專利名稱：轉(zhuǎn)Xa21基因水稻或其制品檢測(cè)用引物和探針、試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及用于轉(zhuǎn)Xa21基因水稻或其制品 檢測(cè)的寡核苷酸引物及探針和試劑盒，用于測(cè)定轉(zhuǎn)Xa21基因水稻或其制品的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法，以及本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物和探針或試劑盒在檢測(cè)轉(zhuǎn)Xa21基因水稻或 其制品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因生物是指利用生物技術(shù)，將外源基因轉(zhuǎn)移到他物種中以改造其遺傳特性， 從而獲得人類所需的性狀、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)而產(chǎn)生的生物新品種。以轉(zhuǎn)基因生物或以其為原料加 工而來(lái)的食品就是轉(zhuǎn)基因食品。從1994年第一例轉(zhuǎn)基因食品(轉(zhuǎn)基因番茄)在美國(guó)誕生 至今，轉(zhuǎn)基因生物已廣泛用于食品領(lǐng)域。轉(zhuǎn)基因生物的發(fā)展?fàn)顩r國(guó)際國(guó)內(nèi)轉(zhuǎn)基因生物的研發(fā)、生產(chǎn)蓬勃發(fā)展，通過(guò)基因工程方式培育農(nóng)作物新品 種是目前作物育種的發(fā)展方向，在提高作物產(chǎn)量、改善品質(zhì)、提高抗性等方面具有巨大潛 力。水稻(Oryza sativa L.)是我國(guó)最大的糧食作物，常年播種面積約為3100萬(wàn)公頃，總 收獲量在2億噸左右，約占我國(guó)糧食總產(chǎn)量的40%。水稻生產(chǎn)在我國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有舉 足輕重的地位。1991年，Christou等用基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)基因水稻植株，隨后幾年， 基因槍技術(shù)日臻成熟，將各類目的基因?qū)胨精@得轉(zhuǎn)基因植株的報(bào)道大量出現(xiàn)。Xa21基因分離自非洲馬里的長(zhǎng)花藥野生稻(Oryzae longistaminata)，是對(duì)白葉 枯病抗譜最廣的顯性抗性基因，編碼一個(gè)受體蛋白激酶，在抗病過(guò)程中負(fù)責(zé)信號(hào)識(shí)別。中國(guó) 農(nóng)科院生物技術(shù)研究所、安徽農(nóng)科院水稻所的賈士榮、倪大虎、汪秀峰等將Xa21基因轉(zhuǎn)入 水稻不育系皖21A中，采用基因槍雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化法，質(zhì)粒PC822含Xa21基因結(jié)構(gòu)，Xa21基 因結(jié)構(gòu)全長(zhǎng)9. 6kb，包括啟動(dòng)子、終止子、內(nèi)含子、編碼區(qū)，啟動(dòng)子、終止子來(lái)自于水稻本身的 天然序列。質(zhì)粒PHX4含35S啟動(dòng)子、潮霉素基因hph、N0S終止子，通過(guò)二代分離，35S啟動(dòng) 子、潮霉素基因hph已去除，但共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的NOS終止子仍保留于轉(zhuǎn)基因水稻中。經(jīng)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)，轉(zhuǎn)Xa21基因水稻品系已進(jìn)行了中間試驗(yàn)、環(huán)境釋放，預(yù)計(jì)在較短 時(shí)間內(nèi)可在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上獲得應(yīng)用。轉(zhuǎn)基因食品的管理要求隨著轉(zhuǎn)基因食品的廣泛應(yīng)用，作為一種新技術(shù)產(chǎn)品，其對(duì)人體健康、生態(tài)平衡是否 具有危害還未確定。它潛在的安全性如轉(zhuǎn)基因食品的過(guò)敏原、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)等越來(lái)越受到消費(fèi) 者的關(guān)注。世界上主要國(guó)家立法對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行管理，美國(guó)、加拿大、歐盟、日本、韓國(guó)、澳 大利亞、新西蘭的法律明確規(guī)定，轉(zhuǎn)基因品種需經(jīng)政府批準(zhǔn)，并經(jīng)嚴(yán)格的生物安全、環(huán)境安 全測(cè)試才可以田間種植、環(huán)境釋放及作為食品、飼料，歐盟、日本、韓國(guó)、澳大利亞、新西蘭等 要求轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)識(shí)，并規(guī)定了相應(yīng)閾值水平。我國(guó)于2001年5月23日頒布《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，規(guī)定對(duì)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物實(shí)行檢驗(yàn)檢疫。2002年3月20日開(kāi)始實(shí) 行的《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》也規(guī)定了轉(zhuǎn)基因食品的標(biāo)識(shí)制度。對(duì)于執(zhí)行上述各 國(guó)的法規(guī)措施，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)是關(guān)鍵措施之一，需要通過(guò)定性檢測(cè)確定轉(zhuǎn)基因的種類， 鑒別其是否為已批準(zhǔn)的或已獲準(zhǔn)用于食品飼料，以防止具有風(fēng)險(xiǎn)的未知轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的任意 擴(kuò)散，對(duì)社會(huì)產(chǎn)生危害；還需要通過(guò)定量檢測(cè)確定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的含量，明確是否已達(dá)到所在 國(guó)家規(guī)定的閾值水平，因?yàn)槊總€(gè)國(guó)家轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)的閾值水平都不相同。轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)方法轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)大致可分為兩類，一類是核酸檢測(cè)，當(dāng)外源基因插入到受體細(xì) 胞染色體時(shí)，一般要構(gòu)建啟動(dòng)子、終止子、選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因，如花椰菜花葉病毒 (CaMV) 35s啟動(dòng)子，胭脂堿合酶NOS終止子等，轉(zhuǎn)基因食品核酸檢測(cè)的靶標(biāo)是插入的外源基 因，包括外源基因的整合位點(diǎn)、啟動(dòng)子、終止子、選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因的核酸序列，目前 的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)中有超過(guò)400對(duì)PCR檢測(cè)引物和以及40多種內(nèi)源參照基因。另 一類是蛋白檢測(cè)，即通過(guò)插入外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物或其功能進(jìn)行檢測(cè)，已有大約20 種轉(zhuǎn)基因蛋白檢測(cè)方法在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)領(lǐng)域中投入了使用。核酸檢測(cè)主要應(yīng)用PCR方法和基因芯片技術(shù)。PCR方法具有很高的靈敏度，在轉(zhuǎn)基 因領(lǐng)域使用最為廣泛。與蛋白質(zhì)具有組織特異性相比，PCR技術(shù)不受到材料的限制。另外， 核酸比蛋白質(zhì)穩(wěn)定，變性之后容易復(fù)性，在加工食品中仍可檢出。PCR方法的關(guān)鍵是引物設(shè) 計(jì)，引物一般長(zhǎng)為17_30nt，嚴(yán)格限制上下游引物的配對(duì)和引物自身配對(duì)。轉(zhuǎn)基因的標(biāo)識(shí)需求和一些法規(guī)對(duì)轉(zhuǎn)基因成分含量的限制，要求對(duì)食品中轉(zhuǎn)基因成 分進(jìn)行定量檢測(cè)。目前，國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)報(bào)道能快速、簡(jiǎn)單、特異且靈敏地檢測(cè)轉(zhuǎn)Xa21基因水稻或其制 品的方法。因此，本領(lǐng)域需要一種快速、特異性好、靈敏度高的轉(zhuǎn)Xa21基因水稻或其制品檢 測(cè)方法，進(jìn)行轉(zhuǎn)Xa21基因水稻或其制品的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供用于快速檢測(cè)轉(zhuǎn)Xa21基因水稻或其制品的特異性 寡核苷酸引物及探針。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供快速測(cè)定轉(zhuǎn)Xa21基因的水稻或其制品的實(shí)時(shí)熒 光PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于，提供用于快速檢測(cè)轉(zhuǎn)Xa21基因水稻或其制品的試劑
品.ο本發(fā)明的再一個(gè)目的在于，提供本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物和探針或試劑盒在 檢測(cè)轉(zhuǎn)Xa21基因的水稻或其制品中的應(yīng)用。針對(duì)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供用于實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)Xa21基因 水稻品系M12的特異性寡核苷酸引物對(duì)及探針。本發(fā)明的寡核苷酸引物/探針是根據(jù)水稻 線粒體基因與外源的Xa21基因的接合區(qū)序列設(shè)計(jì)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述引物對(duì)由 上游引物和下游引物組成，所述上游引物為M12-F :GAGAACAAGAAGCCCCTTCTGTCTCG (SEQ IDNo. 1)，所述下游引物為 M 12-R :AAGGTACTAAAGCTTGAAAATCCTAAGGC(SEQ ID No. 2)；所述探 針為 M12-P CACATTCGGCAGTGAAACTCTTGAGCGCC(SEQ ID No. 3)，在探針的 3，端連接有一個(gè) 熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)FAM。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述引物對(duì) 由上游引物和下游引物組成，所述上游引物為Xa21-F :GGACTCTAGAGCTACCACACACTCAA (SEQ ID No. 4)，所述下游引物為 Xa21-R :CTCCTCCATCAGTTCATGTAGAAG(SEQ ID No. 5)；所述探針 為 XA21-P :ATTGCAGTGTAGAGCAGAAAACACCCA(SEQ ID No. 6)，在探針的 3，端連接有一個(gè)熒光 淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)FAM。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)Xa21基因水稻或其制品的實(shí)時(shí)熒 光PCR檢測(cè)方法，所述方法包括使用針對(duì)Xa21基因序列的特異性寡核苷酸引物對(duì)和探針。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)Xa21基因水稻或其制品的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法 包括如下步驟(a)從待測(cè)產(chǎn)品中提取DNA樣品；(b)提供核酸擴(kuò)增反應(yīng)的條件；(c)使用本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物對(duì)及探針通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行核酸 擴(kuò)增反應(yīng)和檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所使用的本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物對(duì)及探 針包含以下一組或兩組特異性寡核苷酸引物對(duì)和探針(1)堿基序列為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2的寡核苷酸引物對(duì)以及堿基序列為 SEQ ID No. 3的探針，在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光 報(bào)告基團(tuán)FAM ；和/或(2)堿基序列為SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5的寡核苷酸引物對(duì)以及堿基序列為 SEQ ID No. 6的探針，在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光 報(bào)告基團(tuán)FAM。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)Xa21基因水稻或其制品實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法包 括樣品轉(zhuǎn)化事件特異性的檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括DNA提取步驟和通過(guò)檢 測(cè)水稻線粒體與外源Xa21基因接合區(qū)序列來(lái)測(cè)試樣品轉(zhuǎn)化事件特異性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中，所述檢測(cè)轉(zhuǎn)化事件特異性的引物對(duì)及探針序列選自(1)堿基序列為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2的寡核苷酸引物對(duì)以及堿基序列為 SEQ ID No. 3的探針，在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光 報(bào)告基團(tuán)FAM ；和(2)堿基序列為SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5的寡核苷酸引物對(duì)以及堿基序列為 SEQ ID No. 6的探針，在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光 報(bào)告基團(tuán)FAM。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供用于檢測(cè)轉(zhuǎn)Xa21基因水稻或其制品 的試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物對(duì)以及探針。在本發(fā)明的試劑盒 的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑盒包含以下一組或兩組特異性寡核苷酸引物對(duì)和探針(1)堿基序列為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2的寡核苷酸引物對(duì)以及堿基序列為 SEQ ID No. 3的探針，在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光 報(bào)告基團(tuán)FAM ；和/或
(2)堿基序列為SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5的寡核苷酸引物對(duì)以及堿基序列為 SEQ ID No. 6的探針，在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光 報(bào)告基團(tuán)FAM。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括用于樣品DNA提取的試劑和用于PCR反 應(yīng)的試劑以及使用說(shuō)明書(shū)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒中的使用說(shuō)明書(shū)包括對(duì) 用于快速檢測(cè)轉(zhuǎn)Xa21基因水稻或其制品的PCR擴(kuò)增條件的描述。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案 中，所述試劑盒的說(shuō)明書(shū)中給出的PCR擴(kuò)增條件是95°C，IOmin ；95°C 15s ；60°C, lmin,45 個(gè)循環(huán)。根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物對(duì)和探 針在檢測(cè)轉(zhuǎn)Xa21基因的水稻或其制品中的應(yīng)用。在根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用的優(yōu)選實(shí)施方案中， 所述特異性寡核苷酸引物對(duì)由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的堿基序列為SEQ ID No. 1，所述下游引物的堿基序列為SEQ ID No. 2 ；所述探針的堿基序列為SEQ ID No. 3， 在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)FAM。在根據(jù) 本發(fā)明的應(yīng)用的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述特異性寡核苷酸引物對(duì)由上游引物和下游引物 組成，所述上游引物的堿基序列為SEQ ID No. 4，所述下游引物的堿基序列為SEQ ID No. 5 ； 所述探針的堿基序列為SEQ ID No. 6，在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端 連接有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)FAM。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供本發(fā)明的試劑盒在檢測(cè) 轉(zhuǎn)Xa21基因水稻或其制品中的應(yīng)用。優(yōu)選地，在本發(fā)明的上述應(yīng)用中，所述試劑盒包含以 下一組或兩組特異性寡核苷酸引物對(duì)和探針(1)堿基序列為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2的寡核苷酸引物對(duì)以及堿基序列為 SEQ ID No. 3的探針，在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光 報(bào)告基團(tuán)FAM ；和/或(2)堿基序列為SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5的寡核苷酸引物對(duì)以及堿基序列為 SEQ ID No. 6的探針，在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光 報(bào)告基團(tuán)FAM。本發(fā)明以轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)品的DNA為檢測(cè)基礎(chǔ)，根據(jù)水稻的Xa21基因序列設(shè)計(jì)引物 及探針，利用實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)Xa21基因水稻或其制品。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在常規(guī)PCR方法的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的。在該P(yáng)CR體系中，除 了兩條普通的引物外，還有一條在5'和3'端分別標(biāo)記了報(bào)告熒光染料基團(tuán)(R)、猝滅熒 光染料基團(tuán)(Q)、并與PCR產(chǎn)物特異結(jié)合的寡核苷酸探針。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒 光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光 基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可以接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有 一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的積累與PCR產(chǎn)物形成的完全同步。通過(guò)分析PCR模 板的起始拷貝數(shù)，并以標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，判定待檢產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因含量。本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法由于使用熒光染料實(shí)時(shí)顯示PCR產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)積 累，在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中閉管操作，沒(méi)有PCR后處理過(guò)程，有效地解決了 PCR后污染問(wèn)題。使 用本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，能夠簡(jiǎn)單、快速、特異且靈敏地檢測(cè)出含有轉(zhuǎn)Xa21基因 的農(nóng)產(chǎn)品、食品。


圖1是顯示水稻轉(zhuǎn)化事件特異性的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果，其中使用特異性寡核 苷酸引物對(duì)SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2和探針SEQ ID No. 3進(jìn)行檢測(cè)，熒光曲線編號(hào)與 樣品對(duì)應(yīng)如下基線以上的熒光曲線為抗優(yōu)97樣品(4次重復(fù))，基線位置為科豐6號(hào)、克 螟稻(KMDl)、巴呑米、K105、明恢63、培雜35、津稻9618、皖稻181、春優(yōu)59及空白對(duì)照。這 些水稻品種由國(guó)家農(nóng)業(yè)部門命名，為本領(lǐng)域所公知。圖1的橫坐標(biāo)為PCR循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為 熒光值。圖2是針對(duì)事件特異性的引物和探針進(jìn)行靈敏度評(píng)價(jià)，其中使用特異性寡核苷酸 引物對(duì)SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2和探針SEQ ID No. 3進(jìn)行檢測(cè)。將IOOng的相對(duì)質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為5% (W/W)轉(zhuǎn)基因水稻抗優(yōu)97的基因組DNA 5個(gè)梯度的4倍稀釋。圖2的橫坐標(biāo)為 PCR循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光值。圖3是顯示水稻Xa21基因特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果，其中使用特異性寡核苷 酸引物對(duì)SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5和探針SEQ ID No. 6進(jìn)行檢測(cè)，其中熒光曲線編號(hào) 與樣品對(duì)應(yīng)如下基線以上的熒光曲線為抗優(yōu)97樣品(4次重復(fù))，基線位置為科豐6號(hào)、 克螟稻(KMDl)、巴呑米、K105、明恢63、培雜35、津稻9618、皖稻181、春優(yōu)59及空白對(duì)照。 圖3的橫坐標(biāo)為PCR循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光值。圖4是針對(duì)基因特異性引物和探針進(jìn)行靈敏度評(píng)價(jià)，其中使用特異性寡核苷酸引 物對(duì)SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5和探針SEQ ID No. 6進(jìn)行檢測(cè)。將IOOng的相對(duì)質(zhì)量分 數(shù)為5% (W/W)轉(zhuǎn)基因水稻抗優(yōu)97的基因組DNA 5個(gè)梯度4倍稀釋。圖4的橫坐標(biāo)為PCR 循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光值。
具體實(shí)施例方式通過(guò)實(shí)施例的方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但是本發(fā)明并不僅僅局限于以下實(shí) 施例。實(shí)施例1本發(fā)明的發(fā)明人首次通過(guò)水稻Xa21基因序列設(shè)計(jì)檢測(cè)轉(zhuǎn)Xa21基因水稻或其制品 的Xa21基因特異性寡核苷酸引物對(duì)及探針。斜體為水稻線粒體基因序列，下劃線部分為Xa21基因序列
A GGCAGTAAAAGTAAA GA GCTA GA GGTCGGGTCCTTCCTCT CCTCA TTCAA GCCA GGCGGGAA GGCTGTTTA CA TA CGTA TAA TC CGCTTGTCAA TTCTTTA TA TCA GA CTCA CTCGTCAAA GCAA TTGAA CTTCA TTGA GGGAA CA GGGGCTTTCTTTA GGA GA TAAA TCA GA G CTTTCC A CAAA TA GAA GTGA GA A CAA GAA GCCCC TTC TG rCTCGTAGTGC
TTCACATTCGGCAGTGAAACTCTTGAGCGCCTTAGGATTTTC.
A A GCTrIT AGT ACC I TC ACTGC AAC ATGATCTTGGATATTAAG
TTTGTATACTGAGCCAAATGATCCAGAACC(SEQ ID No. 7)
轉(zhuǎn)化事件特異性引物及探針序列上游引物的堿基序列為SEQ ID No. 1，下游引物 的堿基序列為SEQ ID No. 2 ；所述探針的堿基序列為SEQ ID No. 3，在探針的3’端連接有一 個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)FAM。Xa21基因內(nèi)含子序列TCCTTCCAGTATTTTGCATTTTCTGATCTCTAGTGCTATATGAAATAGTTTTTACCTCTAGTGAAACT GATGGAGAATATAAGTAATTAATTGAACTAATTAAATTGCACAAAAATAAGATTATTTGCCATATCTATTCAGATG CTAAATATAGCTAGTTCATAGAGGTACAGATTTTTTTATATAGGACTCTAGAGCTACCACACACTCAAATCAAATT A TGGGTGTTTTCTGCTCT ACACTGC A ATA TGAAATGATTATTACTTCTACATGAAC TGATGGAGGAG(SEQ ID No. 8)Xa21基因特異性引物及探針序列上游引物的堿基序列為SEQ ID No. 4，下游引物 的堿基序列為SEQ ID No. 5 ；所述探針的堿基序列為SEQ ID No. 6，在探針的3’端連接有一 個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)FAM。實(shí)施例2本實(shí)施例測(cè)試了轉(zhuǎn)化事件特異性及靈敏度，其中使用特異性引物M12-F/R，即所使 用的寡核苷酸引物的堿基序列為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2，探針的堿基序列為SEQ ID No. 3，在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)FAM。通過(guò)檢測(cè)不同相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的抗優(yōu)97水稻的DNA，可以測(cè)試轉(zhuǎn)化事件特異性及靈敏度。使用本發(fā)明的引物對(duì)和探針的組合，在樣品量極少的情況下，相對(duì)于其他引物對(duì) 仍能特異、靈敏地?cái)U(kuò)增出目的片段。在本實(shí)施例中，檢測(cè)了 10份樣本抗優(yōu)97、科豐6號(hào)、克螟稻(KMDl)、巴呑米、 K105、明恢63、培雜35、津稻9618、皖稻181、春優(yōu)59。所使用的檢測(cè)主要儀器微量移液器(10 μ L、100 μ L、1000y L Eppendorf)、熒光定量PCR儀、高速臺(tái)式離 心機(jī)(Picol7 Thermo)、高速粉碎機(jī)(IKA-ffEARKE GERMANY)、核酸蛋白分析儀(DYY-6C北京 六一儀器廠)等檢測(cè)主要試劑Taq 酶、dNTPs、10XPCR Buffer、溴化乙錠、DNA Ladder Marker (Takara) ；TaqMan Universal PCR Master Mix(ABI)；引物和探針(按序列制成試劑盒)，移液器Tips 務(wù)必使 用帶濾芯的型號(hào)，否則在混勻和分樣時(shí)非常容易污染；同時(shí)IOuL和2. 5uL的移液器務(wù)必使 用長(zhǎng)Tips，普通短Tips在工作時(shí)，移液器桿部可能會(huì)與離心管內(nèi)壁接觸，造成污染。檢測(cè)主要步驟1 DNA 提取待測(cè)樣品為抗優(yōu)97、科豐6號(hào)、克螟稻(KMDl)、巴呑米、K105、明恢63、培雜35、津 稻9618、皖稻181、春優(yōu)59。稱取50. Omg樣品粉末，加入1.0ml CTAB提取緩沖液及4. 0 μ L蛋白酶K(lOmg/ ml)，65°C溫浴孵化Ih ； 12000rpm離心15min，取幾近清澈的上清700μ 1 ；加入500 μ L氯仿， 高速渦旋混合30秒；12000rpm離心lOmin，收集500 μ L上清，轉(zhuǎn)移到新的1. 5ml反應(yīng)管中； 加入兩倍體積的CTAB沉淀緩沖液，室溫，孵育Ih ； 12000rpm離心5min棄上清，將沉淀溶于350 μ L的1. 2mol/L的氯化鈉溶液中，充分溶解；加入350 μ L三氯甲烷，小心高速渦旋混合 30秒；以12000rpm離心lOmin，將上清轉(zhuǎn)移到新的反應(yīng)管中；加入0. 8倍的異丙醇，室溫孵 育至少20min ； 12000rpm離心lOmin，棄上清；在沉淀中加入500 μ L 70%乙醇，高速渦旋30 秒，以 12000rpm 離心 IOmin ；棄上清，60°C干燥 15_25min，并溶于 50 μ LTE (ρΗ 8. 0)，-20°C 保存?zhèn)溆?。每次提取均設(shè)立相應(yīng)的空白對(duì)照(以雙蒸水代替樣品)。2實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)所用轉(zhuǎn)化事件特異性引物和探針引物的探針的堿基序列為 SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2，探針的堿基序列為SEQ ID No. 3，在探針的3，端連接有一個(gè) 熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)FAM。3實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系TaqMan Universal PCR Master Mix 12. 5μ L探針(10μ Μ) 0. 5μ L上游引物(ΙΟμΜ)0· 5μ L下游引物(ΙΟμΜ)0· 5μ L模板 DNA5 μ L加ddH20至總體積為25 μ L注每次PCR檢測(cè)均設(shè)立相應(yīng)的空白對(duì)照(用配制反應(yīng)體系的超純水代替DNA模 板，檢測(cè)試劑是否受到污染)；4實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)95 "C IOmin95 "C 15s60 °C Imin45個(gè)循環(huán)。注不同儀器應(yīng)將PCR各試劑及反應(yīng)參數(shù)做適當(dāng)調(diào)整。如圖1所示，使用引物M12-F/R擴(kuò)增待測(cè)樣品的DNA，測(cè)試轉(zhuǎn)化事件特異性，僅抗 優(yōu)97水稻能在基線以上出現(xiàn)熒光擴(kuò)增曲線，K105、明恢63、培雜35、津稻9618、皖稻181、春 優(yōu)、科豐6號(hào)、克螟稻(KMDl)、巴呑米59及空白對(duì)照的熒光曲線在基線位置。圖2為確定事件特異性引物和探針的檢測(cè)限。由圖2可以看出，事件特異性檢測(cè) 體系的檢測(cè)靈敏度為0. 005%。實(shí)施例3本實(shí)施例測(cè)試了 Xa21特異引物/探針的特異性及靈敏度，其中使用特異引物 Xa21-F/R，即所使用的寡核苷酸引物的堿基序列為SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5，探針的堿 基序列為SEQ ID No. 6，在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒 光報(bào)告基團(tuán)FAM。通過(guò)檢測(cè)線Xa21基因內(nèi)含子序列，可以測(cè)試轉(zhuǎn)Xa21基因的特異性及靈敏度。使用本發(fā)明的引物對(duì)和探針的組合，在樣品量極少的情況下，相對(duì)于其他引物對(duì) 仍能特異、靈敏地?cái)U(kuò)增出目的片段。在本實(shí)施例中，檢測(cè)了 10份樣本抗優(yōu)97、科豐6號(hào)、克螟稻(KMDl)、巴呑米、 K105、明恢63、培雜35、津稻9618、皖稻181、春優(yōu)59。所使用的檢測(cè)主要儀器
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微量移液器(10 μ L、100 μ L、1000y L Eppendorf)、熒光定量PCR儀、高速臺(tái)式離 心機(jī)(Picol7 Thermo)、高速粉碎機(jī)(IKA-ffEARKE GERMANY)、核酸蛋白分析儀(DYY-6C北京 六一儀器廠)等檢測(cè)主要試劑Taq 酶、dNTPs、10XPCR Buffer、溴化乙錠、DNA Ladder Marker (Takara) ；TaqMan Universal PCR Master Mix(ABI)；引物和探針(按序列制成試劑盒)，移液器Tips 務(wù)必使 用帶濾芯的型號(hào)，否則在混勻和分樣時(shí)非常容易污染；同時(shí)IOuL和2. 5uL的移液器務(wù)必使 用長(zhǎng)Tips，普通短Tips在工作時(shí)，移液器桿部可能會(huì)與離心管內(nèi)壁接觸，造成污染。檢測(cè)主要步驟1 DNA 提取待測(cè)樣品為抗優(yōu)97、科豐6號(hào)、克螟稻(KMDl)、巴呑米、K105、明恢63、培雜35、津 稻9618、皖稻181、春優(yōu)59。稱取50. Omg樣品粉末，加入1. Oml CTAB提取緩沖液及4. 0 μ L 蛋白酶K(10mg/ml)，65°C溫浴孵化Ih ；12000rpm離心15min，取幾近清澈的上清700 μ 1 ； 加入500 μ L氯仿，高速渦旋混合30秒；12000rpm離心lOmin，收集500 μ L上清，轉(zhuǎn)移到新 的1. 5ml反應(yīng)管中；加入兩倍體積的CTAB沉淀緩沖液，室溫，孵育Ih ； 12000rpm離心5min 棄上清，將沉淀溶于350 μ L的1. 2mol/L的氯化鈉溶液中，充分溶解；加入350 μ L三氯甲 烷，小心高速渦旋混合30秒；以12000rpm離心lOmin，將上清轉(zhuǎn)移到新的反應(yīng)管中；加入 0. 8倍的異丙醇，室溫孵育至少20min ； 12000rpm離心lOmin，棄上清；在沉淀中加入500 μ L 70%乙醇，高速渦旋30秒，以12000rpm離心IOmin ；棄上清，60°C干燥15_25min，并溶于 50 μ LTE (pH 8.0)，-20°C保存?zhèn)溆谩Ｃ看翁崛【O(shè)立相應(yīng)的空白對(duì)照(以雙蒸水代替樣
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m ) ο2實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)所用引物和探針Xa21-F GGACTCTAGAGCTACCACACACTCAA (SEQ ID No. 4) , Xa21-R CTCCTCCATCAGTTCATGTAGAAG (SEQ ID No. 5)XA21_P ATTGCAGTGTAGAGCAGAMACACCCA (SEQ ID No. 6)，在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)FAM。3實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系TaqMan Universal PCR Master Mix 12. 5μ L探針(10μ Μ) 0. 5μ L上游引物(10μ Μ) 0. 5μ L下游引物(10μΜ)0· 5μ L模板 DNA5μ L加ddH20至總體積為25 μ L注每次PCR檢測(cè)均設(shè)立相應(yīng)的空白對(duì)照(用配制反應(yīng)體系的超純水代替DNA模 板，檢測(cè)試劑是否受到污染)；4實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參
95 0C IOmin
95 0C 15s
60 °C Imin
45個(gè)循環(huán)。
注不同儀器應(yīng)將PCR各試劑及反應(yīng)參數(shù)做適當(dāng)調(diào)整。如圖3所示，使用基因特異性引物Xa21_F/R擴(kuò)增待測(cè)樣品的DNA，測(cè)試其特異性， 僅抗優(yōu)97水稻能在基線以上出現(xiàn)熒光擴(kuò)增曲線，K105、明恢63、培雜35、津稻9618、皖稻 181、春優(yōu)、科豐6號(hào)、克螟稻(KMDl)、巴呑米59及空白對(duì)照的熒光曲線在基線位置，說(shuō)明該 引物和探針表現(xiàn)出基因特異性。圖4為確定事件特異性引物和探針的檢測(cè)限。由圖4可以看出，事件特異性檢測(cè) 體系的檢測(cè)靈敏度為0. 005%。
權(quán)利要求
1.用于實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn))Ca21基因的水稻或其制品的特異性寡核苷酸引物對(duì) 及探針，其中所述引物對(duì)和探針選自以下組(1)堿基序列為SEQID No. 1和SEQ ID No. 2的寡核苷酸引物對(duì)以及堿基序列為SEQ ID No. 3的探針，在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告 基團(tuán)FAM ；禾口(2)堿基序列為SEQID No. 4和SEQ ID No. 5的寡核苷酸引物對(duì)以及堿基序列為SEQ ID No. 6的探針，在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告 基團(tuán)FAM。
2.用于實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn))Ca21基因水稻或其制品的試劑盒，其包括權(quán)利要求1 所述的寡核苷酸引物對(duì)和探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其還包括用于提取DNA的試劑、用于實(shí)時(shí)熒光PCR的 試劑、空白對(duì)照以及使用說(shuō)明書(shū)。
4.轉(zhuǎn)敘21基因水稻或其制品的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，所述方法包括使用權(quán)利要求1 所述的寡核苷酸引物對(duì)及探針或權(quán)利要求2或3所述的試劑盒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其中所述實(shí)時(shí)熒光PCR方法為 Taqman熒光探針?lè)ā?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，所述方法包括如下步驟(a)從待測(cè)產(chǎn)品中提取DNA樣品；(b)提供核酸擴(kuò)增反應(yīng)的條件；(c)使用權(quán)利要求1所述的寡核苷酸引物對(duì)及探針或權(quán)利要求2或3的試劑盒，通過(guò)實(shí) 時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)和檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。
7.權(quán)利要求1所述的特異性寡核苷酸引物對(duì)及探針在檢測(cè)轉(zhuǎn))Ca21基因水稻或其制品 中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求2或3所述的試劑盒在檢測(cè)轉(zhuǎn))Ca21基因水稻或其制品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)轉(zhuǎn)Xa21基因水稻或其制品的寡核苷酸引物及探針。本發(fā)明還涉及用于測(cè)定轉(zhuǎn)Xa21基因水稻或其制品的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，所述方法包括使用本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物及探針。本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)轉(zhuǎn)Xa21基因水稻或其制品的試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物和探針。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物及探針或試劑盒在檢測(cè)轉(zhuǎn)Xa21基因水稻或其制品中的應(yīng)用。使用本發(fā)明的特異性寡核苷酸引和探針、試劑盒以及PCR檢測(cè)方法，能夠簡(jiǎn)單、快速、特異且靈敏地測(cè)定轉(zhuǎn)Xa21基因水稻或其制品。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102134602SQ20101061522
公開(kāi)日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者鄧婷婷, 金蕪軍, 陳穎, 韓建勛, 黃文勝 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院