專利名稱：一種鑒別結(jié)核分枝桿菌的多重pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微生物分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于快速鑒別診斷結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌以及卡介苗的多重PCR檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
20世紀(jì)90年代以來，以聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)為代表的分子生物學(xué)診斷技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了的飛速發(fā)展。直到1989年研究者首次將這一技術(shù)引入到結(jié)核病的診斷以來，立即成為結(jié)核病診斷領(lǐng)域中備受關(guān)注的焦點(diǎn)。經(jīng)過多年的科學(xué)研究和臨床檢驗(yàn)，使這一技術(shù)日趨完善，其反應(yīng)靈敏、快速、特異的特點(diǎn)在多數(shù)報(bào)告中得到驗(yàn)證。近年來，結(jié)核病的流行出現(xiàn)了新情況，也對(duì)結(jié)核病的診斷工作提出了新要求。非結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌感染呈上升趨勢(shì)，感染結(jié)核病的診斷和治療，日益引起人們的關(guān)注。由于結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌的致病性和藥物敏感性不盡相同，在臨床治療前進(jìn)行病原菌的鑒別診斷顯得尤為重要。目前普遍采用的方法是依靠生化手段進(jìn)行型別鑒定，該方法存在耗時(shí)長、操作復(fù)雜、主觀性強(qiáng)等缺點(diǎn)。而以基因分型鑒定為基礎(chǔ)的單重PCR需要多次反應(yīng)才能完成分型鑒定全過程，不僅耗時(shí)耗力，同時(shí)也增加了不確定性。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群多重PCR技術(shù)是在同一 PCR反應(yīng)體系中，設(shè)計(jì)多對(duì)特異性引物，針對(duì)不同特異性靶區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)觀察各特異性擴(kuò)增片段，用于結(jié)核分支桿菌檢測(cè)和菌種鑒定。國內(nèi)外的很多學(xué)者也做了很多相關(guān)工作，并取得一定成績。國內(nèi) 2000年Ikon. JA,張宏圖等首先建立了一種多重PCR方法能夠特異性檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，鳥型結(jié)核復(fù)合體以及蔓生長分枝桿菌(Ikon. JA et al，2000)。隨后2001年蘇明權(quán)譚慶榮等建立了一種能夠特異性檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌和其他微生物的多重PCR方法(蘇明權(quán)等，2000)。2005年王洪生李曉杰等利用特異性引物對(duì)結(jié)核分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌菌懸液DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，能特異性地區(qū)分這四種菌， 但是其靈敏度不夠(王洪生等，200 。2007年孟祥紅匡鐵吉等利用多重PCR方法，設(shè)計(jì)三對(duì)特異性引物能檢測(cè)出分枝桿菌，并能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，但是該方法不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌(孟祥紅，2007)。Gopinath等擴(kuò)增hsp65、Rv3875、 16S rRNA三個(gè)基因，可用于鑒別結(jié)核分枝桿菌以及禽分枝桿菌(Gopinath，2008) ；Eduardo Eustaquio等擴(kuò)增Rv2031c和IS6110兩個(gè)基因，可用于鑒別結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌 (Eduardo Eustaquio et al，2009)。但目前還沒有報(bào)道可同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌和卡介苗4個(gè)菌種的多重PCR方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有結(jié)核病診斷技術(shù)檢測(cè)速度慢、效率低、生物安全要求高等缺陷，提供一種簡便、快速、靈敏度高、特異性好的病原快速診斷方法。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于能夠通過一次PCR同時(shí)完成對(duì)結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非結(jié)核分支桿菌以及卡介苗的鑒別診斷試劑盒。本發(fā)明以臨床常見的4種分枝桿菌菌種(結(jié)核分枝桿菌，非結(jié)核分枝桿菌，牛分枝桿菌以及卡介苗)為研究對(duì)象，篩選出4個(gè)差異性基因序列16S rRNA、IS6110、RW652和 Rv3873,并設(shè)計(jì)特異性引物，建立了一種多重PCR方法，通過在同一 PCR擴(kuò)增體系中同時(shí)鑒別檢測(cè)四類細(xì)菌，用于結(jié)核桿菌的快速診斷和分型。實(shí)驗(yàn)室和臨床樣本驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該方法可快速、準(zhǔn)確地對(duì)結(jié)核分枝桿菌群成員進(jìn)行檢測(cè)與分型。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述。一種同時(shí)鑒別結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌和卡介苗的多重PCR 試劑盒，它包含下列試劑組合物擴(kuò)增16S rRNA基因片段的引物對(duì)引物 1 5，ATCGACGAAGGTCCGGGTTCTCTC3，，引物 2 5，CCGGCTTTTAAGGATTCGCTTAAC3，；(2)擴(kuò)增IS6110基因片段的引物對(duì)引物 3 5，CGTCTCGGCTAGTGCATTGTCATAG3，，引物 4 :5，TACTACGACCACATCAACCGGGAG3，；(3)擴(kuò)增RW652基因片段的引物對(duì)引物 5 5，CGAGCACCAAAACGTCCCTC3，，引物 6 5，GACCCGAAACCCGGAAAGAG3，；(4)擴(kuò)增Rv3873基因片段的引物對(duì)引物 7 5，TCGCGTTGACCGAGATGGATTAT3，，引物 8 :5，CGCTCATCTCACCCAGTTGGC3，；(5) 10 X酶切緩沖液；(6) Taq 酶；(7) d NTP ；(8)甜菜堿；和(9)小牛血清白蛋白；在一個(gè)反應(yīng)總體積為20 μ L的PCR反應(yīng)體系中的用量引物 1(10 μ Μ):1. 5μ L ；引物 2 (10 μ Μ) 1. 5μ L ；引物 3 (10 μ Μ) 0. 5μ L ；引物 4 (10 μ Μ) 0. 5μ L ；引物 5 (10 μ Μ) l.OyL;引物 6 (10 μ Μ) l.OyL;引物 7 (10 μ Μ) 0. 7μ L ；引物 8 (10 μ Μ) 0. 7μ L ；IOX酶切緩沖液2yL;Taq 酶(5U/ μ L)0. 6 μ L ；d NTP(IOmM)1 μ L ；甜菜堿(0.5Μ)4. 5 μ L ；
小牛血清白蛋白(IOmM)2μ L ；模板 DNA2 μ L ；PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序預(yù)變性:95°C 5分鐘；變性:95°C 45秒；復(fù)性:56°C 50秒；延伸:72°C 2分鐘；循環(huán)次數(shù)30次；延伸:72°C 10分鐘。本發(fā)明根據(jù)已經(jīng)公布的分支桿菌屬主要致病菌的基因序列信息(見實(shí)施例所述)，篩選出四個(gè)差異性基因，即，16S rRNA, IS6110，RW652，Rv3873，通過生物信息學(xué)分析， 選定這四個(gè)基因序列的靶區(qū)段，進(jìn)一步設(shè)計(jì)4對(duì)特異性寡聚核苷酸引物。然后以上述四種標(biāo)準(zhǔn)菌株為PCR反應(yīng)模板，探索合適的PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件，建立完善的多重PCR方法；再用模擬樣本和臨床痰液樣本來驗(yàn)證該方法的靈敏度、特異性和重復(fù)性等指標(biāo)。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明操作簡便、快捷，只需要數(shù)小時(shí)就能完成對(duì)結(jié)核分枝桿菌，非結(jié)核分枝桿菌，牛分枝桿菌以及卡介苗的鑒別檢測(cè)。( 本發(fā)明能夠準(zhǔn)確擴(kuò)增到50個(gè)CFU/模板，靈敏性和特異性遠(yuǎn)高于抗酸染色和分菌培養(yǎng)等傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌診斷方法。


序列表SEQ ID NO 1_4是多重PCR擴(kuò)增的4個(gè)基因片段S卩16S rRNA、IS6110、 Rv2652和Rv3873的部分核苷酸序列。序列表SEQ ID NO :5_12是本發(fā)明設(shè)計(jì)的擴(kuò)增上述四個(gè)基因片段的的四對(duì)寡聚核苷酸引物(共8條引物)。圖1 多重PCR檢測(cè)牛分枝桿菌(Ebovis)的敏感性試驗(yàn)。圖中所示牛分枝桿菌顯示3條帶，各泳道模板中含菌量分別為(個(gè)菌)1 :104;2:5X103;3:103 ；4 500 ；5 200 ； 6 100 ；7 50 ；8 25 ；9 13 ；10 6 ；11 3 ；12 2 ；13 1 ；14 :1/2 ； ... 17 空白對(duì)照。圖2 多重PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌(H37RV)的敏感性試驗(yàn)。圖中所示各泳道模板中含菌量分別為(個(gè)菌):1:104 ；2 :5X103 ；3 103 ；4 :500 ；5 :200 ；6 :100 ；7 50 ；8 25 ；9 13 ； 10 6 ；11 3 ；12 2 ；13 1 ；14 1/2 ； ... 17 空白對(duì)照。圖3 是16S rRNA、IS6110、RM652和Rv3873四個(gè)基因片段的核苷酸序列，下劃線部分為引物序列。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合說明書附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步說明。實(shí)施例11、引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank已經(jīng)公布的分支桿菌屬主要致病菌的基因序列信息，篩選出四個(gè)差異性基因16S rRNA(登錄號(hào)HM803175)，IS61109 (登錄號(hào)DQ217928)，RW652(登錄號(hào) AD000019. 1)，Rv3873 (登錄號(hào)DQ2^941)，并根據(jù)這四個(gè)基因片段序列設(shè)計(jì)4對(duì)特異性的寡聚核苷酸引物。所述的引物對(duì)的核苷酸序列分別如下所述擴(kuò)增16S rRNA基因片段
引物 1 :5，ATCGACGAAGGTCCGGGTTCTCTC3，(對(duì)應(yīng) SEQ ID NO 5 所示的序列)引物 2 :5，CCGGCTTTTAAGGATTCGCTTAAC3，(對(duì)應(yīng) SEQID NO 6 所示的序列)擴(kuò)增IS6110基因片段引物 3 :5，CGTCTCGGCTAGTGCATTGTCATAG3，(對(duì)應(yīng) SEQ ID NO 7 所示的序列)引物 4 :5，TACTACGACCACATCAACCGGGAG3，(對(duì)應(yīng) SEQ ID NO 8 所示的序列)擴(kuò)增RW652基因片段引物 5 :5，CGAGCACCAAAACGTCCCTC3，(對(duì)應(yīng) SEQ ID NO 9 所示的序列)引物 6 :5，GACCCGAAACCCGGAAAGAG3，(對(duì)應(yīng) SEQ ID NO 10 所示的序列)擴(kuò)增Rv3873基因片段引物 7 :5，TCGCGTTGACCGAGATGGATTAT3，(對(duì)應(yīng) SEQ ID NO 11 所示的序列)引物 8 :5，CGCTCATCTCACCCAGTTGGC3，(對(duì)應(yīng) SEQ ID NO 12 所示的序列)2、多重PCR反應(yīng)(1)多重PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)是在PE-9600擴(kuò)增儀中進(jìn)行的。體系中的試劑組合物如下模板DNA、寡聚核苷酸引物對(duì)、Taq酶、dNTP、小牛血清白蛋白(BSA)、甜菜堿和10XBuffer (緩沖液)。其中，Taq酶、10XBuffer購自！^ermentas公司。本實(shí)施例的PCR反應(yīng)體系中各成分的濃度如表1表1 PCR反應(yīng)試劑組合物
權(quán)利要求
1. 一種同時(shí)鑒別結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌和卡介苗的多重PCR試劑盒，其特征在于，它包含下列試劑組合物(1)擴(kuò)增16SrRNA基因片段的引物對(duì) 引物 1 :5，ATCGACGAAGGTCCGGGTTCTCTC3，， 引物 2 :5，CCGGCTTTTAAGGATTCGCTTAAC3，；(2)擴(kuò)增IS6110基因片段的引物對(duì) 引物 3 :5’ CGTCTCGGCTAGTGCATTGTCATAG3，， 弓丨物 4 :5， TACTACGACCACATCAACCGGGAG3，；(3)擴(kuò)增RW652基因片段的引物對(duì) 引物 5 :5，CGAGCACCAAAACGTCCCTC3，， 引物 6 :5，GACCCGAAACCCGGAAAGAG3，；(4)擴(kuò)增Rv3873基因片段的引物對(duì) 引物 7 :5’ TCGCGTTGACCGAGATGGATTAT3，， 引物 8 :5’ CGCTCATCTCACCCAGTTGGC3，；(5)IOX酶切緩沖液；(6)Taq 酶;(7)d NTP ；(8)甜菜堿；和(9)小牛血清白蛋白；在一個(gè)反應(yīng)總體積為20 μ L的PCR反應(yīng)體系中的用量引物 1(10μΜ) 1. 5μ L ；弓丨物 2(10 μ Μ) 1. 5μ L ；弓丨物 3(10 μ Μ) 0. 5μ L ；弓丨物 4(10 μ Μ) 0. 5μ L ；弓丨物 5(10 μ Μ) l.OyL；弓丨物 6(10 μ Μ) l.OyL；引物 7(10 μ Μ) 0. 7μ L ；弓丨物 8(10 μ Μ) 0. 7μ L ；IOX酶切緩沖液2yL;Taq 酶(5U/ μ L)0. 6 μ L ；d NTP(IOmM)1 μ L ；甜菜堿(0. 5Μ)4. 5 μ L ；小牛血清白蛋白(IOmM)2yL；模板 DNA2 μ L ；PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序預(yù)變性V 95 0C 5分鐘；變性95°C 45秒；復(fù)性56°C 50秒；延伸72°C 2分鐘；循環(huán)次數(shù)30次；延伸:72°C 10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，與微生物分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域有關(guān)，本發(fā)明具體涉及一種能夠?qū)Y(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌以及卡介苗同時(shí)進(jìn)行快速鑒別診斷的多重PCR試劑盒。公開了針對(duì)上述分枝桿菌4個(gè)差異基因16S rRNA、IS6110、Rv2652、Rv3873特異性片段設(shè)計(jì)的4個(gè)引物對(duì)序列及多重PCR的擴(kuò)增條件。本發(fā)明能夠從結(jié)核病人的痰液樣本中快速準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出結(jié)核分支桿菌復(fù)合群序列，并能進(jìn)行種類鑒定。靈敏度為50個(gè)CFU/模板，遠(yuǎn)高于抗酸染色法，并大大簡化了結(jié)核分枝桿菌的查驗(yàn)程序，加快了檢測(cè)速度，同時(shí)還可經(jīng)一次PCR鑒定多種分枝桿菌菌種，為結(jié)核病的臨床快速診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)手段。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102533959SQ201010615959
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者晁金, 涂玲玲, 程實(shí), 胡長敏, 郭愛珍, 陳偉, 陳煥春, 陳穎鈺 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)