專利名稱：?jiǎn)?dòng)子BgIosP549、制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種啟動(dòng)子BgIosPM9，含有該啟動(dòng)子 的核酸構(gòu)建體、載體、重組細(xì)胞、植物愈傷組織，該啟動(dòng)子的制備方法以及利用該啟動(dòng)子來(lái) 調(diào)控植物中基因表達(dá)的方法。
背景技術(shù)：
啟動(dòng)子是基因的一個(gè)組成部分，通常位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游，是RNA聚合酶識(shí)別、 結(jié)合和開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)全酶(holoenzyme)同模板正確結(jié)合，活 化RNA聚合酶，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，從而控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時(shí)間和表達(dá)的程度。在轉(zhuǎn) 基因植物中，啟動(dòng)子是影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的重要因素之一，選擇高效率的啟動(dòng)子是高效 率表達(dá)外源基因的關(guān)鍵。根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為3類組成型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng) 子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。所謂組成型啟動(dòng)子是指在組成型啟動(dòng)子調(diào)控下，不同組織器官和發(fā)育 階段的基因表達(dá)沒(méi)有明顯差異，因而稱之組成型啟動(dòng)子。雙子葉植物中最常使用的組成型 啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子。另一種高效的組成型啟動(dòng)子CsVMV是從木薯 葉脈花葉病毒(cassava vein mosaic virus)中分離的。人們高度重視從植物本身克隆組成型啟動(dòng)子。例如肌動(dòng)蛋白(actin)和泛素 (ubiquitin)等基因的啟動(dòng)子已被克隆。用這些啟動(dòng)子代替CaMV 35S啟動(dòng)子，可以更有效 地在單子葉植物中驅(qū)動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄。Naomi等分別從擬南芥的色氨酸合酶β亞基基因 和植物光敏色素基因中克隆了相應(yīng)啟動(dòng)子，用其代替CaMV 35S啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)基因煙草中也 取得了很好的表達(dá)效果(Plant biotechnology, 2002,19(1) :19-26)。單子葉植物基因中常見(jiàn)的啟動(dòng)子有山bi啟動(dòng)子(Plant ubiquitin promoter)、Actin 啟動(dòng)子(Plant Actin promoter)禾口 Adh-1 啟動(dòng)子(Maize alcohol dehydrogenaselpromoter)。Ubi啟動(dòng)子以其啟動(dòng)效率高、甲基化程度低、遺傳性狀穩(wěn)定等因素而倍受青睞。目 前，已經(jīng)從很多泛素基因中分離得到啟動(dòng)子序列，包括玉米基因組中的WDi-I啟動(dòng)子、水稻 泛素RUBQ2啟動(dòng)子、擬南芥泛素啟動(dòng)子、向日葵泛素WdBI啟動(dòng)子、煙草泛素Ubi. U4啟動(dòng)子、 馬鈴薯泛素證丨7啟動(dòng)子、番茄泛素W^il-I啟動(dòng)子，大麥泛素Mubl啟動(dòng)子。玉米泛素W^i-I 啟動(dòng)子已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于玉米、小麥、水稻等單子葉植物中，水稻泛素RUBQ2啟動(dòng)子在水稻 和甘蔗中也有較多的應(yīng)用。Actin啟動(dòng)子1990年由康奈爾大學(xué)的McElroy等首次在水稻中發(fā)現(xiàn)，屬于強(qiáng)組成 型啟動(dòng)子。Actin啟動(dòng)子在單子葉禾本科中作用顯著，但是鄰近科屬的植物中的基因調(diào)控功 能卻十分不理想。因此，許多相關(guān)研究通過(guò)其他單子葉植物尋找Actin啟動(dòng)子，并成功在香 蕉、甜瓜、玉米和擬南芥中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。Actin啟動(dòng)子由于對(duì)基因表達(dá)的強(qiáng)調(diào)控作用，在單子葉 植物優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因中已經(jīng)得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。Adh-I啟動(dòng)子調(diào)控乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase)基因，對(duì)植物在缺氧環(huán)境下乙醇脫氫酶的表達(dá)至關(guān)重要。Adh-I啟動(dòng)子對(duì)單子葉植物特別是谷類植物如水稻、燕麥 和大麥，和少部分雙子葉植物如煙草，基因的調(diào)控功能比花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動(dòng)子 提高10-50倍。Adh-I啟動(dòng)子主要應(yīng)用于單子葉植物，對(duì)絕大部分雙子葉植物基因表達(dá)的調(diào) 控效果都很有限。單子葉植物是被子植物的主要類群，單子葉植物中的禾本科、百合科、棕櫚科和天 南星等，是非常重要的農(nóng)業(yè)作物。單子葉植物基因的強(qiáng)效啟動(dòng)子，能夠調(diào)控植物高效率表達(dá) 具有特殊性狀的外源基因，對(duì)優(yōu)良作物的分子育種研究意義重大。在強(qiáng)效啟動(dòng)子相關(guān)研究領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了許多單子葉植物的啟動(dòng)子。此外，雙子 葉植物中的一些強(qiáng)效啟動(dòng)子如CsVMV啟動(dòng)子、番茄E8啟動(dòng)子、白藜蘆醇合酶基因Vstl啟動(dòng) 子等高效啟動(dòng)子，在單子葉植物中也有很強(qiáng)的基因調(diào)控作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的啟動(dòng)子，能夠在植物中調(diào)控基因的表達(dá)。本發(fā)明的另一目的在于提供含有上述啟動(dòng)子的核酸構(gòu)建體、載體、重組細(xì)胞、植物 愈傷組織、植物外植體及植物。本發(fā)明的再一目的在于提供一種制備上述啟動(dòng)子的引物、方法，以及一種利用該 啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控植物中基因表達(dá)的方法。本發(fā)明的再一目的在于提供一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，以及上述啟動(dòng)子在調(diào)控 植物中目的基因表達(dá)或植物育種中的用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公開(kāi)了一種啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子含有選自以下任意一組并具有啟動(dòng)子功能 的核苷酸序列a、Seq ID No. 1所示的核苷酸序列；以與kq ID No. 1互補(bǔ)的核苷酸序列；C、在高等嚴(yán)緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；d、對(duì)上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核 苷酸序列；e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。本發(fā)明還公開(kāi)了一種核酸構(gòu)建體，包含上述啟動(dòng)子，以及與啟動(dòng)子可操作連接的 基因序列，其中所述啟動(dòng)子與所述基因序列來(lái)源相同或者不同。本發(fā)明還公開(kāi)了一種載體，所述載體含有上述啟動(dòng)子或上述核酸構(gòu)建體，優(yōu)選的， 所述載體為上述啟動(dòng)子與PMD18-T或p8質(zhì)粒經(jīng)重組得到的重組載體。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種重組細(xì)胞，所述細(xì)胞含有上述啟動(dòng)子、上述核酸構(gòu)建體 或上述載體，優(yōu)選的，所述重組細(xì)胞為重組大腸桿菌細(xì)胞或重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了含有上述啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體、載體或重組細(xì)胞的植物愈傷 組織、植物外植體或植物，優(yōu)選的，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，再優(yōu)選的，所述植 物為稻屬或煙草屬，更優(yōu)選的，所述植物為水稻或煙草，進(jìn)一步優(yōu)選的，所述植物為水稻日 本晴(Oryza sativa L. ssp. japonicacv. Nipponbare)或煙草 NC89。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一組引物對(duì)，用于擴(kuò)增得到上述啟動(dòng)子，所述引物對(duì)的兩條引物分別含有IDID No :3所示的序列，優(yōu)選的，所述引物對(duì)的兩條引物
在5’端還分別連接有限制性酶切位點(diǎn)和/或保護(hù)堿基，更優(yōu)選的，所述引物對(duì)的兩條引物 分別具有Seq ID No 4和Seq ID No 5所示的序列。本發(fā)明還公開(kāi)了制備SEQ ID No 1所示啟動(dòng)子的方法，包括以水稻日本晴基因 組DNA為模板，使用一對(duì)擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，所述擴(kuò)增引物根據(jù)SEQ ID NO :1在水稻日本晴 gDNA中的序列分別針對(duì)首尾進(jìn)行設(shè)計(jì)，優(yōu)選是上述的引物對(duì)。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種調(diào)控植物中基因表達(dá)的方法，所述方法包括，將上述啟 動(dòng)子、核酸構(gòu)建體、載體或重組細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞。優(yōu)選導(dǎo)入植物愈傷組織。進(jìn)一步優(yōu)選的， 啟動(dòng)子或核酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞是利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物愈傷組織，所述植物優(yōu)選為單子 葉植物或雙子葉植物，所述植物再優(yōu)選為稻屬或煙草屬，所述植物更優(yōu)選為水稻或煙草，所 述植物進(jìn)一步優(yōu)選為水稻日本晴(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare)或煙草 NC89。本發(fā)明還公開(kāi)了一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在有效產(chǎn)生植物的條件下培養(yǎng)上 述的重組細(xì)胞或植物愈傷組織或植物外植體或植物。本發(fā)明還公開(kāi)了上述啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體、載體、重組細(xì)胞或植物愈傷組織或植物 外植體或植物在調(diào)控植物中目的基因表達(dá)或植物育種中的用途，優(yōu)選植物是單子葉植物或 雙子葉植物，再優(yōu)選的植物為稻屬或煙草屬，更優(yōu)選植物為水稻或煙草，進(jìn)一步優(yōu)選植物為 7jC稻日本晴(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare)或煙草 NC89。由于采用了以上技術(shù)方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于本發(fā)明提供的新的啟動(dòng)子能夠在植物中調(diào)控基因表達(dá)，并且，在單子葉植物如水 稻和雙子葉植物如模式植物-煙草的根和葉中均具有啟動(dòng)子功能，能夠調(diào)控外源基因的表 達(dá)，從而為研究植物(包括單子葉植物和雙子葉植物)中目的基因的表達(dá)提供了一種新的 工具和選擇。保藏信息培養(yǎng)物名稱煙草NC89種子保藏日期2010年11月12日保藏單位湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，即中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏 中心(CCTCC)保藏編號(hào)CCTCCNo :P201017


圖1為用于構(gòu)建p8質(zhì)粒的pCAMBIA-1301質(zhì)粒示意圖。圖2為p8質(zhì)粒示意圖。圖3為經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織的GUS染色結(jié)果。其中，由帶有本發(fā)明所述啟動(dòng)子 P549序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8+P549轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織(右)經(jīng)⑶S染色后呈現(xiàn)藍(lán)色； 不帶有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的重組根癌農(nóng)桿菌p8質(zhì)粒的水稻愈傷組織(對(duì)照，左)經(jīng)⑶S染 色后顏色未發(fā)生變化。圖4和圖5分別為經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻苗根和葉的GUS染色結(jié)果。經(jīng)含有啟動(dòng)子的 P8+P549重組載體的重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻苗的根(圖4右)和葉(圖5右)經(jīng) 染色后呈現(xiàn)藍(lán)色，經(jīng)不含有啟動(dòng)子的P8質(zhì)粒重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻苗的根(作為對(duì)照，圖4左)和葉(圖5左)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。圖6和圖7分別為經(jīng)轉(zhuǎn)化的煙草苗根和葉的GUS染色結(jié)果(三倍光學(xué)顯微鏡下拍 照)。經(jīng)含有啟動(dòng)子的P8+P549重組載體的重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的煙草苗的根(圖6 右)和葉(圖7右)經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍(lán)色，經(jīng)不含有啟動(dòng)子的p8質(zhì)粒重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn) 化的煙草苗的根(作為對(duì)照，圖6左)和葉(圖7左)經(jīng)GUS染色后顏色未發(fā)生變化。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及一種能夠在植物中調(diào)控基因表達(dá)的啟動(dòng)子序列，本發(fā)明的啟動(dòng)子含有 選自以下任意一組并具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列a、序列表中kq ID No. 1所示的核苷酸序列；以與kq ID No. 1互補(bǔ)的核苷酸序列；C、在高等嚴(yán)緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；d、對(duì)上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核 苷酸序列；e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的啟動(dòng)子優(yōu)選具有kq ID No. 1所示的 核苷酸序列，并在本發(fā)明中被稱為啟動(dòng)子BgIosPM9，或者簡(jiǎn)稱為P549啟動(dòng)子。在本發(fā)明中，典型地，“雜交條件”根據(jù)測(cè)量雜交時(shí)所用條件的“嚴(yán)緊性”程度來(lái)分 類。嚴(yán)緊性程度可以以例如核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)。例如，“最大嚴(yán) 緊性”典型地發(fā)生在約Tm-5°C (低于探針Tm 5°C )；“高等嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約5_10°C ； “中等嚴(yán)緊性”發(fā)生在探針Tm以下約10-20°C ；“低嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約20_25°C。作 為替代，或者進(jìn)一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強(qiáng)度條件和/或一或多次的嚴(yán)緊 性洗滌為依據(jù)。例如，6XSSC =極低嚴(yán)緊性；3XSSC =低至中等嚴(yán)緊性；IXSSC =中等嚴(yán) 緊性；0. 5XSSC =高等嚴(yán)緊性。從功能上說(shuō)，可以采用最大嚴(yán)緊性條件確定與雜交探針嚴(yán) 緊同一或近嚴(yán)緊同一的核酸序列；或采用高等嚴(yán)緊性條件確定與該探針有約80%或更多 序列同一性的核酸序列。對(duì)于要求高選擇性的應(yīng)用，典型地期望采用相對(duì)嚴(yán)緊的條件來(lái)形成雜交體，例如 選擇相對(duì)低的鹽和/或高溫條件。Sambrook等(Sambr00k，J.等(1989)分子克隆，實(shí)驗(yàn)室 手冊(cè)，Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.)提供了包括中等嚴(yán)緊性和高等嚴(yán)緊性 在內(nèi)的雜交條件。為了便于說(shuō)明，用于檢測(cè)本發(fā)明的雜交的合適的中等嚴(yán)緊條件包括用5XSSC、 0.5% SDS、1. OmM EDTA(pH8. 0)溶液預(yù)洗；在50-65°C下在5XSSC中雜交過(guò)夜；隨后用含 0. SDS的2X、0. 5X和0.2XSSC在65°C下各洗滌兩次20分鐘。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 理解，能容易地操作雜交嚴(yán)緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜交溫度。例如，合適的 高等嚴(yán)緊雜交條件包括上述條件，不同之處在于雜交溫度升高到例如60-65°C或65-70°C。在本發(fā)明中，所述在高等嚴(yán)緊條件下與^^ ID No. 1所示或與其互補(bǔ)的核苷酸序 列雜交的核苷酸序列，其具有與kq ID No. 1所示核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。在本發(fā)明中，所述對(duì)kq ID No. 1或與其互補(bǔ)的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基 的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時(shí)在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和/或序列內(nèi)部進(jìn)行例如不超過(guò)2-45個(gè)，或者不超過(guò)3-20個(gè)，或者不超過(guò)3-20個(gè)，或 者不超過(guò)4-15個(gè)，或者不超過(guò)5-10個(gè)，或者不超過(guò)6-8個(gè)的分別用逐個(gè)連續(xù)整數(shù)表示的堿 基的取代、缺失、添加修飾。在本發(fā)明中，所述對(duì)kq ID No. 1或與其互補(bǔ)的核苷酸序列進(jìn)行如上述一個(gè)或多 個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，具有與kq ID No. 1所示的核苷酸序列相同 或相似的啟動(dòng)子活性。通過(guò)一種多核苷酸進(jìn)行說(shuō)明，其所具有的核苷酸序列例如與kq ID No. 1的參考 核苷酸序列至少90% “同一性”是指在^^ ID No. 1的參考核苷酸序列之每100個(gè)核苷 酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達(dá)10個(gè)核苷酸的不同外，該多核苷酸之核苷酸 序列與參考序列相同。換句話說(shuō)，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少90%相同的 多核苷酸，參考序列中多達(dá)10%的核苷酸可以被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些核 苷酸插入?yún)⒖夹蛄兄?，其中插入的核苷酸可多達(dá)參考序列之總核苷酸的10% ；或在一些核 苷酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達(dá)參考序列之總核苷酸的10%。 參考序列的這些突變可發(fā)生在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在這些末端位置之 間的任意地方，它們或單獨(dú)散在于參考序列的核苷酸中，或以一個(gè)或多個(gè)相鄰的組存在于 參考序列中。在本發(fā)明中，用于確定序列同一性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法是例如BLAST和 BLAST2. 0 算法，它們分別描述在 Altschul 等(1977) Nucl. Acid. Res. 25 :3389-3402 和 Altschul等(1990)J.Mol.Bio. 215 :403-410。采用例如文獻(xiàn)中所述或默認(rèn)參數(shù)，BlAST和 BLAST 2.0可以用于確定本發(fā)明的核苷酸序列同一性百分?jǐn)?shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以 通過(guò)國(guó)立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得。在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一 性的核苷酸序列包括與SEQ ID NO :1所公開(kāi)序列基本同一的多核苷酸序列，例如當(dāng)采用本 文所述方法(例如采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析)時(shí)，與本發(fā)明多核苷酸序列相比含有至少 90%序列同一性、優(yōu)選至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的 序列同一性的那些序列。在本發(fā)明中，所述與SEQ ID No. 1或其互補(bǔ)的核苷酸序列具有至 少90%的序列同一性的核苷酸序列具有與kq ID No. 1所示的核苷酸序列相同或相似的啟 動(dòng)子活性。本發(fā)明還涉及一種核酸構(gòu)建體，包括基因以及與該基因可操作地連接的上述啟動(dòng) 子。在本發(fā)明中，“可操作地連接”是指兩個(gè)或多個(gè)核苷酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間 排列。在本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中，例如，啟動(dòng)子被置于所述基因的核酸序列的特定位置，例 如啟動(dòng)子位于所述基因核酸序列的上游位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動(dòng)子區(qū)域的引 導(dǎo)，從而，啟動(dòng)子區(qū)域被“可操作地連接”到該基因的核酸序列上。所述基因一般是需要提高 轉(zhuǎn)錄水平的任何核酸序列，或者，可設(shè)計(jì)本發(fā)明所述啟動(dòng)子和基因以便下調(diào)特定核酸序列。 也就是通過(guò)將啟動(dòng)子與反義方向的基因相連來(lái)實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所 述基因優(yōu)選為GUS基因。本發(fā)明還涉及一種含有上述啟動(dòng)子或上述核酸構(gòu)建體的載體。本發(fā)明的載體可 以是通過(guò)將上述啟動(dòng)子或上述核酸構(gòu)建體插入到克隆載體或表達(dá)載體而得到的重組載 體。適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組載體的克隆載體包括但不限于，例如pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T Simple Vecter、pMD19_T Simple Vecter 等。適于構(gòu) 建本發(fā)明所述重組載體的表達(dá)載體包括但不限于，例如pMI121、pl3W4、pGEM等。在本發(fā)明 具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明含有所述啟動(dòng)子的載體為上述啟動(dòng)子與PMD18-T或p8質(zhì)粒經(jīng)重 組得到的重組載體，優(yōu)選的，本發(fā)明的重組載體為PMD18-T+P549重組載體或者p8+P549重 組載體。本發(fā)明的又一方面，還涉及含有本發(fā)明所述啟動(dòng)子的重組細(xì)胞。本發(fā)明的重組 細(xì)胞可以通過(guò)將上述含有本發(fā)明啟動(dòng)子的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而得到。適于構(gòu)建本發(fā) 明所述重組細(xì)胞的宿主細(xì)胞包括但不限于，例如大腸桿菌細(xì)胞DH5ci，根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞 LBA4404、EHA105、GV3101等。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞為重組根癌 農(nóng)桿菌 EHA105-PM9。本發(fā)明的再一方面，還涉及一種植物愈傷組織或植物外植體或植物，所述愈傷組 織、植物外植體或植物含有有本發(fā)明的上述啟動(dòng)子。本發(fā)明的植物愈傷組織可以是單子葉 植物愈傷組織例如水稻愈傷組織，或者雙子葉植物愈傷組織例如煙草愈傷組織。本發(fā)明的再一方面，還涉及用于PCR擴(kuò)增得到本發(fā)明所述啟動(dòng)子的一組引物對(duì)， 該組引物對(duì)含有序列表中kq ID似.2及％(1 No.3所示的序列。為了便于操作，通常優(yōu)選 在引物的5’端含設(shè)計(jì)連接有限制性酶切位點(diǎn)和/或保護(hù)堿基，在本發(fā)明具體的實(shí)施方式 中，所述引物對(duì)的兩條引物分別具有^^ IDID No :5所示的序列。，^,/KfSH^Hf (Oryza sativaL. ssp. japonica cv. Nipponbare) S 因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能夠制備得到本發(fā)明的啟動(dòng)子。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種調(diào)控植物中基因表達(dá)的方法，所述方法包括，將上述啟 動(dòng)子導(dǎo)入植物細(xì)胞。優(yōu)選的是通過(guò)將同時(shí)含有外源基因以及本發(fā)明啟動(dòng)子的核酸構(gòu)建體導(dǎo) 入植物細(xì)胞來(lái)達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的。所述核酸構(gòu)建體中，外源基因與本發(fā)明的啟動(dòng)子 可操作地連接。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以利用含有目的外源基因與本發(fā)明啟動(dòng)子 的重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，再將得到的重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物愈傷組織，從而實(shí)現(xiàn)將所述外源 基因與本發(fā)明啟動(dòng)子一起導(dǎo)入植物細(xì)胞的目的。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方式中，外源基 因優(yōu)選為GUS基因。本發(fā)明的植物可以是單子葉植物，例如水稻、小麥、玉米、小米、甘蔗、高 粱、大麥等，也可以是雙子葉植物，例如煙草，大豆，馬鈴薯、蠶豆、蘿卜、花生等。煙草是典型的基因工程模式植物。故本發(fā)明選擇煙草進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究，以研究本 發(fā)明的啟動(dòng)子在雙子葉植物中的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該啟動(dòng)子能在轉(zhuǎn)基因煙草中起作用。在本發(fā)明中，可采用植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將目的基因及所述啟動(dòng)子插入到植物基因 組中，包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉(zhuǎn)化和電穿孔等。 本領(lǐng)域周知，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化常被用于單子葉植物和雙子葉植物的基因轉(zhuǎn)化，但其 它轉(zhuǎn)化技術(shù)也可用于本發(fā)明啟動(dòng)子及外源基因的導(dǎo)入。當(dāng)然，適于本發(fā)明的啟動(dòng)子及外源 基因?qū)氲牧硪环N方法是粒子轟擊(顯微金或鎢粒子包覆轉(zhuǎn)化的DNA)胚性愈傷組織或胚 胎開(kāi)發(fā)。另外，還可以采用的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化?；蜣D(zhuǎn)化后，采用通用 的方法來(lái)篩選和再生整合有表達(dá)單元的植株。為實(shí)現(xiàn)上述調(diào)控基因表達(dá)的目的，本發(fā)明所述啟動(dòng)子可以以單拷貝和/或多拷貝 的形式應(yīng)用，可以與現(xiàn)有技術(shù)中已知的啟動(dòng)子聯(lián)用。本發(fā)明的啟動(dòng)子以及調(diào)控植物中基因表達(dá)的方法，可以應(yīng)用于植物品種的選育。比如，可以用于水稻或煙草的育種。所述水稻可以為日本晴、中花9、中花10、中花11、臺(tái)北 309、丹江8號(hào)、云稻2號(hào)、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22、黔優(yōu)88、II優(yōu)416、II優(yōu)107、II優(yōu) 128,11優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)1號(hào)、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、 皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、 皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101等。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述水 稻為日本晴。所述的煙草可以為K326、K346、K394、NC82、NC89、G140、G28、G80、中煙90、 Cokerl76，以及CV87等。在本發(fā)明另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述煙草為煙草NC89。本發(fā)明的啟動(dòng)子可成為一種新的啟動(dòng)子，作為植物(包括單子葉植物和雙子葉植 物，尤其是水稻和煙草)轉(zhuǎn)基因的工具啟動(dòng)子，為開(kāi)展低表達(dá)基因轉(zhuǎn)化苗篩選、植物花器官 敗育等分子育種研究提供便利，從而極大地縮短優(yōu)良品種的選育時(shí)間。本發(fā)明的啟動(dòng)子可 廣泛用于培育水稻、煙草、小麥、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麥、大豆，馬鈴薯、蠶豆、蘿卜、花 生等。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“單子葉植物”，具體地，可以為禾本科植物，更具體地，可以為稻 屬植物例如水稻，包括但不限于日本晴、中花9、中花10、中花11、臺(tái)北309、丹江8號(hào)、云稻2 號(hào)、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22、黔優(yōu)88、II優(yōu)416、II優(yōu)107、II優(yōu)128、II優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu) 527、川農(nóng)1號(hào)、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖 稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻 207，以及津原101等。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“雙子葉植物”，具體地，可以為茄科植物，更具體地，可以為煙草 屬植物(煙草)，包括但不限于煙草 1(326、1(；346、1(394、^82、^89、6140、628、680、中煙 90、 Cokerl76,以及 CV87 等。下面通過(guò)具體實(shí)施方式
結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員 將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明 具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等 著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1 :P549啟動(dòng)子片段的PCR擴(kuò)增和pMD18_T+P549重組載體的構(gòu)建PCR擴(kuò)增使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目錄 號(hào)DP320-02)提取水稻日本晴(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare)(已在申 請(qǐng)?zhí)枮?00910238992. 0、發(fā)明名稱為“一種啟動(dòng)子BgIosP587、其制備方法及用途”的發(fā)明 申請(qǐng)中保藏，并于2010年9月22日公開(kāi)，保藏編號(hào)為CCTCC NO :P200910)的基因組DNA，根 據(jù)該啟動(dòng)子在水稻日本晴gDNA中的序列，分別在首尾設(shè)計(jì)一對(duì)PCR特異性擴(kuò)增引物(上游 引物F1，加限制性酶切位點(diǎn)EcoRl和保護(hù)堿基，下游引物P1，加限制性酶切位點(diǎn)SbfI和保 護(hù)堿基)。以上述提取的水稻日本晴的gDNA為模板，使用高保真Ex Taq(TaKaRa,DRR100B) 聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如表1所示。表1基因啟動(dòng)子擴(kuò)增的PCR體系
權(quán)利要求
1.一種啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子含有選自以下任意一組并具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列a>Seq ID No. 1所示的核苷酸序列；以與kq ID No. 1互補(bǔ)的核苷酸序列；C、在高等嚴(yán)緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；d、對(duì)上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸 序列；e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。
2.—種核酸構(gòu)建體，包含權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，與啟動(dòng)子可操作連接的基因序列， 其中所述啟動(dòng)子與所述基因序列來(lái)源相同或者不同。
3.一種載體，其特征在于所述載體含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或權(quán)利要求2所述 的核酸構(gòu)建體，優(yōu)選的，所述載體為權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或權(quán)利要求2所述的核酸構(gòu)建 體與pMD18-T或p8質(zhì)粒經(jīng)重組得到的重組載體。
4.一種重組細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或權(quán)利要求2 所述的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求3所述的載體，優(yōu)選的，所述重組細(xì)胞為重組大腸桿菌細(xì)胞 或重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。
5.一種含有權(quán)利要求1的啟動(dòng)子或權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求3的載體或權(quán) 利要求4的重組細(xì)胞的植物愈傷組織或植物外植體或植物，優(yōu)選的，所述植物為單子葉植 物或雙子葉植物，再優(yōu)選的，所述植物為稻屬或煙草屬，更優(yōu)選的，所述植物為水稻或煙草， 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述植物為水稻日本晴或煙草NC89。
6.一組引物對(duì)，所述引物對(duì)用于擴(kuò)增得到權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，其特征在于所述 引物對(duì)的兩條引物分別含有kq IDID No :3所示的序列，優(yōu)選的，所述引物對(duì) 的兩條引物在5’端還分別連接有限制性酶切位點(diǎn)和/或保護(hù)堿基，更優(yōu)選的，所述引物對(duì) 的兩條引物分別具有kq ID No ID No :5所示的序列。
7.制備SEQID NO :1所示的啟動(dòng)子的方法，包括以水稻日本晴基因組DNA為模板，使用一對(duì)擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，所述擴(kuò)增引物根據(jù)SEQ ID NO :1在水稻日本晴gDNA中的序列分別針對(duì)首尾進(jìn)行設(shè)計(jì)，優(yōu)選是權(quán)利要求6所述的引 物對(duì)。
8.—種調(diào)控植物中基因表達(dá)的方法，所述方法包括，將權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或權(quán) 利要求2的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求3的載體或權(quán)利要求4的重組細(xì)胞導(dǎo)入植物，優(yōu)選導(dǎo)入 植物愈傷組織，優(yōu)選的，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，再優(yōu)選的，所述植物為稻屬或煙草屬，更優(yōu)選的，所述植物為水稻或煙草，進(jìn)一步優(yōu)選的，所述植物為水稻日本晴或煙草NC89。
9.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在有效產(chǎn)生植物的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求4的重組 細(xì)胞或權(quán)利要求5的植物愈傷組織或植物外植體或植物。
10.權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體或者權(quán)利要求3的載體或權(quán) 利要求4的重組細(xì)胞或權(quán)利要求5的植物愈傷組織或植物外植體或植物在調(diào)控植物中目的 基因表達(dá)或植物育種中的用途，植物優(yōu)選是單子葉植物或雙子葉植物，再優(yōu)選為稻屬或煙草屬，更優(yōu)選為水稻或煙草，更進(jìn)一步優(yōu)選為水稻日本晴或煙草NC89。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種啟動(dòng)子BgIosP549、制備方法及應(yīng)用。所述啟動(dòng)子含有選自以下任意一組并具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列a、Seq ID No.1所示的核苷酸序列；b、與Seq ID No.1互補(bǔ)的核苷酸序列；c、在高等嚴(yán)緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；d、對(duì)上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列；e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。本發(fā)明啟動(dòng)子能夠在單子葉和雙子葉植物中調(diào)控基因表達(dá)，從而為研究植物中目的基因的表達(dá)提供了一種新的工具和選擇。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102146397SQ20101061604
公開(kāi)日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者倪雪梅, 張印新, 李寧, 楊爽 申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司