專利名稱：一種用于檢測霍亂弧菌的F<sub>0</sub>F<sub>1</sub>-ATPase旋轉(zhuǎn)分子馬達傳感器試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于食品微生物快速檢測技術(shù)的一種。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的霍亂弧菌檢測方法要求對每個檢驗項目進行非選擇性增菌、選擇性增菌、分離、篩選和鑒定等步驟，一般需要4天才能出具檢測報告，嚴重影響貨物的品質(zhì)和貨架壽命。一些新的技術(shù)如PCR技術(shù)、免疫·學(xué)檢測技術(shù)、生物芯片技術(shù)等檢測方法仍依賴于傳統(tǒng)的檢測步驟，即需要進行增菌，耗時耗力，完成一次檢測通常需要幾天的時間。這樣不僅增加了實驗室的工作量，而且也不利于食品工業(yè)中生產(chǎn)流程的監(jiān)測、終產(chǎn)品的質(zhì)量控制以及政府部門對食品安全的管理和控制。
發(fā)明內(nèi)容
以受控分子馬達技術(shù)為核心，集成核酸探針識別、熒光探針標記與檢測等技術(shù)，建立了一個全新概念的快速檢測技術(shù)體系。利用ATP酶作為載體對目標物進行檢測具有靈敏度高、特異性強、快速的特點。分子馬達連接上特異的核酸探針，可以實現(xiàn)對特定食品微生物的快速、特異性、高通量的檢測。本發(fā)明可將檢測時間縮短至2天，且檢測靈敏度能達到102CFU/ml，滿足現(xiàn)有的食品微生物檢測范圍。
附圖1為分子馬達生物傳感器模式圖(其中a、b、C、α、β、δ、Υ、ε均為ATP合酶亞基)，I為ε亞基抗體，2為鏈霉親和素(Strptavidin)，3為N-biotin，4為ompff探針，5為霍亂弧菌單鏈DNA。附圖2為chix) ompW對不同種菌株的檢測結(jié)果，縱坐標表示熒光值，橫坐標表示檢測的樣本，其中I為水，2為霍亂弧菌，3為副溶血性弧菌，4為沙門氏菌，5為單增李斯特氏菌，6為大腸桿菌。附圖3為chro ompff對30株霍亂弧菌樣本的檢測結(jié)果，縱坐標表不突光值，橫坐標表示檢測的樣本，I 30為食品檢測樣本編號。
具體實施例方式根據(jù)霍亂弧菌ompW基因設(shè)計特異性核酸探針5’_caccaagaaggtgactttattgtg,其中探針的5’用生物素進行標記。將該探針通過生物素抗體連接在分子馬達上面，利用分子馬達傳感器即可對待測樣本的DNA進行檢測，當樣品為霍亂弧菌DNA時，檢測體系的熒光值會發(fā)生明顯的變化，通過這一變化即可判斷樣本為陽性。為此，我們設(shè)計了一個試劑盒，可以方便、快速對食品中的霍亂弧菌進行檢測。試劑盒組成:
權(quán)利要求
1.異性核酸探針與FtlF1-ATP合酶連接的方式:在FtlF1-ATP合酶的ε亞基上依次連接ε亞基抗體、生物素、鏈霉親和素、生物素標記的ompW探針。
2.劑盒檢測體系的反應(yīng)條件:37°C恒溫搖床中溫育20min。
3.成buffer、啟動buffer、PBS的配方。合成buffer:甘油20%,氯化鎂5mM, Tricine50mM,憐酸氫二鉀 5mM ;啟動 buffer:ADP (2.2mM):上述合成 buffer = 1: 6 (v/v) ；PBS:137mM氯化鈉，2.7mM氯 化鉀，IOmM磷酸氫二鈉，2mM磷酸二氫鉀。
全文摘要
一種用于檢測霍亂弧菌的F0F1-ATPase旋轉(zhuǎn)分子馬達傳感器試劑盒屬于食品微生物快速檢測領(lǐng)域，主要解決傳統(tǒng)檢測方法時間過長(約5天)。本發(fā)明的核心技術(shù)是利用載色體Chromatophore上的F0F1-ATPase分子馬達生物傳感器，F(xiàn)0F1-ATP合酶由于能快速地旋轉(zhuǎn)，通過旋轉(zhuǎn)它建立了催化位點與質(zhì)子轉(zhuǎn)運之間的偶聯(lián)。首先在ATP合酶的ε亞基上連接ompW探針，將待測樣品和陰性對照分別與生物傳感器結(jié)合后，比較其催化ATP合成20分鐘后的ATP產(chǎn)生量，ATP合成的多寡可以通過環(huán)境中H+的量進行測量，而H+的多寡通過H-DHPE所體現(xiàn)的熒光強度大小來獲得。本試劑盒可對待測樣本中的霍亂弧菌進行快速、靈敏、高通量的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK103088111SQ201110336039
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月31日
發(fā)明者張捷, 張惠媛, 張昕, 盧曉宇, 汪琦, 陸琳, 張雷, 劉巖, 顧德周, 陳廣全 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局