專利名稱：產(chǎn)琥珀酸放線桿菌菌株及其篩選和發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種琥珀酸放線桿菌菌株的篩選及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
丁二酸，又稱琥珀酸(succsinic acid)，是一種常見的天然有機(jī)酸，廣泛存在于動(dòng)、植物和微生物體內(nèi)，是生物進(jìn)行TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物之一。它是一種重要的有機(jī)合成中間體，主要應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、生物降解塑料、表面活性劑、洗滌劑、和綠色溶劑等領(lǐng)域。此夕卜，丁二酸還可以用作動(dòng)物飼料添加劑和植物生長刺激劑等方面。目前，丁二酸生產(chǎn)主要是利用化學(xué)合成的方法，從丁烷通過順式丁烯二酐生產(chǎn)琥珀酸，主要由石蠟氧 化法、輕油氧化法、丁烷氧化法、丁二腈水解法、催化加氫等方法。以化學(xué)方法生產(chǎn)丁二酸，需要消耗大量不可再生的石化原料，生產(chǎn)成本高，環(huán)境污染嚴(yán)重，從而限制了琥珀酸的廣泛應(yīng)用。因此，人們開始將目標(biāo)轉(zhuǎn)向通過生物發(fā)酵法來生產(chǎn)琥珀酸。與傳統(tǒng)的化學(xué)合成法相比，發(fā)酵法具有成本低、環(huán)境效益好等優(yōu)點(diǎn)。目前，通過發(fā)酵法生產(chǎn)得到的琥珀酸，其價(jià)格大約為O. 55 I. I$ /kg。另外,據(jù)Bio-amber公司稱,琥拍酸具有25億歐元的市場(chǎng),且生物法生產(chǎn)琥拍酸能夠與石化的方法相競爭，并計(jì)劃于2011前利用植物作為原料進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)琥珀酸。丁二酸是許多嚴(yán)格厭氧菌和兼性厭氧菌代謝的重要中間產(chǎn)物。目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種微生物可以通過發(fā)酵來生產(chǎn)琥珀酸，其中研究主要集中在大腸桿菌(E. coli)，曼海姆產(chǎn)玻拍酸菌(Mannheimia,產(chǎn)玻拍酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillutnsucciniciproducens)和產(chǎn)玻拍酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes ) 此外,一些乳酸菌、丙酸產(chǎn)生菌及真菌等也可以產(chǎn)生少量丁二酸。在眾多的產(chǎn)琥珀酸微生物中，瘤胃微生物產(chǎn)琥珀酸放線桿菌能夠利用多種糖類進(jìn)行發(fā)酵，并且可以耐受葡萄糖和琥珀酸的濃度分別高達(dá)158 g/L和104 g/L;同時(shí)，該菌以其高產(chǎn)量、高耐受性等優(yōu)勢(shì)，成為最具發(fā)展前景的琥拍酸產(chǎn)生菌之一。國外在琥珀酸放線桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸研究方面研究較多，其中美國密歇根生物技術(shù)研究院(MEI) Zeikus等人課題組處于領(lǐng)先地位。他們?cè)?996年篩選出一株高產(chǎn)丁二酸菌株 130Z (.Actinoabcillus succinogens ATCC 55618),并以 130Z 為出發(fā)菌株，篩選出對(duì)單氟乙酸抗性的自發(fā)突變株。在最適條件下，此抗性株發(fā)酵時(shí)間48h，發(fā)酵產(chǎn)物中的琥珀酸/乙酸比例高達(dá)85:1 ;琥珀酸/甲酸比例高達(dá)160:1，丁二酸產(chǎn)量可以達(dá)到80-110 g/L,得率高達(dá)97%,使丁二酸發(fā)酵獲得了突破性進(jìn)展(Applied and EnvironmentalMicrobiology. 2005, 71: 6651-6656 -,Int J Syst Bacteriol 1999, 49:207-216)。國內(nèi)對(duì)琥珀酸酸放線桿菌發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的研究也較多。較早的有天津大學(xué)的趙學(xué)明等人對(duì)購自國外的ATCC55618菌株發(fā)酵研究發(fā)現(xiàn)其琥珀酸產(chǎn)量在11. 49g/L，并有乳酸等副產(chǎn)物存在，對(duì)該菌株誘變后產(chǎn)量亦無顯著高。近期，江南大學(xué)的孫志浩等人，篩選出菌株Actinobacillus succinogens CGMCC1593,對(duì)其誘變選育后，SF-9 在 5L 發(fā)酵耀上發(fā)酵 36h琥珀酸產(chǎn)量達(dá)40. 51g/L，但仍然存在乳酸、甲酸和乙酸等副產(chǎn)物。南京工業(yè)大學(xué)姜岷等通過對(duì)篩選得到的玻拍酸放線桿菌jcii/ oAaci77w5· succinogenes NJl 13 (CGMCCNO. 1716)進(jìn)行改造和發(fā)酵條件優(yōu)化，丁二酸的產(chǎn)量可達(dá)的52 g/L。中國專利文獻(xiàn)琥珀酸放線桿菌菌種改組、選育方法以及用其發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，申請(qǐng)?zhí)朇N200810146688，申請(qǐng)日2008-09_05，發(fā)明人孫志浩；倪曄；鄭璞；董晉軍；專利權(quán)人江南大學(xué)。該發(fā)明涉及一株具有較強(qiáng)鈉離子耐受性和產(chǎn)酸性能的琥珀酸放線桿菌 Actinobacillus succinogenes CGMCC 2653 (即 F3-10),該菌株的選育方法及用其發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。以琥珀酸放線桿菌CGMCC 1593作為出發(fā)菌株，分別對(duì)其進(jìn)行X-射線、紫外線誘變和硫酸二乙酯(EMS)、亞硝基胍(NTG)化學(xué)誘變，篩選得到具有改良的發(fā)酵產(chǎn)酸性能，特別是鈉離子耐受性有改良三株菌株X-8、UV-17、SE-6，和具有氟乙酸抗性的高產(chǎn)菌株SF-9，將它們用基因組改組方法選育得到高產(chǎn)、耐鈉、抗氟乙酸的菌株F3-10。該菌株F3-10以甘蔗糖蜜為原料，采用Na2C03控制發(fā)酵pH，在5L發(fā)酵罐中進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，48h產(chǎn)丁二酸53. 96g/L，對(duì)消耗糖產(chǎn)率89. 2 %，糖利用率94. O %，丁二酸比雜酸為6.58 1，較出發(fā)菌CGMCC1593有顯著提高。
綜上所述，目前由于國外的技術(shù)封鎖，國外的菌種難以獲得，即使購買到國外菌種，也會(huì)由于具體技術(shù)條件難以得知，產(chǎn)量也不高，根本達(dá)不到文獻(xiàn)報(bào)道的產(chǎn)量；國內(nèi)丁二酸菌株生產(chǎn)方面與國外還有一定的差距，目前國內(nèi)最高產(chǎn)的也就是50 g/L左右的丁二酸。因此，篩選丁二酸更高產(chǎn)的微生物菌株和研究出一種能夠生產(chǎn)更高濃度丁二酸的方法是很有必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是國內(nèi)生產(chǎn)丁二酸菌株產(chǎn)量不高的現(xiàn)狀，提供一種丁二酸產(chǎn)量能達(dá)到70 g/L的琥珀酸放線桿菌，以及其篩選和生產(chǎn)丁二酸的方法。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的
一株產(chǎn)琥拍酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes菌株，分類屬巴斯德菌科(pasteureIIaceae)放線桿菌屬(Actinobacillus)的產(chǎn)玻拍酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes) GXAS-137，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)郵編430072，保藏時(shí)間保存編號(hào)為CCTCC N0:M2011399，保藏時(shí)間為2011年11月18日，并于2011年11月25日檢測(cè)結(jié)果為存活。
以上所述的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌菌株的篩選方法，根據(jù)產(chǎn)丁二酸菌株能夠利用富馬酸產(chǎn)生丁二酸的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)以富馬酸鈉為唯一碳源富集培養(yǎng)基和選擇平板，此外通過添加莫能菌素可有效抑制產(chǎn)乳酸菌和產(chǎn)甲烷菌等雜菌生長，在篩選平板中添加適量的丁二酸鈉，可以抑制提高篩選菌株對(duì)丁二酸的耐受性，可以有效篩選產(chǎn)琥珀酸放線桿菌菌株，具體步驟如下
(1)將新鮮牛的瘤胃內(nèi)容物懸浮于適量生理鹽水中，用無菌紗布過濾去除粗纖維等固體物質(zhì)；
(2)將過濾得到的懸浮液接種于^50-150ml富集培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，30_37°C厭氧箱中培養(yǎng)16_30h ;所述的富集培養(yǎng)基為含有富馬酸鹽作為唯一碳源并添加氮源、無機(jī)鹽和莫能菌素的培養(yǎng)基，詳細(xì)配方如下富馬酸鈉10_30g/L，酵母粉5-20g/L，蛋白胨5-20g/L, K2HP04l-5g/L, CaCl2O. 1-lg/L，NaCl O. 5_2g/L，(NH4)2SO4O. 5_2g/L，MgCl2O. l_lg/L，莫能菌素O. 1-0. 2g/L，將前述原料混勻即可得到富集培養(yǎng)基。(3)轉(zhuǎn)接2次后，培養(yǎng)物按照梯度稀釋后，涂布在篩選培養(yǎng)基的平板上，于厭氧箱培養(yǎng)30-48h,挑選菌落較大菌株于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)結(jié)束后，HPLC測(cè)定每個(gè)樣品丁二酸含量，選取丁二酸產(chǎn)量濃度大于10g/L菌株進(jìn)行復(fù)篩，選取復(fù)篩后丁二酸產(chǎn)量高、副產(chǎn)物少的菌株，即可得到權(quán)利要求I所述的產(chǎn)琥珀放線桿菌菌株。所述的篩選培養(yǎng)基為在富集培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加30-100 g/L 丁二酸鈉，平板培養(yǎng)時(shí)加入15-20 g/L瓊脂粉。將經(jīng)過上述篩選到的菌株(在此命名為GXAS137)進(jìn)行16S rDNA基因序列測(cè)定和生理生化鑒定，結(jié)果如下
1.經(jīng)過對(duì)GXAS137菌株的16SrDNA (附圖I)基因序列比對(duì)，與Actinobacillussuccinogenes 130Z的序列同源性最高,為94%。具體DNA基因序列為
0001 ATTGAAGAGT TTGATCATGA CTCAGATTGA CGATAACGAG TGAAAAGCTT GCTATCCATG 0061 CTGAAGAGTG GCGAACGAGT GAGTAATGCT TGAGAATCTG GCTTATGAAG GAGAATAACG0121 AAGAGAAAAT GTCGCTAATA CCGCGATGTC TAAGAACTAA AGAGTGAGAT TATCGAACCG0181 CCCGCCATAA GATGAGCCCA AGTGAGATTA GATAGTTGAT GAGATAAAGA AGCCCAAGTG0241 GAATTAGATA GTTGATGAGA TAAAGAACTA CCAAGCCGAA GATCTCTAGC TGATCTGAGA0301 GAATGAACAG CCAAAATGAA AATGAGAAAA GATCCAGAAT CCTAAGAGAG GCAGCAGTGA0361 GAAGAAGCAA CGAATAACTC CGTGCCAGCA GCCGCGATAA TAAGAAGAGT GCGAGCGTTA0421 TTCCCGAGCC AAGTTCTTTC TTGTAAAAAA AAGAAGAATA AGTTAACAGC TATGATTCAT0481 GAAGTTAGCC AAAGAAGAAG CAACGAATAA CTCCGTGCCA GCAGCCGCGA TAATAAGAAG0541 GATGCGAGCG TTAATCGAAA TAACTGAGCG TAAAGAGCAA GCAGAAGAAT ATATAAGTGA0601 ATCGAAATAA CTGAGCGTAA AGAGCAAGCA GAAGAATGAA TGAGATCAAG GAATTCGTAA0661 TGAGTTGTAA GTAGAATTCC AAGTGTAGCG GTGAAATGCG TAGAGATGTG GAGAAATAAC0721 GAAGAAGAAG GCAGCCCCTT GAGAACGTAA TGAAGCTCAT GTGCGAAAGC GTGAGAAGCA0781 AACATGAGAG GATAACCTGA TAGTCCAAGC TGTAAAAGCT GTCGATATGA GAATTGAGCG0841 ATAAGCCTGA TGCCCGAAGC TAACGTGATA AATCGAACGC CTGAGAAGTA CGAACGCAAG0901 GTTAAAACTC AAATGAATTG AAGAGAGCCC CATAACAAGA TGAAGCATGT GATATAATTC0961 GATGCAACGC GAAGAACCTT AACTAATCTT GAAATCCTCA GAATCCGATA GAGATATCGA1021 AGTGCCTTCG GAAAATGAGA GAAAGATGCT GCATGAATGT CGTCAGCTCG TGTTGTGAAA1081 TGTTGAGTTA AGTCCCGCAA CGAGCGCAAC CCTTATCCTT TGTTGCCAGC ATGTAGAGAT1141 GAGAACTCAA AGAAGAATGC CGATGATAAA CCGAAGAAAG GTGAGAATGA CGTCAAGTCA1201 TCATGAACCT TAAGAGTAGA GCTAAAAAAG TGCTAAAATG GCGTATAAAG AGAGAAAAGA1261 ATGAGAACTC AAAGAAGAAT GCCGATGATA AACCGAAGAA AGATGAGAAT GAAGTCAAGT1321 CATCATGAAC CTTAAGAGTA GAGCTAAAAA CGTGCTAAAA TGAAGTATAA AGAGAGAAAA1381 GAGCCTGCGA GAGAGAGTGA ATCTCAGAAA GTGCGTCGTA GTCCGAATTG GAGTCTGCAA1441 ATCGAATCCA TGAAGTCGAA ATCGCTAGTA ATCGCGAATC AGCATGTCGC AGTTCTATCG1501 ATGATGAGAA AGAAGAATGT TAACAGCTTA TTCGATTGAA GTTAGCCAAA
2.GXAS137菌株為革蘭氏陰性菌，兼性厭氧菌，細(xì)胞成桿狀或球桿狀，不運(yùn)動(dòng)，無芽孢，也不產(chǎn)生孢子。生長溫度為20-40 °C，最適35-38°C，生長pH4. 5-8. 0，最適6. 5-7. 5。3. GXAS137菌株可以發(fā)酵以下底物產(chǎn)酸葡萄糖，蔗糖，果糖，麥芽糖，D-木糖，乳糖，果糖，甘露糖，D-阿拉伯糖，甘露醇，D-山梨醇等糖類或醇類，以及糖質(zhì)原料如甘蔗汁、甜菜汁、糖蜜等和淀粉質(zhì)及纖維素原料的水解液。4. GXAS137菌株的代謝產(chǎn)物該菌代謝產(chǎn)物以丁二酸為主，其他副產(chǎn)物由乙酸、甲
酸、乳酸、丙酮酸、蘋果酸和富馬酸。當(dāng)提供較高CO2時(shí)，菌體生產(chǎn)較快，丁二酸快速積累，其他副產(chǎn)物較少。由以上16S rDNA基因序列測(cè)定和生理生化特性結(jié)果，可以認(rèn)定GXAS-137菌株屬于巴斯德菌科(pasteurellaceae)放線桿菌屬(Actinobacillus)的產(chǎn)琥拍酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes),現(xiàn)已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保存編號(hào)為CCTCC N0:M2011399，保藏時(shí)間為2011年11月18日，并于2011年11月25日檢測(cè)結(jié)果為存活。
運(yùn)用以上所述產(chǎn)琥珀放線桿菌菌株發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法將產(chǎn)琥珀放線桿菌菌株接入種子培養(yǎng)基中，在厭氧培養(yǎng)箱或普通培養(yǎng)箱中30-38°C靜止培養(yǎng)24-36h，按1-10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)PH在6. 0-7. O,并在30-38°C發(fā)酵24_120h，即可得到丁二酸，所述的調(diào)節(jié)PH用的是碳酸鹽、氨水、NaOH，所述的碳酸鹽為堿式碳酸鎂，所述的發(fā)酵條件為有氧或通入N2或CO2。優(yōu)選方案為堿式碳酸鎂調(diào)節(jié)pH，通入CO2 ;如采用氨水、NaOH等堿性調(diào)節(jié)，必須通入CO2。以上所述的種子培養(yǎng)基的成分及其濃度為糖類10-20 g/L，酵母粉5-10 g/L，蛋白胨 5-10 g/L, K2HPO4 1-5 g/L, CaCl2 O. 5-1 g/L，NaCl O. 5-2 g/L，(NH4)2SO4 0.5-2 g/L,MgCl2 0.5-1 g/L，堿式碳酸鎂 10-20 g/L。以上所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及其濃度為糖類40-100 g/L，氮源10-40 g/L,K2HPO4 1-5 g/L，CaCl2 O. 5-1 g/L，NaCl O. 5-2 g/L, (NH4)2SO4 0.5-2 g/L, MgCl2 0.5-1 g/L0以上所述的糖類包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木糖，甘蔗、甜菜、糖蜜中所含的糖；木薯、玉米、甘薯淀粉質(zhì)原料水解釋放出的糖；纖維素的水解物中的一種或多種的組合。以上所述的氮源包括有機(jī)氮源和無機(jī)氮源；所述的有機(jī)氮源包括酵母粉、蛋白胨、玉米漿、豆餅粉，所述的無機(jī)氮源包括尿素、硫酸銨。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果
(I)本發(fā)明采用添加中間代謝物富集和產(chǎn)物抑制，篩選到一株丁二酸產(chǎn)量可達(dá)70 g/L菌株CCTCC M 2011399 (GXAS137)，具有工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。(2)該菌株還可以發(fā)酵木糖產(chǎn)生丁二酸，因此，可以充分利用自然界中豐富的纖維素資源，保證原料廉價(jià)、可持續(xù)供應(yīng)，可以解決丁二酸化學(xué)合成的化石資源緊張，污染環(huán)境的問題。(3)該菌株可以采用木薯、玉米粉或纖維素等可再生生物質(zhì)原料，是一種利用可再生原料的生產(chǎn)方法，可緩解化學(xué)合成丁二酸的石化資源緊張問題，對(duì)環(huán)境友好，而且這些原料中還含有一些可供微生物利用的氮源、維生素等其他營養(yǎng)成份，可顯著提高丁二酸產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本。


圖I產(chǎn)琥珀酸放線桿菌CCTCC M 2011399電鏡照片。
具體實(shí)施例方式以下是琥珀 酸放線桿菌菌株CCTCC M 20113997篩選、鑒定及發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的具體實(shí)施實(shí)例。但對(duì)本發(fā)明沒有限制。
實(shí)施例I
琥珀酸放線桿菌菌株的篩選與鑒定
I、富集培養(yǎng)基的制備含有富馬酸鹽為唯一碳源并添加氮源、無機(jī)鹽和莫能菌素的培養(yǎng)基。詳細(xì)配方如下(g/L):富馬酸鈉10-30，酵母粉5-20，蛋白胨5-20，K2HPO4 1-5，CaCl2O. 1-1，NaCl O. 5-2，(NH4)2SO4 O. 5-2, MgCl2 O. 1-1，莫能菌素 O. 1-0. 2，將前述原料混勻即可得到富集培養(yǎng)基。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，前述富集培養(yǎng)基原料配方內(nèi)的任一濃度組合制備的富集培養(yǎng)基均可篩選出本發(fā)明的GXAS137菌株。2.、平板篩選培養(yǎng)基的制備在富集培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加丁二酸鈉和瓊脂粉。詳細(xì)配方如下(g/L):富馬酸鈉 10-30，酵母粉 5-20，蛋白胨 5-20，K2HPO4 1-5, CaCl2 O. 1-1，NaClO. 5-2，(NH4)2SO4 O. 5-2，MgCl2 O. 1-1，丁二酸鈉 30-100，瓊脂粉 15-20，將前述原料混勻即可得到篩選培養(yǎng)基。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，前述篩選培養(yǎng)基原料配方內(nèi)的任一濃度組合制備的篩選培養(yǎng)基均可篩選出本發(fā)明的GXAS137菌株。3.、琥珀酸放線桿菌菌株的篩選
(1)從南寧市某肉聯(lián)廠新鮮牛胃中采樣，將新鮮牛的瘤胃內(nèi)容物懸浮于適量生理鹽水中，用無菌紗布過濾去除粗纖維等固體物質(zhì)；
(2)將過濾得到的懸浮液接種于含50-150ml制備好的富集培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37°C厭氧箱中培養(yǎng)(若無厭氧箱也可用血清瓶代替三角瓶)24h，厭氧箱通入N2:C02:H2=85 10 5的混合氣。(3)按5%接種量轉(zhuǎn)接2次后，，培養(yǎng)物按照梯度稀釋后，涂布在分離培養(yǎng)基的平板上，厭氧箱培養(yǎng)30-48h，挑選菌落較大菌株于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的試管中發(fā)酵，培養(yǎng)結(jié)束后；
(4)HPLC測(cè)定每個(gè)樣品丁二酸含量，選出產(chǎn)丁二酸菌株357株，經(jīng)過進(jìn)一步三角瓶放大發(fā)酵復(fù)篩，篩選出18株丁二酸產(chǎn)量較高菌株，其中一株GXAS137遺傳穩(wěn)定性好(詳見表I),丁二酸產(chǎn)量高，副產(chǎn)物較少，將該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保存編號(hào)為CCTCCM 2011399。HPLC 測(cè)定戴安 Utimat3000，自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱AminexHPX_87H 300X7. 8mm,流動(dòng)性5 mmol/LH2S04, pH2. 5，柱溫45°C，進(jìn)樣量10uL，流速O. 6mL/min,紫外檢測(cè)器波長210nmo表I復(fù)篩后產(chǎn)丁二酸較高的菌株產(chǎn)酸及副產(chǎn)物情況
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵產(chǎn)丁ニ酸的微生物菌株，其分類屬巴斯德菌科(pasteurellaceae)放線桿菌屬(Actinobacillus)的產(chǎn)玻拍酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes) GXAS-137,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保存編號(hào)為CCTCC M 2011399。
2.—種權(quán)利要求I所述的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌菌株的篩選方法，其特征在于將新鮮牛的瘤胃內(nèi)容物懸浮于適量生理鹽水中，用無菌紗布過濾去除固體物質(zhì)，將過濾得到的懸浮液接種于富集培養(yǎng)基中，30-37°C厭氧培養(yǎng)16-30h，轉(zhuǎn)接2次后，培養(yǎng)物按照梯度稀釋后，涂布在含篩選培養(yǎng)基的平板上，厭氧培養(yǎng)30-48h,挑選菌落較大菌株于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)結(jié)束后，HPLC測(cè)定每個(gè)樣品丁ニ酸含量，選取丁ニ酸濃度大于10g/L菌株進(jìn)行復(fù)篩，選取復(fù)篩后丁ニ酸產(chǎn)量高、副產(chǎn)物少的菌株，即可得到權(quán)利要求I所述的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌菌株的篩選方法，其特征在于所述的富集培養(yǎng)基為含有富馬酸鹽作為唯一碳源并添加氮源、無機(jī)鹽和莫能菌素的培養(yǎng)基，詳細(xì)配方如下富馬酸鈉 10-30g/L，酵母粉 5-20g/L，蛋白胨 5-20g/L，K2HP04l-5g/L，CaCl20. I-Ig/L，NaCl O. 5-2g/L，(NH4)2SO4O. 5_2gL，MgCl2O. 1-lg/L，莫能菌素 O. 1-0. 2g/L，將前述原料混勻即可得到富集培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌菌株的篩選方法，其特征在于所述的篩選培養(yǎng)基為在富集培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加30-100g/L丁ニ酸鈉，平板培養(yǎng)時(shí)加入15-20g/L瓊脂粉。
5.ー種運(yùn)用權(quán)利要求I所述產(chǎn)琥珀酸放線桿菌菌株發(fā)酵生產(chǎn)丁ニ酸的方法，其特征在于將產(chǎn)琥珀酸放線桿菌菌株接入種子培養(yǎng)基中，在厭氧培養(yǎng)箱或普通培養(yǎng)箱中30-38°C靜止培養(yǎng)24-36h，按1-10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH在6. 0-7. 0，并在30_38°C發(fā)酵24-70h，即可產(chǎn)生丁ニ酸，所述的pH調(diào)節(jié)劑是碳酸鹽、氨水、NaOH,所述的碳酸鹽為堿式碳酸鎂，所述發(fā)酵的條件為有氧或通入N2或C02。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述產(chǎn)琥珀酸放線桿菌菌株發(fā)酵生產(chǎn)丁ニ酸的方法，其特征在于所述的種子培養(yǎng)基的成分及其濃度為糖類10_20g/L，酵母粉5-10g/L，蛋白胨5-10g/L，K2HP04l-5g/L, CaCl2O. 5-lg/L，NaCl O. 5_2g/L，(NH4)2SO4O. 5_2g/L，MgCl2O. 5-lg/L，堿式碳酸鎂 10-20g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述產(chǎn)琥珀酸放線桿菌菌株發(fā)酵生產(chǎn)丁ニ酸的方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及其濃度為糖類40-100g/L，氮源10-40g/L，K2HP04l_5g/L，CaCl2O. 5-lg/L, NaCl O. 5_2g/L，(NH4)2SO4O. 5_2g/L，MgCl2O. 5-lg/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述產(chǎn)琥珀酸放線桿菌菌株發(fā)酵生產(chǎn)丁ニ酸的方法，其特征在于所述的糖類包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木糖，甘蔗、甜菜、糖蜜中所含的糖；木薯、玉米、甘薯淀粉質(zhì)原料水解釋放出的糖；纖維素的水解物中的一種或多種的組ムロ ο
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述產(chǎn)琥珀酸放線桿菌菌株發(fā)酵生產(chǎn)丁ニ酸的方法，其特征在于所述的氮源包括有機(jī)氮源和無機(jī)氮源；所述的有機(jī)氮源包括酵母粉、蛋白胨、玉米漿和豆餅粉，所述的無機(jī)氮源包括尿素、硫酸銨。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)GXAS-137，以及其篩選和發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，該菌株從牛瘤胃富集、篩選獲得，并利用該產(chǎn)琥珀酸放線桿菌菌株接入種子培養(yǎng)基中，在厭氧培養(yǎng)箱或普通培養(yǎng)箱中30-38℃靜止培養(yǎng)24-36h，按1-10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH在6.0-7.0，并在30-38℃發(fā)酵24-120h，即可得到丁二酸。并對(duì)不同原料和培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵研究，丁二酸產(chǎn)量能達(dá)到70g/L，具有工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102851224SQ201210017288
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者申乃坤, 黃日波, 王青艷, 秦艷, 黎貞崇, 朱婧, 王成華, 廖思明 申請(qǐng)人:廣西科學(xué)院