增程序下進(jìn)行擴(kuò)增8條帶的DNA， 2. e. 2將不同條帶的PCR產(chǎn)物等體積混合，放入無(wú)菌2. 5ml離心管中，充分混勻， 2. e. 33000rpm 離心(EppendorK4M) lmin，無(wú)菌封口膜封閉管口，_20°C保存，得到 AMF DNAMarker,·2. f.命名Marker，將獲得的AMF群落多樣性巢式PCR-DGGE Marker命名為AMF TM-2010。
全文摘要
本發(fā)明公開一種AMF群落多樣性巢式PCR-DGGE檢測(cè)中DNA Marker的制備方法，其技術(shù)方案是提取土壤DNA，DGGE分析，克隆轉(zhuǎn)化，驗(yàn)證條帶在DGGE膠片上的位置，制作AMF群落多樣性巢式PCR-DGGE Marker，使用NS31-GC和GloI為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)合序列分析結(jié)果并命名使用。本發(fā)明在AMF群落結(jié)構(gòu)的Nested PCR-DGGE研究中有重要的應(yīng)用價(jià)值?？煽s短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，尤其適用實(shí)驗(yàn)樣品量大的實(shí)驗(yàn)過(guò)程。依照本發(fā)明可以開發(fā)出一系列研究AMF群落的DNA Marker，使得巢式PCR-DGGE技術(shù)在AMF分子群落研究中更加適用、快捷、準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102146370SQ201010617030
公開日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者唐明, 張海涵, 陳輝 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)