專利名稱：一種不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌ClpP蛋白酶基因缺失株、其構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌ClpP蛋白酶基因缺失株、 其構(gòu)建方法及應(yīng)用，屬于細(xì)菌基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬傳染性胸膜肺炎(porcinecontagious pleuropneumonia, PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)引起的一種高度傳染性、致死性的呼吸系統(tǒng)傳染病。目前該病已在世界各國廣泛流行，造成巨大的經(jīng)濟損失，成為國際公認(rèn)的危害現(xiàn)代化養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一。隨著我國現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；?、集約化的發(fā)展，本病的發(fā)生呈爆發(fā)趨勢，有的豬場的陽性率已達(dá)到70%以上，嚴(yán)重阻礙了我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。根據(jù)APP表面莢膜(CPS)和脂多糖(LPS)抗原性的不同，可將APP分為15個血清型，血清1型又分為Ia和Ib兩個亞型，血清5型又分為fe和釙兩個亞型。目前在我國已發(fā)現(xiàn)并分離到血清型1、2、3、4、5、7、8和15等多種血清型，主要流行的血清型為1、3、5和7 型。生物被膜(Biofilm)是在生物體內(nèi)和非生物體表面集聚生長的由細(xì)菌及其產(chǎn)生的多糖蛋白復(fù)合物所形成的固定細(xì)菌群落，它是病原菌持續(xù)感染、產(chǎn)生耐藥性和免疫逃逸的重要原因之一。APP長期潛伏于豬體內(nèi)常常引起持續(xù)性感染，近年來獲得的許多臨床分離株具有多重耐藥性，并且較普遍地能形成生物被膜，被認(rèn)為在APP致病過程中發(fā)揮重要作用。生物被膜的產(chǎn)生是一個高度復(fù)雜的、由多種基因調(diào)控的動態(tài)過程，這些基因涉及到細(xì)菌的黏附、新陳代謝、群體感應(yīng)(quorum sensing)和應(yīng)激反應(yīng)(stress response)等。 近年來對病原菌應(yīng)激反應(yīng)與感染性疾病的研究發(fā)現(xiàn)，ClpP蛋白酶這一應(yīng)激蛋白是一種十分重要的毒力因子，它是ATP依賴的絲氨酸蛋白酶，調(diào)節(jié)著細(xì)菌對環(huán)境各種壓力的適應(yīng)(如熱休克、營養(yǎng)缺限、氧化應(yīng)激等)，維持細(xì)菌的形態(tài)和毒力，使其在各種環(huán)境下得到保護。研究發(fā)現(xiàn)該基因的插入突變或缺失通常會降低細(xì)菌對不良因素的承受能力，菌體生長被破壞， 存活力下降，并影響生物被膜形成，造成毒力減弱。目前雖然僅探索了少數(shù)病原菌ClpP蛋白酶的功能，但在揭示致病機理和疫苗研究中已經(jīng)顯示出極為重要的研究價值和疫苗應(yīng)用前景。鑒于上述背景，構(gòu)建在我國流行的APP血清7型ClpP蛋白酶基因缺失株，研究其遺傳特性、生長特性、毒力、對動物的致病性和免疫原性等生物學(xué)特性，為豬傳染性胸膜肺炎的防治、其它呼吸道傳染病的藥物研究以及疫苗研究奠定重要的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于獲得一種不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型ClpP 基因缺失株。
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本發(fā)明提供的一種不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型ClpP基因缺失株，是將豬胸膜肺炎放線桿菌的ClpP蛋白酶的編碼基因滅活后得到的缺失株。本發(fā)明的目的之二在于提供一種制備所述不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型clpP基因缺失株的方法，其特征在于疫苗株是通過將DNA片段Δ clpP導(dǎo)入所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型菌株經(jīng)同源重組實現(xiàn)的；所述DNA片段Δ clpP從上游至下游依次為同源臂ClpPS和同源臂ClpPX 所述同源臂ClpPS和同源臂ClpPX能與所述豬胸膜肺炎放線桿菌中的ClpP蛋白酶編碼基因的上游序列和下游序列發(fā)生同源重組、滅活所述 ClpP蛋白酶的編碼基因。在本發(fā)明的一個具體實施例中，所述ClpP蛋白酶的編碼基因如SEQ ID NO. 1所
7J\ ο在本發(fā)明的一個具體實施例中，擴增上同源臂ClpPS的引物序列如下所示ClpSF 5' -CG GAATTC (EcoR I) GGGGCGTTACTGGATGC-3，CIpSR :5，-CCATCGCTTC CGCCTTTGGA GGTTTGC-3，擴增下同源臂ClpPX的引物序列如下所示cIpXF :5，-TCCAAAGGCG GAAGCGATGG AATACGGTC-3，ClpXR 5' -CG GGATCC (BamH I) TTCTCTGCTTTAAGTGTCGGC-3，。本發(fā)明的目的之三在于提供所述的一種不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型clpP基因缺失株在制備豬傳染性胸膜肺炎疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之四在于提供一種豬傳染性胸膜肺炎疫苗，其活性成分為本發(fā)明所述的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型clpP基因缺失株。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的本發(fā)明的不含抗性標(biāo)記豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型clpP基因缺失突變菌株，衍生于中國獸藥監(jiān)察所購買的豬胸膜肺炎放線桿菌CVCC265株，將其基因組上的clpP基因缺失了 491bp，滅活clpP基因，使ClpP蛋白酶不表達(dá)。本發(fā)明的一種不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型clpP基因缺失株，分類命名為胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為=CGMCC No. 5258，保藏日期為2011年9月17日；在本發(fā)明的具體實施例中，本發(fā)明的一種不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型clpP基因缺失株，其基本構(gòu)建方法是首先以豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型(簡稱 APP-7，下同)CVCC265株為起始材料，以PCR的方法從CVCa65的基因組中擴增出clpP基因的上同源臂ClpPS和下同源臂ClpPX，采用重疊延伸PCR方法拼接clpP基因的上、下同源臂，擴增AclpP基因片段，此片段缺失了 clpP基因的491bp。而后把這個經(jīng)改造的AclpP 序列克隆至載體PUC18，最終成為同源重組載體(自殺性質(zhì)粒)pUCAclpP。采用電轉(zhuǎn)化的方法把自殺性質(zhì)粒PUC Δ clpP轉(zhuǎn)化到APP CVCC265株中，由于同源重組載體(自殺性質(zhì)粒) 不能在APP菌中自主復(fù)制，因此轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞內(nèi)的超螺旋的自殺質(zhì)粒便會被線性化。因自殺質(zhì)粒上含有受體菌基因的同源序列，它便會插入受菌體CVC(^65的染色體中，接著線性化的質(zhì)粒與clpP基因發(fā)生置換，也就是通常所說的單交換同源重組事件的發(fā)生。只有置換到CVCC265染色體上被線性化的自殺質(zhì)粒才能隨著染色體的復(fù)制而存在。把受體菌涂布在含有篩選標(biāo)記的TSA平板上，很容易的篩選出單交換子。由于單交換是整個載體序列 (含篩選藥物抗性基因)都置換到染色體上，因此，我們必須進一步篩選目的基因整合到染色體上同時又刪除載體序列的雙交換子。將獲得的同源重組單交換子經(jīng)液體培養(yǎng)后，涂布于無抗性的TSA平板上，挑取單菌落進行PCR篩選陽性同源重組雙交換子，即clpP基因缺失株APP Δ clpP。用APP Δ clpP接種動物，根據(jù)動物的臨床表現(xiàn)和存活情況分析，APP Δ clpP 毒力弱于其親本株CVCa65。本發(fā)明的主要優(yōu)點是1、本發(fā)明所用的材料為豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型CVCC265株，是購自于中國獸藥監(jiān)察所，APP血清7型菌株是目前我國流行并嚴(yán)重導(dǎo)致豬發(fā)病的優(yōu)勢血清型。因此，今后以該菌株構(gòu)建的clpP基因缺失突變菌株為基礎(chǔ)研制的疫苗會具有很強的針對性，有廣闊的市場應(yīng)用前景。2、本發(fā)明豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型clpP基因缺失突變菌株不含任何抗性標(biāo)記，完全符合我國疫苗生物安全要求。


圖1為豬胸膜肺炎放線桿菌重組自殺質(zhì)粒pUC Δ clpP的構(gòu)建流程圖；圖2為上同源臂ClpPS和下同源臂ClpPX的PCR擴增結(jié)果；圖中 1 :ClpPS(1200bp) ；2 =ClpPX(1249bp) ；M :DL2000DNAMarker圖3為Δ clpP基因的PCR拼接結(jié)果；圖中 1 Δ clpP 基因(2449bp) ；M :DL15000DNAMarker圖4為重組自殺質(zhì)粒pUC Δ clpP的PCR鑒定結(jié)果；圖中 1-3 Δ clpP ；M :DL15000DNA Marker圖5為單交換株的PCR鑒定結(jié)果；圖中 1-3 單交換株；M :DL2000DNA Marker圖6為缺失株的PCR鑒定結(jié)果；圖中M :DL2000DNAMarker ；8號為篩選的clpP基因缺失株圖7為缺失株的遺傳穩(wěn)定性實臉結(jié)果。圖中 1-10 第 1-10 代缺失株；M :DL2000DNA Marker
具體實施例方式下面結(jié)合具體實例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。本發(fā)明實施例中所涉及的材料菌種APP血清7型CVCC265株購買自中國獸藥監(jiān)察所載體和試劑pUC18質(zhì)粒、Ex Taq DNA聚合酶2U、T4DNA連接酶購自TaKafci公司。實施例1重組自殺載體pUC Δ clpP的構(gòu)建1. IClpP蛋白酶基因上、下同源臂的引物設(shè)計和PCR擴增
根據(jù)已報道的APP-7型AP76株序列(參照GenBank登錄號為CP001091. 1的基因序列)設(shè)計兩對引物分別擴增clpP基因的上同源臂ClpPS和下同源臂ClpPX，擴增片段大小分別為1200bp和lM9bp，上同源臂上游引物5’端設(shè)計EcoR I酶切位點，下同源臂下游引物5’端設(shè)計BamH I酶切位點。上述引物均由北京華大基因公司合成。豬胸膜肺炎放線桿菌重組自殺質(zhì)粒PUC Δ clpP的構(gòu)建流程圖如圖1所示。擴增上同源臂的引物序列如下ClpSF 5' -CG GAATTC (EcoR I) GGGGCGTTACTGGATGC-3，CIpSR 5，-CCATCGCTTC CGCCTTTGGA GGTTTGC-3，擴增下同源臂的引物序列如下cIpXF 5，-TCCAAAGGCG GAAGCGATGG AATACGGTC-3，ClpXR 5' -CG GGATCC (BamH I) TTCTCTGCTTTAAGTGTCGGC-3，以APP血清7型CVCC265株基因組DNA為模板分別擴增cIpP基因上、下同源臂PCR擴增反應(yīng)體系為50 μ L，其中模板DNA 10ng，上、下游引物各1 μ M，dNTP 200 μ Μ, IOXTaq buffer 10 μ L，Ex Taq DNA 聚合酶 2U(TaKaRa)。PCR 反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性 5min，94°C 60s, 55°C 60s, 72°C 90s，30 個循環(huán)，72°C IOmin0 PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收。上同源臂ClpPS和下同源臂ClpPX的PCR擴增結(jié)果如圖2所示。1. 2重疊延伸PCR方法擴增Δ clpP基因片段以上、下同源臂的PCR回收產(chǎn)物為模板，采用重疊延伸PCR方法拼接clpP基因的上、下同源臂，擴增Δ clpP基因片段，引物clpSR 5’端下劃線部分的堿基與引物clpXF斜粗體部分的堿基反向互補，引物clpXF 5’端下劃線部分的堿基與引物clpSR斜粗體部分的堿基反向互補。PCR擴增反應(yīng)體系為50 μ L，其中模板DNA 10ng，上、下游引物各1 μ M，dNTP 200 μ Μ, IOXTaq buffer 10 μ L, Ex Taq DNA 聚合酶 2U (TaKaRa)。PCR 反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性 5min，94°C 60s, 55°C 90s, 72°C 150s，30 個循環(huán)，72°C IOmin0 PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收，然后用EcoR I和BamH I進行酶切，用膠回收試劑盒回收。AclpP基因的PCR拼接結(jié)果如圖3所示。1. 3重組自殺質(zhì)粒pUC Δ clpP的構(gòu)建將純化的Δ clpP基因片段用T4DNA連接酶(TaKaRa)與經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切消化的PUC18載體相連接，16°C連接Mh，熱激轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性的克隆進行增菌并利用堿裂解法小量提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定的陽性質(zhì)粒命名為pUC AclpP,重組自殺質(zhì)粒pUC Δ clpP的PCR鑒定結(jié)果如圖4所示，對克隆的Δ clpP 基因進行測序鑒定。實施例2APP血清7型clpP基因缺失突變株的構(gòu)建將構(gòu)建的重組自殺質(zhì)粒pUCA clpP電轉(zhuǎn)化進入APP血清7型CVC(^65，在IOug/ mLAmp抗性平板上篩選單交換株陽性菌落，并在上、下同源臂內(nèi)部設(shè)計引物，進行PCR鑒定， 野生株能擴增獲得858bp片段，缺失株能擴增獲得367bp片段，單交換株能同時擴增獲得 858bp和367bp片段。單交換株的PCR鑒定結(jié)果如圖5所示。上述引物均由北京華大基因公司合成。引物序列如下cIpJDF 5' -CGTGGTGTCGCTTGAAACTC-3，
clpJDR 5' -AATTAGACCGTATTCCATCGC-3，將單交換株陽性單菌落在不含Amp抗性的TSB (1 %的煙酰胺腺嘌吟二核苷酸和 10%的馬血清)培養(yǎng)增殖后，涂布于無抗性的TSA平板，挑取單菌落，進行PCR鑒定，野生株能擴增獲得858bp片段，缺失株僅能擴增獲得367bp片段，該陽性克隆命名為APP Δ clpP。將本發(fā)明制備的clpP基因缺失突變菌株APP Δ clpP在TSB培養(yǎng)基連續(xù)傳代10次， 用PCR鑒定，若每一代的突變菌株都能擴增出367bp片段，表明本發(fā)明的突變菌株是能夠穩(wěn)定遺傳的，缺失株的PCR鑒定結(jié)果如圖6所示；若擴增出858bp片段，表明本發(fā)明的突變菌株是不能穩(wěn)定遺傳的。結(jié)果如圖7所示本發(fā)明制備的clpP基因缺失突變菌株能夠穩(wěn)定遺傳。實施例3APP Δ clpP突變株的毒力鑒定和免疫保護實驗試驗動物4_6周齡SPF級Balb/C雌鼠，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心。3. 1毒力鑒定將小鼠隨機分為二組，每組10只。具體接種方案如下第一組(試驗組)接種實施例2制備的APPAclpP，稀釋為表1中所列濃度 (CFU)，每只小鼠腹腔接種劑量0. Iml。第二組(對照組)接種豬胸膜肺炎放線桿菌CVCC265，稀釋為表1中所列濃度 (CFU)，每只小鼠腹腔接種劑量0. Iml。小鼠存活情況見表1。表權(quán)利要求
1.一種不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型ClpP基因缺失株，其特征在于 該菌株缺失了 ClpP蛋白酶的編碼基因。
2.如權(quán)利要求1所述的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型clpP基因缺失株，其特征在于 所述ClpP蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型clpP基因缺失株的方法，其特征在于缺失株是通過將DNA片段Δ clpP導(dǎo)入所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型菌株經(jīng)同源重組實現(xiàn)的；所述DNA片段AclpP從上游至下游依次為同源臂ClpPS和同源臂 ClpPX 所述同源臂ClpPS和同源臂ClpPX能與所述豬胸膜肺炎放線桿菌中的ClpP蛋白酶編碼基因的上游序列和下游序列發(fā)生同源重組、滅活所述ClpP蛋白酶的編碼基因。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述ClpP蛋白酶的編碼基因如SEQIDNO. 1 所示。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于擴增上同源臂ClpPS的引物序列如下所示 clpSF :5，-CG GAATTC (EcoR I) GGGGCGTTACTGGATGC-3，cIpSR :5，-CCATCGCTTC CGCCTTTGGA GGTTTGC-3‘ 擴增下同源臂ClpPX的引物序列如下所示 cIpXF :5，-TCCAAAGGCG GA A GCGATGG AATACGGTC-3’ clpXR 5' -CG GGATCC (BamH I) TTCTCTGCTTTAAGTGTCGGC-3，。
6.如權(quán)利要求1所述的一種不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型clpP基因缺失株，其特征在于所述的基因缺失株為胸膜肺炎放線桿菌重組菌APP Δ clpP,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏編號為CGMCCNo. 5258。
7.權(quán)利要求1、2或6中任一項所述的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型clpP基因缺失株在制備豬傳染性胸膜肺炎疫苗中的應(yīng)用。
8.一種豬傳染性胸膜肺炎疫苗，其活性成分為權(quán)利要求1、2或6中任一項所述的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型clpP基因缺失株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌ClpP蛋白酶基因缺失株及其制備方法，屬于細(xì)菌基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開的一種胸膜肺炎放線桿菌的重組菌APPΔclpP，是采用定向同源重組技術(shù)將胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropeumoniae)中的ClpP蛋白酶的編碼基因滅活得到的菌株，破壞了ClpP蛋白酶的表達(dá)。本發(fā)明得到的突變株比親本株毒力小，對動物安全，對豬傳染性胸膜肺炎疫苗的改造及配套的鑒別診斷試劑的研制提供了重要依據(jù)，對促進全球豬傳染性胸膜肺炎的根除和凈化具有十分重要的意義。
文檔編號C12R1/01GK102443552SQ20111033686
公開日2012年5月9日 申請日期2011年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月31日
發(fā)明者張艷禾, 朱曉凱, 李建軍, 李艷玲, 王春來, 謝芳 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所