豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌快速診斷試紙條的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌外溶血毒素ApxI快速診斷試紙條的制備方法，涉及一種生物快速檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。包括分析膜(5)和金標(biāo)抗體結(jié)合墊(1)，分析膜(5)上用抗放線桿菌外毒素ApxI/ApxIV單克隆抗體做為檢測線1(T1)和檢測線2(T2)以及羊抗兔IgG做為質(zhì)控線(C)，金標(biāo)抗體結(jié)合墊(1)上是p380-ApxI-ApxIV的融合蛋白抗兔多克隆抗體。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的檢驗速度慢、靈敏度低、操作復(fù)雜等問題。
【專利說明】豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌快速診斷試紙條的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物快速檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌外溶血毒素ApxI快速診斷試紙條的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬傳染性胸膜肺炎是由豬胸膜肺炎放線桿菌引起的一種豬的高度接觸性傳染病，也是當(dāng)代國際公認(rèn)危害現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)五大重要傳染病之一，也是當(dāng)今大型養(yǎng)豬場的三大呼吸道傳染病之一。在臨床剖檢上主要以肺出血、壞死和纖維素性滲出為主要病變，急性病例病死率高。本病發(fā)病季節(jié)明顯，在氣溫較低的冬季、早春晚秋等氣候惡劣的時節(jié)多發(fā)。任何年齡的豬對本病均易感，其中3月齡最易感。感染了胸膜肺炎放線桿菌的豬，在臨床上常易繼發(fā)其他細(xì)菌性疾病如副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌等，還有支原體、豬繁殖于呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)及偽狂犬病病毒(PRV)等，引起復(fù)雜的呼吸道綜合癥，加重對感染豬只的危害。
[0003]豬胸膜肺炎放線桿菌引起豬傳染性胸膜肺炎主要與較多的毒力因子有關(guān)，包括脂多糖(LPS)、外膜蛋白(OMP)、轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白(TBP)、莢膜(CP)、溶血外毒素(Apx)等這些毒力因子都能引起胸膜肺炎的發(fā)生。其中的Apx是一種對肺泡巨噬細(xì)胞起毒性作用的物質(zhì)，可抑制肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬活性，同時，Apx對外周單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞也有細(xì)胞毒性作用，被認(rèn)為是引起感染并使肺組織嚴(yán)重?fù)p傷的主要原因。Apx分為Apxl、Apx II> ApxIII>ApxIV四種不同型的毒素，ΑρχΙ、Αρχ ΙΚΑρχΙΠ是引起疾病臨床癥狀的出現(xiàn)以及典型的肺部病變必需物質(zhì)，被公認(rèn)為引起豬傳染性胸膜肺炎的主要毒力因子。對臨床疾病診斷有重要意義。
[0004]ApxI是引起豬傳染性胸膜肺炎疾病臨床癥狀的出現(xiàn)以及典型的肺部病變主要毒力因子，但在診斷方法特異性差，很難檢測完APP所有血清型，因與其他放線桿菌如豬放線桿菌、羅斯放線桿菌、豬扁桃體放線桿菌等存在交叉反應(yīng)。而APP所有血清型都分泌ApxIV，ApxIV的種間特異性很強，在其它種屬的放線桿菌和其它能分泌Apxl、ApxI毒素的革蘭氏陰性桿菌中則均檢測不到ApxIV，也可以用以區(qū)分疫苗免疫和野毒感染。因此，本發(fā)明根ApxI和ApxIV兩者之間不同特性，采用膠體金快速免疫層析法，使用兩條檢測線和一條控制線的試紙條的方法，制備出能檢測放線桿菌外溶血毒素中ApxI的快速診斷紙條。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)中，豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌檢測試紙條存在檢驗速度慢、靈敏度低、操作復(fù)雜等缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌外溶血毒素ApxI快速診斷試紙條的制備方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的檢驗速度慢、靈敏度低、操作復(fù)雜等問題。
[0007]為解決上述問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌外溶血毒素ApxI快速診斷試紙條的制備方法，包括分析膜5和金標(biāo)抗體結(jié)合墊I，分析膜5上用抗放線桿菌外毒素ApxI/ApxIV單克隆抗體做為檢測線Tl和檢測線T2以及羊抗兔IgG做為質(zhì)控線C,金標(biāo)抗體結(jié)合墊I上是p380-Apx1-ApxIV的融合蛋白抗兔多克隆抗體。
[0008]抗豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌外毒素ApxI/ApxIV單克隆抗體通過雜交融合技術(shù)方法，篩選出豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌外毒素ApxI/ApxIV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株而獲得；融合蛋白抗兔多克隆抗體通過p380-Apx1-ApxIV的融合蛋白可溶性抗原多次免疫新西蘭大白兔而獲得。
[0009]分析膜5的材料為硝酸纖維膜,金標(biāo)抗體結(jié)合墊I的材料為玻璃纖維膜。
[0010]快速診斷試紙條的制備方法，包括以下步驟:
[0011](l)pSE380-Apx1-ApxIV融合蛋白的多克隆抗體制備:選擇健康成年公兔(2_3月齡，2-3kg)做免疫動物，將純化的His-Apx1-Apx IV融合蛋白重組蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合乳化，進多次免疫動物獲得免疫血清。
[0012](2) pSE380-Apx1、pSE380-ApxIV融合蛋白的單克隆抗體制備:將融合蛋白pE380-Apx1、pE380-ApxIV注入Balb/c小鼠中，再采用細(xì)胞融合技術(shù)進行雜交瘤陽性克隆篩選，篩選出陽性雜交瘤進行體外和體內(nèi)培養(yǎng)獲得單克隆抗體。
[0013](3)制備分析膜5:將步驟(I)制備的抗豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌外毒素ApxI/ApxIV在硝酸纖維膜上形成檢測線Tl和檢測線T2，羊抗兔IgG在硝酸纖維膜上形成質(zhì)控線C，以供備用。
[0014](4)制備金標(biāo)抗體結(jié)合墊1:采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，并采用標(biāo)記體系標(biāo)記pSE380-Apx1-ApxIV融合蛋白的多克隆抗體,將金標(biāo)抗體在與支持膜上固相化。
[0015](5)組裝試紙條:將步驟(2)的分析膜5、步驟(3)的金標(biāo)抗體結(jié)合墊1、吸水紙2、樣品墊3、PVC底板4組裝成膠體金快速檢測試紙條。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點有:(1)檢測快速，可在10_20min出結(jié)果；(2)特異性好，該試紙條與傳染性胸膜肺炎放線桿菌外溶血毒素ApxI1、ApxIII,以及其他放線桿菌如豬放線桿菌、羅斯放線桿菌、豬扁桃體放線桿菌等無交叉反應(yīng)；(3)靈敏度高；(4)穩(wěn)定性好；(5)操作簡便，快速，適合基層畜牧養(yǎng)殖者、基層畜牧技術(shù)推廣單位和畜牧動物檢疫的使用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是本發(fā)明的組裝結(jié)構(gòu)示意圖；
[0018]圖2試紙條檢測結(jié)果圖。
[0019]圖中符號說明為金標(biāo)抗體結(jié)合墊、2為吸水紙、3為樣品墊、4為PVC底板、5為分析膜、Tl為檢測線1、Τ2為檢測線2、C為質(zhì)控線。
【具體實施方式】
[0020]下面用最佳的實施例對本發(fā)明做詳細(xì)的說明。
[0021]如圖1所示，豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌外溶血毒素ApxI快速診斷試紙條的制備方法，包括分析膜5和金標(biāo)抗體結(jié)合墊I，分析膜5上用抗放線桿菌外毒素ApxI/ApxIV單克隆抗體做為檢測線Tl和檢測線T2以及羊抗兔IgG做為質(zhì)控線C，金標(biāo)抗體結(jié)合墊I上是p380-Apx1-ApxIV的融合蛋白抗兔多克隆抗體。
[0022]抗豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌外毒素ApxI/ApxIV單克隆抗體通過雜交融合技術(shù)方法，篩選出放線桿菌外毒素ApxI/ApxIV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株而獲得；融合蛋白抗兔多克隆抗體通過p380-Apx1-ApxIV的融合蛋白可溶性抗原多次免疫新西蘭大白兔而獲得。
[0023]分析膜5的材料為硝酸纖維膜,金標(biāo)抗體結(jié)合墊I的材料為玻璃纖維膜。
[0024]快速診斷試紙條的制備方法，包括以下步驟:
[0025](l)pSE380-ApxI_ApxIV融合蛋白的多克隆抗體制備:選擇健康成年公兔(2_3月齡，2-3kg)做免疫動物，將純化的His-Apx1-Apx IV融合蛋白重組蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合乳化，進多次免疫動物獲得免疫血清。
[0026](2) pSE380-Apx1、pSE380-ApxIV融合蛋白的單克隆抗體制備:將融合蛋白pE380-Apx1、pE380-ApxIV注入Balb/c小鼠中，再采用細(xì)胞融合技術(shù)進行雜交瘤陽性克隆篩選，篩選出陽性雜交瘤進行體外和體內(nèi)培養(yǎng)獲得單克隆抗體。
[0027](3)制備分析膜5:將步驟(I)制備的抗豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌外毒素ApxI/ApxIV在硝酸纖維膜上形成檢測線Tl和檢測線T2，羊抗兔IgG在硝酸纖維膜上形成質(zhì)控線C，以供備用。
[0028](4)制備金標(biāo)抗體結(jié)合墊1:采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，并采用標(biāo)記體系標(biāo)記pSE380-Apx1-ApxIV融合蛋白的多克隆抗體,將金標(biāo)抗體在與支持膜上固相化。
[0029](5)組裝試紙條:將步驟(2)的分析膜5、步驟(3)的金標(biāo)抗體結(jié)合墊1、吸水紙2、樣品墊3、PVC底板4組裝成膠體金快速檢測試紙條。
[0030]本發(fā)明有如下實施例:
[0031]實施例1Apx1、pSE380ApxIV、Apx1-ApxIV基因克隆、原核表達載體重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達及蛋白純化
[0032]I材料與方法
[0033]1.1 菌株:大腸桿菌(DH5 a /BL21)。
[0034]1.2主要試劑和儀器:LA/LB培養(yǎng)基，電泳儀，電泳槽，紫外凝膠成像系統(tǒng)，核酸蛋白分析儀，超高速冷凍離心機。
[0035]1.3 質(zhì)粒:pSE380
[0036]2實驗方法
[0037]2.1克隆豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌外毒素ApxI/ApxIV/Apx1-ApxIV基因
[0038]根椐GenBank中查找ApxI/ApxIV基因的序列，應(yīng)用Premier5.0軟件分別設(shè)計2對引物，從感染豬傳染性胸膜肺炎病豬的血清中擴增ApxI/ApxIV基因，再以ApxI/ApxIV混合PCR產(chǎn)物為模板，用Apx I基因為上游引物，Apx IV基因下游收物進行PCR擴增出Apx 1-Apx IV基因。
[0039]2.2 構(gòu)建 pSE380-Apx1、pSE380_ApxIV、pSE380_ApxI_ApxIV 原核表達載體
[0040]先將純化后的PCR擴增產(chǎn)物連接到克隆載體PMD18-T上，以酶切鑒定和測序正確的質(zhì)粒作為第二次PCR擴增的模板。重新設(shè)計引物(引入酶切位點)并合成引物，進行第二次PCR擴增，以上述同樣的方法獲得測序正確的重組質(zhì)粒。從這些重組質(zhì)粒上切下目的片段，將其亞克隆到表達載體PSE380上，再次酶切鑒定和測序，獲得各自的重組表達質(zhì)粒。
[0041]2.3pSE380-Apx1、pSE380-ApxIV、pSE380-ApxI_ApxIV 原核表達載體重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達及蛋白純化[0042]用誘導(dǎo)劑(IPTG)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化pSE380-Apx1、pSE380_ApxIV、pSE380-ApxI_ApxIV 表達載體的大腸桿菌BL21(DE3)，優(yōu)化表達條件，SDS-PAGE電泳及Western blotting檢測融合蛋白表達；在變性條件下用N1-NTA argrose介質(zhì)分離純化His_Apx1、His_ApxIV、His-Apx1-ApxIV融合重組蛋白。
[0043]實施例2pSE380-ApxI_ApxIV 多克隆抗
[0044]I材料與方法
[0045]1.1 菌株:大腸桿菌(DH5 a /BL21)。
[0046]1.2主要試劑和儀器:LA/LB培養(yǎng)基，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，佛氏完全佐劑/佛氏不完全佐劑，透析袋、電泳儀，電泳槽，紫外凝膠成像系統(tǒng)，核酸蛋白分析儀，超高速冷凍離心機。
[0047]1.3 質(zhì)粒:pSE380
[0048]1.4實驗動物:新西蘭大白兔。
[0049]2實驗方法
[0050]2.1實驗動物免疫
[0051]將制備好的Hi s-Apx1-ApxIV融合蛋白重組蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合乳劑免疫動物，選取2?3月齡，體重為2?3kg的新西蘭大白兔2只作為免疫動物，一免:
0.5mg.mL-lHis-Apx1-ApxIV融合蛋白與佛氏完全佐劑等比例混合后充分超聲波乳化,在四肢內(nèi)側(cè)皮下分點注射。3周后，進行二免，減半量Hi s-Apx1-ApxIV融合蛋白與佛氏不完全佐劑等比例混合，背部皮下多點注射，同時采血分離血清進行ELISA檢測。每隔三周，分別進行三免和四免。加免在四免后一周，大量采血，分離血清，并ELISA檢測抗體的特異性。
[0052]2.2血清抗體純化
[0053]血清抗體通過正辛硫-硫酸銨沉淀法純化，通過核酸分析儀測定，SDS-PAGE垂直電泳分析。
[0054]實施例3pSE380-Apx1、pSE380-ApxIV單克隆抗體的制備
[0055]I材料與方法
[0056]1.1實驗材料:Sp2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞，pSE380-ApxI和pSE380_ApxIV融合蛋白，大腸桿菌(DH5a/BL21);細(xì)胞培養(yǎng)皿，50mL尖底離心管，96孔酶標(biāo)板，透析袋等。
[0057]1.2實驗動物:Balb/c小鼠。
[0058]2.實驗方法
[0059]2.1試驗動物免疫
[0060]選6?7周齡的Balb/c雌性小鼠6只進行免疫。初次免疫，
0.5mg.mL-lpSE380-ApxI和pSE380_ApXIV融合蛋白分別與佛氏完全佐劑等比例混合，超聲乳化，分別在腹部皮下多點注射各3只。3周后，第2次免疫，減半量pSE380-ApxI和pSE380-ApxIV融合蛋白與佛氏不完全佐劑等比例混合，背部皮下多點注射。每隔三周分別進行第3次和第4次免疫。最后一次免疫后一周收集血液，以ELISA檢測抗體的特異性及SDS-PAEG電泳法。
[0061]2.2細(xì)胞雜交融合
[0062](I)在融合操作前24小時，將兩個70cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿里的骨髓瘤細(xì)胞用胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液脫離傳代一次(注意:此步驟非常重要)。[0063](2)次日，抽掉骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)皿里的培養(yǎng)液，分別加入5mL GENMED清理液(Reagent A)，清洗生長中的細(xì)胞表面，吸掉5mL清洗液，分別加3mL自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養(yǎng)平面置37°C培養(yǎng)箱3分鐘。
[0064](3)用手震動培養(yǎng)皿，使細(xì)胞脫落，然后分別加入IOmL GENMED清理液(ReagentA)，分別取兩種細(xì)胞懸液(骨髓瘤細(xì)胞2?5X107，再已備好小鼠脾臟細(xì)胞I X IO8)的兩個父代細(xì)胞合并到一個50mL錐形離心管，離心10分鐘，棄上清。加/入.IOmL GENMED清理液(Reagent A)，混勻后，離心IOOOr.minlO分鐘，去上清，用手指輕輕彈擊離心管外壁直至細(xì)胞顆粒群松散。
[0065](4)加入1.5mL GENMED融合液(Reagent B)，充分混勻，置于室溫下I分鐘。加入IOmL GENMED清理液(Reagent A),輕輕混勻后，離心IOOOr.1iiirr1IO分鐘，去上清。加入自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液8mL，充分混勻。
[0066](5)移入備有飼養(yǎng)層細(xì)胞96孔培養(yǎng)板中，2?4塊，每孔加200 μ L細(xì)胞融合的懸液，放進37 °C培養(yǎng)箱。
[0067](6)72小時后開始細(xì)胞篩選，直至獲得融合雜合子細(xì)胞克隆(10?14天)。
[0068]2.3陽性雜交瘤細(xì)胞的擴大培養(yǎng)
[0069]經(jīng)吹打陽性的雜交瘤細(xì)胞懸浮移到含有飼養(yǎng)層細(xì)胞的24孔板里擴大培養(yǎng)，與原孔一起加新鮮的HT培養(yǎng)基(24孔加0.5mL,原孔加0.1mL)，并在5% C02培養(yǎng)24?48小時，用ELISA檢測，對分泌抗體較穩(wěn)定較強的細(xì)胞株做重點培養(yǎng)及保存，做好編號并命名并及時凍存。
[0070]2.4有限稀釋法單克隆化
[0071]在96孔板中進行有限稀釋法單克隆化細(xì)胞培養(yǎng)，將前一天預(yù)先制備飼養(yǎng)層細(xì)胞，再進行細(xì)胞克隆化。待做克隆化的雜交瘤細(xì)胞用含20%胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋每毫升中
5、10、50個細(xì)胞，分別加入己準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，每孔100 μ L。到第二次或第三次亞克隆時，只作一個稀釋度，調(diào)整至每毫5?10個細(xì)胞，將96孔板放在37°C、5 % C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定時觀察，待細(xì)胞長到孔面積約一半時，吸半培養(yǎng)液檢測，陽性孔中的細(xì)胞繼續(xù)單克隆化，并擴大培養(yǎng)、凍存?zhèn)溆谩?br> [0072]2.5腹水的制備
[0073](I)腹水誘導(dǎo):注射雜交瘤細(xì)胞之前一兩周，將用于誘導(dǎo)腹水的每只小鼠腹腔注射IFA0.2mL/只，進行分籠并加強飼養(yǎng)管理。
[0074](2)擴大培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞株:檢測到強陽性的上清抗體雜交瘤細(xì)胞擴大培養(yǎng)至對數(shù)生長期，并用作于誘導(dǎo)腹水。
[0075](3)注射雜交瘤細(xì)胞:收集對數(shù)生長期內(nèi)的雜交瘤細(xì)胞于1000?1500r -mirT1離心5?lOmin，棄上清，用約0.5?ImL RPMI1640無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，每只小鼠1.p6?32 X IO5個雜交瘤細(xì)胞。
[0076](4)收集腹水:約7?10天后觀察Balb/c小鼠腹部，有明顯腹部腫脹者，用12號注射器針頭穿刺腹腔下側(cè)收取腹水并測定其效價，將于-80°C備用。
[0077]2.6腹水效價和特異性檢測
[0078]腹水樣品用ELISA及SDS-PAEG進行檢測分析。
[0079]2.7pSE380-ApxI和pSE380_ApxIV融合蛋白單克隆抗體腹水交叉反應(yīng)實驗同pSE380-Apx1-ApxIV融合蛋白多克隆抗體的檢測。
[0080]2.8pSE380-ApxI和pSE380_ApxIV融合蛋白單克隆抗體(腹水)純化
[0081]2.9pSE380-ApxI和pSE380_ApxIV融合蛋白單克隆抗體正辛硫-硫酸銨沉淀純化
[0082]實施例3.膠金體的制備
[0083]1.材料與方法
[0084]1.1主要試劑:HAuC14，兔抗pSE380-ApxI_ApxIV融合蛋白多克隆抗體，檸檬酸三鈉，牛血清白蛋白(BSA)，脫脂奶粉，PEG20000, K2CO3。
[0085]1.2主要儀器:高速冷凍離心機，電子臺秤，氣浴恒溫振蕩器，DK-SD型電熱恒溫水槽，紫外-可見分光分光度計。
[0086]1.3檸檬酸三鈉還原法的膠體金制備
[0087]膠體金的制備采取檸檬酸三鈉還原法，用500mL的燒杯，加入2.4mLl %的HAuCl4于240mL蒸餾水中(終濃度為0.01 % )，分別分裝于6個80mL燒杯中，各40mL。電磁爐加熱至沸騰，加入I %的檸檬酸三鈉，各為0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、lmL、l.2mL(分別標(biāo)記為:1、2、3、4、5、6號)，繼續(xù)加熱并攪拌，用肉眼觀察膠體金溶液顏色變化，等溶液由黃變黑、紫、酒紅色后再加熱5?lOmin。冷卻至室溫，各樣品用超純水補足至40mL，繼續(xù)加熱5min、冷卻、補足超純水,重復(fù)三次。
[0088]1.4膠體金紫外光掃描鑒定
[0089]用紫外-可見光分光光度儀對6種不同膠體金在400?700nm波長下進行掃描，獲得膠體金吸收光譜，并測定出最大吸收峰波的吸光值。據(jù)光譜的膠體金顆粒直徑及分布特征，制備不同直徑膠體金顆粒，對膠體金進行掃描，獲得膠體金最大吸收峰波長與粒徑在10?90nm粒徑范圍內(nèi)得出Y = 0.4271X+514.56 (r = 0.874，P < 0.01)直線回歸關(guān)方程(X為顆粒粒徑，Y為最大吸收峰波長)，按Y = 0.4271X+514.56方程可算出各膠體金顆粒直徑大小。再把6種不同的膠體金溶液靜置于4°C一段時間，在不同的時間段檢查膠體金溶液的顏色變化和顆粒沉淀情況，選出一種較穩(wěn)定的膠體金標(biāo)記抗體用。
[0090]1.5最適宜抗體蛋白結(jié)合量
[0091]通過Mey氏穩(wěn)定化試驗方:取20mL膠體金溶液用0.1moL/L K2CO3調(diào)節(jié)pH值，用14個1.5mL EP管分別取ImL膠體金溶液，再用不同濃度的兔抗白pSE380-ApX1-ApXIV融合蛋白多克隆抗體進行標(biāo)記，每種濃度的做7個樣，室溫攪拌30min后加入0.1mLlO%NaCI溶液，室溫靜置一兩小時，觀察膠體金一抗體溶液的顏色，再進紫外分光度掃描測定520nm/580nm的OD值，選出制備金標(biāo)抗最佳的抗體量。
[0092]1.6抗體蛋白與膠體金結(jié)合最適宜pH值的選擇
[0093]通過Mey氏穩(wěn)定化試驗:取8個1.5mL EP管,各加入ImL膠體金,分別用0.1moL/L K2C03調(diào)pH為5、6、7、8、9、10、11、12后，每個pH做7樣，每管各加入濃度為30 μ g/ml的兔抗pSE380-ApX1-ApXIV融合蛋白多克隆抗體100 μ L，攪拌30min后各管分別加入
0.1mLlO% NaCl液體，室溫下靜置I?2h，觀察其顏色變化，再用紫外分光光度計掃描測定各管520nm/580nm的OD值，選出最佳制備金標(biāo)抗的pH值。
[0094]1.7抗體一膠體金復(fù)合物穩(wěn)定劑的選擇
[0095]為了防止金標(biāo)抗體在長時間內(nèi)發(fā)生聚沉，將標(biāo)記好的金標(biāo)抗體復(fù)合物分別選用BSA、PEG20000作穩(wěn)定劑，并比較它們之間使用的效果，選擇金標(biāo)抗體發(fā)生沉淀最少的做為本實驗的穩(wěn)定劑。其方法:用3個1.5mL EP管,分別加入ImL已配制好金標(biāo)抗體溶液,分別加入穩(wěn)定劑 10% BSAlOO μ L ；10%PEG20000100 μ L ；10% BSA50 μ L+10% PEG2000050 μ L放置一段時間，顏色仍保持紅色，不聚沉或聚沉較少的為最佳穩(wěn)定劑。
[0096]1.8膠體金復(fù)合物緩沖液的選擇
[0097]選用不同的緩沖液稀釋已標(biāo)記的抗體膠體金復(fù)合物，選出有利于保持膠體金復(fù)合物狀態(tài)穩(wěn)定的緩沖液，本實驗選配制三種膠體金抗體緩沖液。比較這三種緩沖液的穩(wěn)定性及膠體金顆粒聚沉情況，通過正交設(shè)計進行實驗，選出最佳的膠體金-抗體復(fù)合物緩沖液。
[0098]實施例5試紙條組成及臨床應(yīng)用
[0099]1.材料與方法
[0100]1.1血清型1，5，9，10和11型APP菌的毒素(本實驗自已提取)
[0101]1.2主要試劑及耗材:硝酸纖維素膜(NC膜)、玻璃纖維素膜、PVC板等耗材。
[0102]2.實驗方法
[0103]2.1斑點金免疫滲濾試驗
[0104]用斑點金免疫滲濾試驗確定單克隆抗體及羊抗兔IgG包被量，用抗pSE380-ApxI和pSE380-ApxIV融合蛋白 單克隆抗體做檢測線⑴以及羊抗兔IgG做為質(zhì)控線(C)，用的PBS(0.01mol/L pH7.4)緩沖液將抗體按1: O~1: 128倍比數(shù)稀釋，各取2 μ L點樣于
0.45微孔濾膜上，滲入濾膜后形成斑點。待抗體完全充分干燥。將濾膜浸泡于5%脫脂奶粉中，室溫封閉I~2h后。用PBST洗膜2~3次，每次3~5min。然后將洗好的濾膜用吸水濾紙吸干水，再放置一段時間使膜完全干燥后，滴加pSE380-ApxI和pSE380_ApXIV融合蛋白懸液(IXlO5Cfi^mr1)與金標(biāo)抗體結(jié)合物，室溫靜置數(shù)分鐘。待出現(xiàn)紅色斑點為止。然后在室溫下用PBST洗滌液振蕩洗滌4次，每次3~5min。
[0105]2.2分析膜預(yù)處理
[0106]NC膜(分析膜)首先用0.4%的甘油浸泡半小時后，置于37°C烘干箱中脫水干燥2小時以固定蛋白。
[0107]2.3分析膜封閉液的優(yōu)化
[0108]以0.01mol/L PBS緩沖體系配制2種不同的封閉液以不同的濃度(1%、2%、3%、
脫脂奶粉，BSA)分別對分析膜封閉lh，再滴加膠體金溶液，
根據(jù)NC膜上背景顯色情況選擇封閉液。
[0109]2.4分析膜干燥方式選擇
[0110]將用pSE380-ApxI和pSE380_ApXIV融合蛋白單克隆抗體和羊抗兔IgG作分別T線和C線包被在NC膜上作為分析膜，經(jīng)過封閉和洗滌處理后的NC膜，在其條件不變情況下，將它分別置37°C、室溫和4°C干燥，觀察顯色變化。
[0111]2.3膠體金-抗體復(fù)合物結(jié)合墊的制備
[0112]將玻璃纖維膜剪成規(guī)格大小一樣的小塊(0.7X10.0cm)作為結(jié)合墊，然后浸泡于膠體金一抗體溶液中30min。室溫自然干燥,觀察結(jié)合墊上金標(biāo)抗體狀態(tài)。
[0113]2.4樣品墊制備
[0114]將玻璃纖維素膜(樣品墊)剪切成2X IOcm規(guī)格大小的條帶；玻璃纖維素膜浸入預(yù)處理液中(0.01mol/L ρΗ8.2 硼酸，0.5% BSA,0.1% Tween-20)于 4°C或 37°C孵育 I ~2h后，將玻璃纖維素膜取出置于烘箱中37°C充分烘干，保存?zhèn)溆谩0115]2.5分析膜的抗體包被
[0116]將NC膜做剪成規(guī)格大小一致的(2.5X10.0cm)條帶；膜從下向上Icm處，用移液槍點上抗pSE380-ApxI和pSE380-ApxIV融合蛋白的單克隆抗體1: 2作為檢測線(T);離檢測帶0.7cm處點上羊抗鼠1: 6作為質(zhì)控線；然后將NC膜于烘箱中37°C充分烘干，5%脫脂奶粉中37°C封閉I?2h或4°C過夜，取出干燥保存?zhèn)溆谩?br> [0117]2.6吸水墊制備
[0118]用濾紙當(dāng)作吸水墊，將它剪成規(guī)格大小一致(0.5X2cm)的條帶，置于干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?br> [0119]2.7試紙條組裝
[0120]將已處理好的各種固相材料，依次粘附于有底板上，形成一個完整的試紙條，具體流程如下:
[0121](I)將有粘性底板剪成0.5 X IOcm規(guī)格大小一致的條帶。
[0122](2)將分析膜黏于底板上2?8cm處位置，檢測線在前，質(zhì)控線在后。
[0123](3)將金標(biāo)結(jié)合墊貼于粘性底板上2cm處位置，上端壓于分析膜的上端。重疊
0.5cm。
[0124](4)將樣品墊膜黏于底板上，下端壓于金標(biāo)結(jié)合墊的上端，重疊1cm。
[0125](5)吸水墊膜黏于底板上，上端壓于分析膜的下端，重疊1cm。
[0126](6)裝配成形的條帶保存于干燥的環(huán)境中檢測備用。
[0127]2.8試紙條檢測陽性結(jié)果判定
[0128]以本實驗提取ApxI作為陽性對照，0.01mol/L PBS緩沖液為陰性對照。臨床鑒定的APP的血清樣品點加在試紙條的樣品墊中，待樣品層析完畢后觀察檢測結(jié)果。在檢測應(yīng)區(qū)中，T線及C線都顯紅色條帶，則表示檢測到目的菌株，則判為陽性；若只有T線處顯紅色條帶，則未檢測到目的菌株，則判為陰性；若T線不顯紅色條帶，試紙條失效。
[0129]2.9試紙條靈敏度檢測
[0130]將提取好的ΑρχΙ，稀釋成不同濃度的液。各取300 μ L點入試紙條，每個濃度重復(fù)5次，待樣品層析完畢后觀察檢測結(jié)果。
[0131]2.10試紙條特異的性檢測
[0132]以豬放線桿菌、羅斯放線桿菌、豬扁桃體放線桿菌、大腸桿菌及多殺性巴氏桿菌感染后血清，用移液槍吸取300 μ L點入試紙條的樣品墊上，每個標(biāo)本重復(fù)3次，待樣品層析完畢后觀察。
[0133]最后應(yīng)說明的是:顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之中。
【權(quán)利要求】
1.豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌外溶血毒素ApxI快速診斷試紙條的制備方法，其特征在于，包括分析膜(5)和金標(biāo)抗體結(jié)合墊(1)，分析膜(5)上用抗放線桿菌外毒素ApxI/ApxIV單克隆抗體做為檢測線I (Tl)和檢測線2 (T2)以及羊抗兔IgG做為質(zhì)控線(C)，金標(biāo)抗體結(jié)合墊(I)上是p380-Apx1-ApxIV的融合蛋白抗兔多克隆抗體。
2.如權(quán)利要求1所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌外溶血毒素ApxI快速診斷試紙條的制備方法，其特征在于，抗放線桿菌外毒素ApxI/ApxIV單克隆抗體通過雜交融合技術(shù)方法，篩選出放線桿菌外毒素ApxI/ApxIV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株而獲得；融合蛋白抗兔多克隆抗體通過p380-Apx1-ApxIV的融合蛋白可溶性抗原多次免疫新西蘭大白兔而獲得。
3.如權(quán)利要求1或2所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌外溶血毒素ApxI快速診斷試紙條的制備方法，其特征在于，分析膜(5)的材料為硝酸纖維膜，金標(biāo)抗體結(jié)合墊(I)的材料為玻璃纖維膜。
4.如權(quán)利要求1或2所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌外溶血毒素ApxI快速診斷試紙條的制備方法，其特征在于，快速診斷試紙條的制備方法，包括以下步驟: (1)pSE380-ApX1-ApXIV融合蛋白的多克隆抗體制備:選擇健康成年公兔(2_3月齡，2-3kg)做免疫動物，將純化的Hi s-Apx1-ApxIV融合蛋白重組蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合乳化，進多次免疫動物獲得免疫血清。 (2)pSE380-Apx1、pSE380-ApxIV融合蛋白的單克隆抗體制備:將融合蛋白pE380-Apx1、pE380-ApxIV注入Balb/c小鼠中，再采用細(xì)胞融合技術(shù)進行雜交瘤陽性克隆篩選，篩選出陽性雜交瘤進行體外和體內(nèi)培養(yǎng)獲得單克隆抗體。 (3)制備分析膜(5):將步驟⑴制備的抗放線桿菌外毒素ApxI/ApxIV在硝酸纖維膜上形成檢測線I (Tl)和檢測線2 (T2)，羊抗兔IgG在硝酸纖維膜上形成質(zhì)控線(C)，以供備用。 (4)制備金標(biāo)抗體結(jié)合墊(I):采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，并采用標(biāo)記體系標(biāo)記pSE380-Apx1-ApxIV融合蛋白的多克隆抗體,將金標(biāo)抗體在與支持膜上固相化。 (5)組裝試紙條:將步驟(2)的分析膜(5)、步驟(3)的金標(biāo)抗體結(jié)合墊(I)、吸水紙(2)、樣品墊(3)、PVC底板(4)組裝成膠體金快速檢測試紙條。
【文檔編號】G01N33/577GK103777018SQ201410030295
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月16日
【發(fā)明者】劉平, 胡國良, 郭小權(quán), 曹華斌, 劉佩, 李麟, 張彩英, 黃愛民, 羅軍榮 申請人:江西農(nóng)業(yè)大學(xué)