豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌elisa檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本實用新型涉及一種檢測豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的器具，特別是涉及一種定量檢測豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ELI SA檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]豬傳染性胸膜肺炎(Porcine Contag1us pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放線桿菌(ActinobaciI Ius pleuropneumoniae，App)引起的以胸膜肺炎和出血性壞死性肺炎為主要特征的豬的呼吸道傳染病，本病是國際上公認的危害現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的五大疾病之一，給各國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟虧損失。近年來該病在我國的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，越來越受到人們的重視。
[0003]本病由于可引起敗血癥且呼吸高度困難，表現(xiàn)典型癥狀的急性死亡豬可見到兩側對稱性肺炎，胸膜粘連，肺炎部位質度較硬，切面脆弱，氣管內(nèi)充滿泡沫狀血樣粘性滲出物，慢性病例易繼發(fā)其他疾病，導致生長遲緩，料肉比增高，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的危害。
[0004]App感染可造成急性死亡，生長緩慢，導致養(yǎng)豬行業(yè)的重大損失。對于該病的診斷，除非出現(xiàn)特征性胸膜肺炎變化，否則確診還需要借助實驗室診斷技術，目前，用于App檢測的方法主要有細菌分離鑒定、協(xié)同凝集試驗、瓊脂擴散試驗、瑩光抗體技術、補反試驗、補體結合試驗、間接血凝試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、單克隆抗體、聚合酶鏈式反應(PCR)擴增毒素APX基因和外膜蛋白OMIA基因來進行分型。這些方法中，細菌的分離鑒定雖然較為準確，但由于App培養(yǎng)條件要求較高，并且該方法消耗時間過長，臨床診斷難以推廣。血清學方法操作繁鎖，且很難判斷疫苗抗體和自然感染。分子生物學診斷技術中，PCR方法易出現(xiàn)假陽性結果，且在一般豬場難以推廣應用。另外，App血清型的多樣性限制了針對所有血清型App診斷方法的建立。所以迫切需要建立一種省時省力并能檢測所有血清型的檢測方法。尋找能在所有血清型App中都存在的菌體結構成分或其它組分，并用來建立種特異性診斷方法是該領域研究科學家的目標。
[0005]鞭毛是細菌的一種特殊結構，約半數(shù)的桿菌、極少數(shù)球菌和所有的螺旋菌及弧菌都有鞭毛，鞭毛不但與細菌的運動有關，而且在細菌的感染與免疫及細菌分類鑒定等方面發(fā)揮重要作用。由于研究技術的限制，人們最早研究鞭毛是從它的染色方法開始的，隨著現(xiàn)代分子生物學技術的飛速發(fā)展，人們開始從基因水平來研究鞭毛作為運動器官的分子機制及其毒力相關基因，這方面研究較多的是鞭毛蛋白的中央?yún)^(qū)段和flic基因。Maynarelli等根據(jù)萊姆病疏螺旋體鞭毛蛋白氨基酸序列同其它菌株鞭毛蛋白有很高的同源性，尤其是N端和C端(但在其中央?yún)^(qū)，氨基酸序列及長度差別很大)，構建了重組鞭毛蛋白中央?yún)^(qū)，并以此為抗原診斷萊姆病，其敏感性及特異性均優(yōu)于全細胞抗原診斷方法。呂冰等對中國萊姆病螺旋體(Borrilia garinii)基因種參考菌株PD91的鞭毛蛋白中央?yún)^(qū)編碼基因進行克隆表達，證明重組蛋白具有抗原性，為我國萊姆病的血清學診斷提供了幫助。Wei等曾經(jīng)報導，沙門氏菌的鞭毛蛋白基因的末端區(qū)域有很高的保守性，對鞭毛的運動起調節(jié)作用，而中央?yún)^(qū)的保守性很低，一般認為它與鞭毛蛋白抗原的可變性有關?！緦嵱眯滦蛢?nèi)容】
[0006]本實用新型的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。
[0007]本實用新型還有一個目的是提供一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ELISA檢測試劑合
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[0008]為此，本實用新型提供的技術方案為:
[0009]—種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ELISA檢測試劑盒，包括:
[0010]板體，其具有多個檢測孔，所述檢測孔內(nèi)容納有待檢測樣品；
[0011 ]第一結合層，其包被于所述板體的每個檢測孔的內(nèi)壁上，且位于所述檢測孔內(nèi)壁與所述待檢測樣品之間，所述第一結合層結合待檢測樣品，并于其上形成樣品層；以及，
[0012]第二結合層，其與所述樣品層結合，并且位于所述樣品層的上方。
[0013]優(yōu)選的是，所述的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ELISA檢測試劑盒中，所述板體為酶標板。
[0014]優(yōu)選的是，所述的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ELISA檢測試劑盒中，所述板體上還設置有陰性對照孔和陽性對照孔，所述陰性對照孔內(nèi)容納有胸膜肺炎放線桿菌培養(yǎng)基，所述陽性對照孔內(nèi)容納有胸膜肺炎放線桿菌，所述陰性對照孔和所述陽性對照孔的內(nèi)壁上也均設置有所述第一結合層；
[0015]所述陰性對照孔、所述陽性對照孔和所述檢測孔構成加樣孔。
[0016]優(yōu)選的是，所述的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ELISA檢測試劑盒中，所述第一結合層為第一抗體層，所述第一抗體為胸膜肺炎放線桿菌鞭毛蛋白的多克隆抗體或單克隆抗體；
[0017]所述第二結合層為第二抗體層，所述第二抗體為所述胸膜肺炎放線桿菌鞭毛蛋白的單克隆抗體或多克隆抗體，且所述第一抗體和第二抗體與所述胸膜肺炎放線桿菌鞭毛蛋白結合的位點不同。
[0018]優(yōu)選的是，所述的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ELISA檢測試劑盒中，所述第一抗體為所述胸膜肺炎放線桿菌鞭毛蛋白的多克隆抗體，所述第二抗體為所述胸膜肺炎放線桿菌鞭毛蛋白的單克隆抗體。
[0019]優(yōu)選的是，所述的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ELISA檢測試劑盒中，所述胸膜肺炎放線桿菌鞭毛蛋白的多克隆抗體的濃度為1.45yg/ml，所述胸膜肺炎放線桿菌鞭毛蛋白的單克隆抗體的濃度為3.12yg/ml。
[0020]優(yōu)選的是，所述的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ELISA檢測試劑盒中，所述第二抗體為酶標抗體。
[0021]優(yōu)選的是，所述的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ELISA檢測試劑盒，還包括:
[0022]封閉層，其位于所述第一結合層和所述樣品層之間。
[0023]優(yōu)選的是，所述的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ELISA檢測試劑盒中，所述封閉層由BSA形成。
[0024]優(yōu)選的是，所述的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ELISA檢測試劑盒中，還包括稀釋液、洗滌液、底物顯色液和終止液。
[0025]本實用新型至少包括以下有益效果:
[0026](I)本裝置根據(jù)雙抗體夾心ELISA的基本原理，首先對App鞭毛蛋白flic基因進行了克隆及序列分析，并實現(xiàn)了在大腸桿菌BL21中表達，利用純化后的表達蛋白分別免疫家兔和小鼠，獲得兔抗f I ic多抗和鼠抗f I ic單抗，抗體經(jīng)提純后，將兔抗f Iic多抗IgG用作一抗包被酶標板，鼠抗f Iic單抗IgG用作二抗，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附方法對App進行定量檢測。
[0027](2)本裝置檢測特異性強，敏感性高。與大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌、副豬嗜血桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌和鏈球菌等菌株等無非特異性反應。對培養(yǎng)的App從1:10開始依次進行5倍稀釋，并分別用三批不同時間包被兔血清的酶標板按前述進行檢測，本裝置能檢出稀釋度為1:101()的菌液，即低至5X101()CFU/mL的細菌，說明本裝置具有較好的敏感性。
[0028](3)該方法穩(wěn)定性強。按照本文中確定的兔血清包被濃度，按不同時間分三批包被酶標板，再用同樣的方法對其敏感性和特異性進行檢測，結果顯示，在敏感性方面，當App從1:10開始依次進行5倍稀釋時，三批中每批的OD值均有明顯的降低梯度，而且當App稀釋度〉1:6250時，三批的OD值均低于0.4。在特異性方面，5種對照細菌和培養(yǎng)基細胞對照的三批檢測結果OD值均相差不大。應用SPSS分析軟件對該ELISA檢測方法的敏感性和穩(wěn)定性進行統(tǒng)計分析，結果表明，批間變異系數(shù)為10.7%，低于15%，批內(nèi)變異系數(shù)為6.0%，小于10%，表明該裝置具有較好的重復性和穩(wěn)定性。
[0029](4)減少投資和檢測成本。使用該檢測方法，不需另配其它儀器、設備和試劑，節(jié)省大量儀器、設備和附加試劑費用；專業(yè)和非專業(yè)人士均可隨時隨地進行現(xiàn)場檢測，節(jié)省檢測成本，檢測費用低。
[0030](5)應用范圍廣，便于普遍推廣應用。用本研究建立的雙抗體夾心ELISA方法對90份被檢病料進行檢測，結果有40份的0D63Q>0.4，且P/N>2，陽性率為44.4%，說明許多豬場普遍存在App感染。在45份被檢母豬鼻拭子中有33份呈陽性，占總陽性豬的82.5 %，被檢母