以棉纖維材料固定琥珀酸放線桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法
【專利摘要】本發(fā)公開了一種以棉纖維材料固定琥珀酸放線桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，屬于發(fā)酵工程領域。將琥珀酸放線桿菌在裝有棉纖維載體的發(fā)酵罐中培養(yǎng)、吸附固定，通過反復分批發(fā)酵、反復補料分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵或雙罐循環(huán)連續(xù)發(fā)酵工藝，提高了發(fā)酵的細胞濃度，同時獲得高產(chǎn)酸濃度、高生產(chǎn)強度和高轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化率最高達90%，生產(chǎn)強度最高為4.27g/L/h，丁酸產(chǎn)量最高為98.7g/L。
【專利說明】以棉纖維材料固定琥珀酸放線桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及以棉纖維材料固定琥珀酸放線桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，屬發(fā)酵工程領域。
【背景技術】
[0002]丁二酸，又名琥珀酸(Succinic acid)，是一種重要的碳四平臺化合物。目前主要是利用石油為原料經(jīng)化學法合成法生產(chǎn)丁二酸。利用琥珀酸放線桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，是從可再生的糖質(zhì)原料出發(fā)，通過微生物的TCA還原途徑固定CO2生產(chǎn)丁二酸，符合當今低碳經(jīng)濟發(fā)展要求，具有良好發(fā)展前景。但是，目前這種生產(chǎn)方法還受到生產(chǎn)成本偏高的制約。微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸還存在發(fā)酵過程菌體生物量不高、高底物濃度與高產(chǎn)物濃度對發(fā)酵的抑制，不能同時獲得理想的生產(chǎn)強度與轉(zhuǎn)化率的問題，因此，如何獲得既有高的產(chǎn)物濃度又有高的生產(chǎn)強度和轉(zhuǎn)化率成為用琥珀酸放線桿菌發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸的研究熱點。
[0003]2004年美國Urbance等報道了用塑料復合基質(zhì)作為固定化材料，安裝在發(fā)酵罐攪拌漿上，連續(xù)發(fā)酵運行，產(chǎn)丁二酸的生產(chǎn)強度達到2.lg/L/h，轉(zhuǎn)化率為0.72g/g，但丁二酸的濃度最大僅為10.4g/L ;他們還嘗試用生物膜循環(huán)發(fā)酵系統(tǒng)，在發(fā)酵罐內(nèi)添加一個多孔網(wǎng)狀材料用于富集菌體，轉(zhuǎn)化率和丁二酸濃度提高到0.88g/g和34g/L，但生產(chǎn)強度僅為
0.9g/L/h。2009年，韓國Kim等將細胞固定在生物膜系統(tǒng)中進行循環(huán)連續(xù)發(fā)酵，在稀釋率為0.2/h條件下，獲得最高的生產(chǎn)強度為6.63g/L/h，但丁二酸濃度仍僅為13.26g/L。2011年中科院過程所李強等，提出了一個發(fā)酵與提取偶聯(lián)的裝置，將發(fā)酵反應器與一個擴大的吸附床相偶聯(lián)，發(fā)酵結束后發(fā)酵液中丁二酸被吸附到樹脂上，同時新鮮培養(yǎng)基重新添加到發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，當吸附床中樹脂吸附飽和后，結束整個發(fā)酵周期，可以明顯提高丁二酸的濃度(達到145.2g/L)，但 發(fā)酵時間從48h延長到126h，生產(chǎn)強度為1.3g/L/h，平均轉(zhuǎn)化率僅為0.52g/g。2012年南非Van Heerden與Nicol以珍珠巖作為固定細胞材料，珍珠巖填充在反應器內(nèi)作為吸附材料進行連續(xù)發(fā)酵，在稀釋率為0.56/h時，反應器的生產(chǎn)強度達到
6.35g/L/h，但轉(zhuǎn)化率僅為0.65g/g。盡管以上的方法有的有效的提高丁二酸的生產(chǎn)強度，有的提高了產(chǎn)物濃度，但是同時獲得高產(chǎn)酸濃度、高轉(zhuǎn)化率和高生產(chǎn)強度的方法很少。
[0004]本發(fā)明提供了利用被吸附固定的琥珀酸放線桿菌在發(fā)酵罐中反復生產(chǎn)丁二酸的多種工藝。該方法操作簡單，有效提高了發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸過程中，琥珀酸放線桿菌的生物量，并能夠同時獲得高丁二酸的濃度，高轉(zhuǎn)化率以及高生產(chǎn)強度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種固定化發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，利用纖維床反應器固定化琥珀酸放線桿菌，獲得高的細胞濃度，提高丁二酸的產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率以及生產(chǎn)強度。具體地,是將琥拍酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)吸附固定于帶纖維材料的發(fā)酵罐裝置(即纖維床反應器)中，通過反復分批發(fā)酵、反復補料分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵或雙罐循環(huán)連續(xù)發(fā)酵工藝實現(xiàn)丁二酸的高效生產(chǎn)。[0006]所述含纖維材料的發(fā)酵罐裝置，即纖維床反應器，是以100%棉纖維材料為固定化載體，棉纖維織物厚度為0.5-2mm，孔隙率>90%，發(fā)酵罐中發(fā)酵液體積與棉纖維織物面積的比為3-6cm3/cm2，將棉纖維圍繞在圓桶狀鐵絲網(wǎng)外表面，每層棉纖維之間空隙為0.5_2mm，通過鐵絲網(wǎng)固定在發(fā)酵罐攪拌器上，使固定好的纖維床能夠跟隨攪拌轉(zhuǎn)軸同時轉(zhuǎn)動。本發(fā)明中，纖維床裝置內(nèi)徑為5-lOcm、高為10-20cm，發(fā)酵罐中發(fā)酵液體積與棉纖維織物面積的比為3-6Cm3/Cm2;具體地，是將6*60cm2的棉纖維圍繞發(fā)酵罐轉(zhuǎn)軸卷成5層，每層之間空隙為1mm，并用鐵絲網(wǎng)固定，纖維床裝置內(nèi)徑為8cm，高為12cm，并且固定好的纖維床反應器能夠隨著攪拌轉(zhuǎn)軸一同轉(zhuǎn)動。
[0007]所述棉纖維的長寬比、使用面積等，可根據(jù)所用發(fā)酵罐的具體高徑比進行調(diào)整。所述棉纖維還可以纏繞固定在發(fā)酵罐擋板上，控制發(fā)酵罐中發(fā)酵液體積與棉纖維織物面積的比為3-6cm3/cm2。非攪拌狀態(tài)發(fā)酵時，棉纖維織物可以卷成若干個桶裝小卷懸浮于發(fā)酵液中，控制發(fā)酵罐中發(fā)酵液體積與棉纖維織物總面積的比為3-6cm3/cm2。
[0008]所述琥珀酸放線桿菌的吸附培養(yǎng)是將搖瓶種子在厭氧培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)10_14h，培養(yǎng)溫度為35-40°C。將種子培養(yǎng)基(培養(yǎng)基裝液量為2L，使纖維床浸沒在種子培養(yǎng)基中，能夠大量吸附菌體)裝入纖維床反應器中，按0.5-10% (v/v)的接種量接入琥珀酸放線桿菌搖瓶種子，并于35-40°C，在通N2或CO2的厭氧條件下，培養(yǎng)吸附6-10h，攪拌轉(zhuǎn)速70-120rpm/min。種子培養(yǎng)基組成為:葡萄糖5_15g/L，酵母膏10_20g/L(或玉米漿15_30g/L), K2HP0415-20g/L, NaH2P045_10g/L，pH 自然，115_121°C滅菌 20_30min。
[0009]所述利用固定化琥珀酸放線桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸:`[0010]琥珀酸放線桿菌在纖維床反應器中培養(yǎng)吸附后，將反應器中種子培養(yǎng)液由蠕動泵抽出，并更換為新鮮的1.6L發(fā)酵培養(yǎng)基。通入N2或CO2維持厭氧環(huán)境，控制發(fā)酵溫度35-40°C，攪拌轉(zhuǎn)速150-200rpm/min，用碳酸鹽控制pH在5.8-7.2。所用的碳酸鹽為10-50%(w/v)的碳酸鈉或碳酸氫鈉或10-40% (w/v)的碳酸鎂。
[0011]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:葡`萄糖30-150g/L，玉米漿15-35g/L，K2HPO4L 5_3g/L，NaH2PO4L 5_3g/L，谷氨酸鈉 0.05_2g/L，蛋氨酸 0.01-0.5g/L，Na2S0.01-lg/L，pH 調(diào)至
6.0-6.5，115-121°C滅菌，20-30min。
[0012]所述利用固定化琥珀酸放線桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸可采用反復分批發(fā)酵、反復補料分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵或纖維床反應器-雙罐循環(huán)連續(xù)發(fā)酵。
[0013]所述用纖維床反應器反復分批發(fā)酵時，發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖濃度為50_100g/L，發(fā)酵時間10_32h，當發(fā)酵液中葡萄糖濃度低于l_5g/L時，放料并更換新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，重復進行下一批次發(fā)酵，反復發(fā)酵批次8-15次，總運行時間100-200h，期間保證無菌操作。
[0014]所述用纖維床反應器反復補料分批發(fā)酵時，發(fā)酵培養(yǎng)基初始糖濃度為30_50g/L，發(fā)酵8-20h，當發(fā)酵液中葡萄糖濃度在5-15g/L以下時，用蠕動泵一次性補加葡萄糖40-60g/L，當發(fā)酵液中葡萄糖濃度再次降為l-5g/L以下時，放料更換新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基。重復上述過程，進行下一批次發(fā)酵?？傔\行時間200-300h，期間保證無菌操作。
[0015]所述用纖維床反應器進行連續(xù)發(fā)酵時，發(fā)酵培養(yǎng)基初始糖濃度為60_90g/L，在發(fā)酵液葡萄糖濃度降低為5-10g/L時，以稀釋速率0.01-0.3/h開始連續(xù)發(fā)酵。
[0016]所述纖維床反應器-雙罐循環(huán)連續(xù)發(fā)酵，循環(huán)連續(xù)發(fā)酵裝置由纖維床反應器、循環(huán)罐、蠕動泵及橡膠軟管組成，循環(huán)罐的體積為纖維床反應器體積的0.5-5倍。當用等體積的循環(huán)罐進行纖維床反應器-雙罐循環(huán)連續(xù)發(fā)酵時，琥珀酸放線桿菌先吸附固定在纖維床反應器中，發(fā)酵開始時，利用蠕動泵60-100mL/min的速率在兩罐之間循環(huán)發(fā)酵培養(yǎng)基，進行發(fā)酵。循環(huán)罐的裝液量與纖維床反應器的發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量均為1.6L，循環(huán)罐的攪拌轉(zhuǎn)速為200rmp/min,纖維床反應器的攪拌轉(zhuǎn)速為120rmp/min,其余條件二者均相同。發(fā)酵培養(yǎng)基初始糖濃度為80-100g/L，當發(fā)酵液糖濃度降為5-15g/L時，開始連續(xù)發(fā)酵，新鮮培養(yǎng)基以0.05-0.6/h的稀釋率由蠕動泵泵入纖維床反應器，發(fā)酵液從循環(huán)罐中流出。
[0017]利用纖維床反應器固定化發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的菌株包括了已報道的產(chǎn)丁二酸的玻拍酸放線桿菌及其突變株，如 Actinobacillus succinogenes 130Z> Actinobacillussuccinogenes CGMCCl593> Actinobacillus succinogenes CGMCC2650、Actinobacillussuccinogenes CGMCC2653、Actinobacillus succinogenes CCTCC N0:M2012036 等。
[0018]本發(fā)明以棉纖維材料為固定化載體，固定琥珀酸放線桿菌用于生產(chǎn)丁二酸，固定化的微生物可反復多次用于生產(chǎn)丁二酸，結合反復分批發(fā)酵、反復補料分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵或雙罐循環(huán)連續(xù)發(fā)酵的工藝，真正實現(xiàn)了丁二酸生產(chǎn)的高轉(zhuǎn)化率、高生產(chǎn)強度和高產(chǎn)酸率。轉(zhuǎn)化率最高達90%，生產(chǎn)強度最高為4.27g/L/h，丁酸產(chǎn)量最高為98.7g/L。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1纖維床反應器雙罐循環(huán)連續(xù)發(fā)酵裝置圖；1，纖維床反應器；2，循環(huán)罐；3，蠕動泵；4，蠕動泵；5，蠕動泵；6，蠕動泵；7，pH電極；8，pH控制器；9，蠕動泵；10，0.22 μ m氣體濾膜；11，PH調(diào)節(jié)劑儲罐；12，產(chǎn)物收集瓶；13，培養(yǎng)基補料瓶；14，C02/N2混合氣瓶。
【具體實施方式】
[0020]以下是說明本發(fā)明的實例，但不局限于這些實例。
[0021]產(chǎn)物分析方法:采用HPLC分析發(fā)酵液中產(chǎn)物的成分，如用使用美國Waters高效液相色譜儀(Empower2色譜工作站、Waters2707自動進樣器、Waters 1525泵以及Waters2414RI檢測器)，Bio-Rad Aminex HPX-87H離子色譜柱,柱溫55°C,流動相為3mM稀硫酸，流速0.5mL/min, RI檢測器溫度35°C，進樣量為10mL。
[0022]實施例1分批發(fā)酵
[0023]在3L發(fā)酵罐纖維床反應器裝置:取纖維床載體(織物的厚度在1mm，孔隙率>95%)，表面積為60X6cm2，將其纏繞到發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)軸上，頂部用攪拌漿固定，用不銹鋼鐵絲網(wǎng)固定，鐵絲網(wǎng)孔徑約為2.5X2.5cm2,并且不影響攪拌。纖維床的直徑約為Ilcm,高為16cm,115-121 °C 空消 20min，過夜后再 121°C 空消 20min ；
[0024]A.succinogenes CCTCC N0:M2012036搖瓶種子在厭氧培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度為38°C。將種子培養(yǎng)基裝入纖維床反應器中，按2.5%的接種量接入琥珀酸放線桿菌搖瓶種子，并于38°C,在通N2與CO2混合氣體的厭氧條件下,培養(yǎng)吸附6h,攪拌轉(zhuǎn)速70rpm/min。種子培養(yǎng)基組成為:葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，K2HP0420g/L，NaH2P0410g/L，pH自然，121°C 滅菌 20min。
[0025]培養(yǎng)吸附后，反應器中種子培養(yǎng)液由蠕動泵抽出，并更換為新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖分別為34、55、85g/L，玉米漿25g/L，K2HP042.5g/L, NaH2P042.5g/L，谷氨酸鈉 2g/L，蛋氨酸 0.01g/L，Na2S2g/L，pH 調(diào)至 6.2，121°C滅菌，20min。通入 N2 或 CO2 維持厭氧環(huán)境，控制發(fā)酵溫度38°C,攪拌轉(zhuǎn)速150rpm/min,用碳酸鹽控制pH在5.8-6.2,每次加入碳酸鹽為15g/L的固體碳酸鎂。
[0026]表I不同初糖濃度下固定化纖維床反應器生產(chǎn)丁二酸
【權利要求】
1.以棉纖維材料固定琥拍酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，是將琥珀酸放線桿菌吸附固定于纖維床反應器中，通過反復分批發(fā)酵、反復補料分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵或雙罐循環(huán)連續(xù)發(fā)酵工藝實現(xiàn)丁二酸的高效生產(chǎn)。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于，所述纖維床反應器是帶有纖維材料的發(fā)酵罐裝置，是以100%棉纖維材料為固定化載體，棉纖維織物厚度為0.5-2mm，孔隙率>90%，發(fā)酵液體積與棉纖維織物面積的比為3-6cm3/cm2，將棉纖維圍繞在圓桶狀鐵絲網(wǎng)外表面，每層棉纖維之間空隙為0.5-2mm，然后通過鐵絲網(wǎng)固定在發(fā)酵罐攪拌器上，使固定好的纖維床能夠跟隨攪拌轉(zhuǎn)軸同時轉(zhuǎn)動。
3.根據(jù)權利要求2的方法，其特征在于，所述棉纖維的長寬比、使用面積等，可根據(jù)所用發(fā)酵罐的高徑比進行調(diào)整；所述棉纖維還可以纏繞固定在發(fā)酵罐擋板上，控制發(fā)酵液體積與棉纖維織物面積的比為3-6cm3/cm2 ;非攪拌狀態(tài)發(fā)酵時，棉纖維織物可以卷成若干個桶裝小卷懸浮于發(fā)酵液中，控制發(fā)酵液體積與棉纖維織物總面積的比為3-6cm3/cm2。
4.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于，所述吸附固定琥珀酸放線桿菌是在纖維床反應器中裝入種子培養(yǎng)基，按0.5-10%的接種量接入琥珀酸放線桿菌搖瓶種子，并于35-40°C，在通N2或CO2的厭氧條件下，培養(yǎng)吸附6-10h，攪拌轉(zhuǎn)速70-120rpm/min ;所述種子培養(yǎng)基含葡萄糖 5-15g/L，酵母膏 10-20g/L，K2HP0415_20g/L，NaH2P045_10g/L，pH 自然，115-121°C滅菌20-30min ;所述酵母膏10_20g/L可用玉米漿15_30g/L代替。
5.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于，所述用固定化琥珀酸放線桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸是在固定了琥珀酸放線桿菌的纖維床反應器中，更換新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，通隊或0)2維持厭氧環(huán)境，發(fā)酵溫度35-40°C，攪拌轉(zhuǎn)速150-200rpm，用碳酸鹽控制pH5.8-7.2，以反復分批或反復補料分批、連續(xù)發(fā)酵或纖維床反應器-雙罐循環(huán)連續(xù)發(fā)酵的方式進行發(fā)酵產(chǎn)酸。
6.根據(jù)權利要求5的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖30-150g/L，玉米漿 15-35g/L, K2HPO4L 5_3g/L，NaH2PO4L 5_3g/L，谷氨酸鈉 0.05_2g/L，蛋氨酸 0.01-0.5g/L, Na2S0.01-2g/L, pH 調(diào)至 6.0-6.5，115_121°C滅菌，20_30min。
7.根據(jù)權利要求1或5的方法，其特征在于，所述反復分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖濃度為50-100g/L，發(fā)酵時間10-32h，當發(fā)酵液中葡萄糖濃度低于l_5g/L時，放料并更換新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，重復進行下一批次分批發(fā)酵。
8.根據(jù)權利要求1或5的方法，其特征在于，所述反復補料分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基初始糖濃度為30-50g/L，當發(fā)酵液中葡萄糖濃度降至5-15g/L以下時，用蠕動泵一次性補加葡萄糖40-60g/L，當發(fā)酵液中葡萄糖濃度再降為l-5g/L以下時，更換新鮮培養(yǎng)基，重復進行下一批次補料分批發(fā)酵。
9.根據(jù)權利要求1或5的方法，其特征在于，所述連續(xù)發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基初始糖濃度為60-90g/L,在發(fā)酵液葡萄糖濃度降低為5-10g/L時，以稀釋速率0.01-0.3/h開始連續(xù)發(fā)酵。
10.根據(jù)權利要求1或5的方法，其特征在于，所述雙罐循環(huán)連續(xù)發(fā)酵是將琥珀酸放線桿菌先吸附固定于纖維床反應器中，發(fā)酵培養(yǎng)基用蠕動泵以60-100mL/min的速率在兩罐之間循環(huán)，發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖初始濃度為80-100g/L ;當發(fā)酵液糖濃度降為5-15g/L時，新鮮培養(yǎng)基以0.05-0.6/h的稀釋率由蠕動泵泵入纖維床反應器，開始連續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵液從循環(huán)罐中流出。
【文檔編號】C12P7/46GK103436561SQ201310401535
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月5日 優(yōu)先權日:2013年9月5日
【發(fā)明者】鄭璞, 顏強 申請人:江南大學