一種耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株及其制備方法，在確定產(chǎn)琥珀酸放線桿菌ATCC55618菌株生長的臨界pH為4.5之后，對其進行紫外誘變，篩選出能夠在pH4.3的固體平板上生長的菌株M1，對M1進行兩輪紫外-亞硝基胍復(fù)合誘變，篩選出琥珀酸高產(chǎn)菌株AS-R2，該菌株在pH4.1條件下可以生長繁殖，但是在pH5.0條件下，產(chǎn)酸量僅為16.54g/L。本發(fā)明采用基因組改組技術(shù)對AS-R2進行3輪基因改組，獲得了耐酸性高產(chǎn)菌株AS-F3-2，能夠在pH3.2的從條件下生長繁殖，在pH5.0條件下，發(fā)酵36h，產(chǎn)琥珀酸產(chǎn)量達25.2g/L。CGMCC No.909920140428
【專利說明】一種耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]琥珀酸(Succinic Acid)是一種二羧酸，是常見的天然有機酸，又名丁二酸，是三羧酸循環(huán)的產(chǎn)物之一，其在人體、動物、植物和微生物中廣泛存在。琥珀酸作為一種C4平臺化合物，用途極為廣泛，目前在食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化學等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。
[0003]現(xiàn)有琥珀酸的生產(chǎn)方法主要有化學合成法，但是化學合成法對石化材料和電耗需求大，石化材料不可再生，資源有限且會造成嚴重的環(huán)境污染；近年來，微生物發(fā)酵法成為關(guān)注的熱點，但是目前琥珀酸生產(chǎn)菌株的產(chǎn)量仍是工業(yè)化生產(chǎn)的瓶頸問題。
[0004]發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的微生物種類很多，目前主要報道的有大腸桿菌(Escherichia coli)、產(chǎn)瑭I自酸厭氧螺菌(A.succiniproducens)、產(chǎn)瑭I自酸放線桿菌(A.succiniproducens)、產(chǎn)瑭泊酸絲狀桿菌(Fibrobacter succinogenes)、曼氏瑭泊酸產(chǎn)生菌(Mannheimia succiniciproducen)和酵母等。其中，產(chǎn)琥I自酸放線桿菌被認為是目前最有潛力用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的菌種。密歇根大學和密歇根生物技術(shù)研宄所篩選的兼性厭氧菌 A.succiniproducensl30Z (A.succiniproducens ATCC 55618)，產(chǎn)瑭?自酸產(chǎn)量可達70g/L ；Guettler等人以A.succiniproducens 130Z作為出發(fā)菌株，采用誘變選育的技術(shù)篩選得到突變株，所得突變菌株的產(chǎn)琥珀酸量在最高時可以達到80g/L，該菌株生長和產(chǎn)酸的最佳PH均為6.8。韓國科學技術(shù)研宄院研宄組篩選曼氏琥拍酸桿菌報道的最高產(chǎn)琥拍酸水平為52.4g/Lo我國合肥工業(yè)大學的李興江等人對A.succinogene (實驗室篩得)采用60Co-Y輻照進行誘變，篩選得到了突變株HF417，其產(chǎn)乙酸的濃度由25.7g/L降低到了
4.5g/L，而且產(chǎn)得的琥珀酸量由45g/L增加到了 67g/L。南京工業(yè)大學姜岷等篩選了一株產(chǎn)琥?自酸放線桿菌(A.succiniproducens) NJ113 (保藏編號為CGMCCN0.1716)，其發(fā)酵液最高產(chǎn)琥珀酸37°C發(fā)酵45小時后丁二酸產(chǎn)量可以達到45g/L，生長pH范圍為5.0?8.0，最適產(chǎn)酸PH7.0。鄭璞等從牛的瘤胃中篩選到一株產(chǎn)琥珀酸的野生菌株，通過菌種鑒定確認為產(chǎn)琥珀酸放線桿菌CGMCC1593，通過NTG誘變選育氟乙酸鈉抗性突變株，得到產(chǎn)量提高的誘變菌株SF-9，發(fā)酵36h可積累琥珀酸40.5g/L，應(yīng)用基因組改組技術(shù)選育到耐鈉、氟乙酸鈉抗性改組菌CGMCC 2653，5L發(fā)酵罐中補料分批發(fā)酵48h產(chǎn)琥珀酸53.96g/L，后來選育的CGMCC1593，采用補料分批發(fā)酵，48h產(chǎn)琥珀酸95.6g/L。但是這些菌株的耐酸性差，最適產(chǎn)酸PH均為中性左右，這就使發(fā)酵過程中必須采用堿中和維持菌株產(chǎn)酸的最適pH條件，導致產(chǎn)品分離提取過程中產(chǎn)生大量的鹽，給環(huán)境帶了一定的污染。耐酸性菌株在發(fā)酵產(chǎn)酸過程中需要中和堿的量少，分離提取產(chǎn)生的鹽少，為此篩選耐酸性菌株成為目前人們研宄的重點。劉璇等采用基因組改組技術(shù)選育耐酸性琥珀酸放線桿菌F3-21，其在5L發(fā)酵罐中補料分批發(fā)酵，控制pH在5.6?6.0時，48h積累琥珀酸38.lg/L。
[0005]現(xiàn)有琥珀酸的生產(chǎn)方法主要有化學合成法和微生物發(fā)酵法，化學合成法對石化材料和電耗需求大，且會造成環(huán)境污染；微生物發(fā)酵又被菌株培養(yǎng)條件及產(chǎn)量所限制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明實施例的目的在于提供一種耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株及其制備方法，旨在解決現(xiàn)有琥珀酸的生產(chǎn)方法主要有化學合成法和微生物發(fā)酵法，化學合成法對石化材料和電耗需求大，且會造成環(huán)境污染；微生物發(fā)酵又被菌株培養(yǎng)條件及產(chǎn)量所限制的問題。
[0007]本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一種耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株，該耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株以一株產(chǎn)琥珀酸放線桿菌為原始菌株，通過紫外線和亞硝基胍誘變，再經(jīng)基因組改組篩選，獲得耐酸性強且琥珀酸產(chǎn)量高的突變株AS-F3-2 ;產(chǎn)琥珀酸放線桿菌AS-F3-2，由原始菌株產(chǎn)琥珀酸放線桿菌ATCC 55618經(jīng)復(fù)合誘變和基因組改組后篩選獲得，已經(jīng)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號:CGMCC N0.9099ο
[0008]所述菌株是以一株產(chǎn)琥泊酸放線桿菌(A.succiniproducens)為原始菌株，通過紫外線(UV)和亞硝基胍(NTG)誘變，分別通過pH4.1和溴甲酚綠平板篩選獲得耐酸和產(chǎn)量提高菌株AS-UV1，AS-UV2，AS-NTGl和AS-NTG2 ;分別將上述4株突變菌株進行原生質(zhì)體制備，并等量混勻后均分為2份，一份采用加熱滅活，另一份采用紫外滅活，然后混合進行原生質(zhì)體融合、再生，并在PH3.8和溴甲酚綠平板篩選獲得耐酸和產(chǎn)量提高Fl代突變菌株AS-F1-8 ;然后將Fl代菌株制備原生質(zhì)體，進行第二輪基因組改組，連續(xù)經(jīng)3輪基因組改組后篩選，獲得耐酸性強且琥珀酸產(chǎn)量高的突變株AS-F3-2 (CGMCC9099)，該菌株在pH3.2條件下可以生長繁殖，在pH5.0條件下，產(chǎn)酸量25.2g/L。
[0009]本發(fā)明實施例的另一目的在于提供一種耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株制備方法，該耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株制備方法包括以下步驟:
[0010]步驟一，菌株誘變，對產(chǎn)琥珀酸放線桿菌菌株AS-R2分別進行紫外線誘變和亞硝基狐誘變；
[0011]步驟二，誘變菌株的篩選，在耐酸平板上篩選出經(jīng)紫外線誘變和亞硝基胍誘變后耐酸性最強的菌落，刮到生理鹽水中，梯度稀釋，涂布于溴甲酚綠平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d ;挑選變色圈較大的菌落，記號筆做標記，分別挑取一環(huán)變色圈較大的菌落于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并測琥珀酸產(chǎn)量；產(chǎn)量高的菌株繼續(xù)用于基因組改組；
[0012]步驟三，第一輪基因組改組，以誘變篩選得到的多株突變株為出發(fā)菌株，制備原生質(zhì)體，并對所制備的原生質(zhì)體滅活，再融合，最后篩選Fl代突變株；
[0013]步驟四，第二輪基因組改組，以第一輪基因組改組得到的融合子為出發(fā)菌株，繼續(xù)原生質(zhì)體制備、滅活與融合，并篩選F2代突變株；
[0014]步驟五，第三輪基因組改組，以第二輪基因組改組得到的融合子為出發(fā)菌株，繼續(xù)原生質(zhì)體制備、滅活與融合，并篩選F3代突變株；
[0015]步驟六，對獲得的F3代突變株傳代10次，驗證遺傳穩(wěn)定性，獲得耐酸性強且琥珀酸產(chǎn)量高的突變株AS-F3-2。
[0016]進一步，在步驟一中，菌株誘變的方法包括:
[0017]第一步，紫外線誘變:挑取原始菌株一一產(chǎn)琥珀酸放線桿菌于裝有活化培養(yǎng)基的試管中，活化24h，以3%接種量接種于裝有活化培養(yǎng)基的試管中進行二次活化，活化24h，再以3%接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)至對數(shù)期，取5ml于已滅菌的培養(yǎng)皿中，放入滅菌的磁力攪拌棒，紫外燈下30cm處于磁力攪拌器上紫外照射50s，時間到，關(guān)閉磁力攪拌器，取Iml誘變菌液于9ml生理鹽水，梯度稀釋至10_7，取梯度為10_5、10_6及10 7的菌液涂布于PH4.1平板上，每個梯度涂10個平板，于厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下避光培養(yǎng)3?5d ；
[0018]第二步，亞硝基胍誘變:出發(fā)菌株培養(yǎng)至對數(shù)期，取4.75ml菌液，加入0.25ml亞硝基胍母液，終濃度為500 μ g/mL，于37°C保溫90min，以冷的生理鹽水稀釋100倍，終止反應(yīng)，生理鹽水梯度稀釋至10_7，取梯度為10_5、10_6及10 _7的菌液涂布于pH 4.1平板平板上，每個梯度涂10個平板，于厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下避光培養(yǎng)3?5d。
[0019]進一步，在步驟三中，出發(fā)菌株原生質(zhì)體的制備方法:
[0020]挑取多株突變株各一環(huán)于活化培養(yǎng)基中活化一代，培養(yǎng)24h，按3%接種量二次活化于活化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，然后以3%接種量接種到含O?2.5%甘氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2?14h，取1ml培養(yǎng)液于已滅菌的離心管中，以轉(zhuǎn)速8000r/min離心15min，倒出上清液，菌體沉淀重懸于1ml滲透壓穩(wěn)定液中，離心洗滌菌體2次，菌體沉淀繼續(xù)重懸于1ml滲透壓穩(wěn)定液中，搖勻后，加入終濃度為0.02?0.14mg/ml的溶菌酶溶液，在18?47°C水浴鍋中恒溫酶解20?80min ;酶解完成后，從水浴鍋中取出并以轉(zhuǎn)速6000r/min離心15min，得到的沉淀以滲透壓穩(wěn)定液洗滌2次，沉淀重懸于1ml滲透壓穩(wěn)定液中，得到的懸液就是原生質(zhì)體懸液。
[0021]進一步，原生質(zhì)體滅活方法:將各株突變株酶解得到的原生質(zhì)體懸液等量混合均勻，再均分為兩份，一份采取熱滅活方式滅活，另一份采取紫外滅活方式滅活；
[0022]熱滅活:將用于熱滅活的原生質(zhì)體懸液放于60°C水浴鍋中，避光恒溫滅活10?60min ;紫外滅活:將用于紫外滅活的原生質(zhì)體懸液均分，每份含原生質(zhì)體懸液10ml，倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，放入滅菌的磁力攪拌棒，紫外燈下30cm處于磁力攪拌器上紫外照射15 ?40mino
[0023]進一步，原生質(zhì)體融合方法:取熱滅活和紫外滅活后的原生質(zhì)體懸液等體積混合均勻，加入40%聚乙二醇PEG 6000，在20°C條件下保溫6min，以促融滅活的原生質(zhì)體；融合完成后，從水浴鍋中取出并以轉(zhuǎn)速6000r/min離心15min，得到的沉淀以滲透壓穩(wěn)定液洗滌2次，沉淀重懸于滲透壓穩(wěn)定液中，所得到的懸液就是原生質(zhì)體融合后的融合子懸液。
[0024]進一步，融合子篩選方法:對所得到的融合子懸液梯度稀釋，涂布于再生平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下避光培養(yǎng)3?5d;再生培養(yǎng)基上長出的菌落全都刮到生理鹽水中，稀釋，F(xiàn)l，F(xiàn)2和F3代融合子分別涂布于pH3.8,3.5和3.2平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d;耐酸平板上長出的菌落再刮到生理鹽水中，梯度稀釋涂布溴甲酚綠平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d，挑選變色圈較大的菌落，并用記號筆做標記；分別將選定的變色圈較大的菌落各挑取一環(huán)于發(fā)酵培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)，并測琥珀酸產(chǎn)量。
[0025]進一步，發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法:葡萄糖30g/L，酵母浸粉10g/L，Na2HPO40.3g/L，NaH2P049.6g/L，K2HP043g/L，MgCl20.4g/L，lmol/L NaOH 溶液調(diào) pH，121°C滅菌 20min ;耐酸平板培養(yǎng)基:發(fā)酵培養(yǎng)基的組分上，0.01mol/L鹽酸溶液調(diào)至目的pH值，與瓊脂添加量為2%的等體積蒸餾水分開滅菌后混合，121°C滅菌20min ;溴甲酚綠平板培養(yǎng)基:發(fā)酵培養(yǎng)基的組分上，溴甲酚綠0.1%，瓊脂1.5%，ImoI/LNaOH溶液調(diào)至pH 7.0，121°C滅菌20min。
[0026]進一步，活化培養(yǎng)基的制備方法:TSA培養(yǎng)基，配方為:胰蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨5g/L，NaC15g/L，pH自然，121°C滅菌20min ;亞硝基胍母液:取Ig亞硝基胍加入1ml丙酮作為助溶劑，取Iml亞硝基胍丙酮溶液加入9ml磷酸鹽緩沖液；滲透壓穩(wěn)定液:順丁烯二酸 2.33g/L，MgCl.6H20 4.07g/L，蔗糖 171.13g/L，pH 7.0，121°C滅菌 20min ;溶菌酶溶液:稱取0.1g溶菌酶，將其溶解于1mL滲透壓穩(wěn)定液中，配制成10mg/mL的酶液，膜濾除菌，于4°C條件下保存?zhèn)溆茫?br> [0027]再生雙層培養(yǎng)基下層為發(fā)酵培養(yǎng)基再加入滲透壓穩(wěn)定液和2%瓊脂；上層與下層相同，瓊脂添加量改為0.5%。
[0028]進一步，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌AS-F3-2在pH5.0條件下，發(fā)酵36h，產(chǎn)琥珀酸產(chǎn)量達
25.2g/L0
[0029]本發(fā)明提供的耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株及其制備方法采用基因組改組技術(shù)獲得了耐酸性高產(chǎn)菌株AS-F3-2，在pH3.2條件下可以生長繁殖，在pH5.0條件下，發(fā)酵36h，產(chǎn)琥珀酸產(chǎn)量達25.2g/L。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1是本發(fā)明實施例提供的耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株制備方法流程圖；
[0031]圖2是本發(fā)明實施例提供的pH5.0條件下原始菌株、誘變突變株及改組菌株產(chǎn)酸量比較示意圖。AS-R2為原始菌株ATCC55618經(jīng)紫外和亞硝基胍誘變后菌株；AS_UV1，2為AS-R2紫外線誘變后突變菌株；AS-NTG1，2為AS-R2亞硝基胍誘變后突變菌株；AS_F1-1_8為第一輪基因組改組后的8株突變株;AS-F2-l-4為第二輪基因組改組后的4株突變株；AS-F3-1-3為第三輪基因組改組后的3株突變株.
[0032]圖3是本發(fā)明實施例提供的第三輪改組菌株遺傳穩(wěn)定性示意圖；
[0033]圖中:(a)為耐酸穩(wěn)定性，圖中□為第一代菌株；■為第10代菌株；(b)為產(chǎn)量穩(wěn)定性，圖中□為第一代菌株；■為第10代菌株。

【具體實施方式】
[0034]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0035]下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進一步描述。
[0036]本發(fā)明實施例的耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株以一株產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(A.succiniproducens)為原始菌株，通過紫外線(UV)和亞硝基胍(NTG)誘變，再經(jīng)基因組改組篩選，獲得耐酸性強且琥珀酸產(chǎn)量高的突變株AS-F3-2 (CGMCC9099);產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes) AS-F3-2，由原始菌株產(chǎn)瑭泊酸放線桿菌 ATCC 55618經(jīng)復(fù)合誘變和基因組改組后篩選獲得，已經(jīng)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號:CGMCC N0.9099。
[0037]保藏人王玉華于2014年4月28日，向中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心提出保藏申請，保藏編號:CGMCC N0.9099 ;中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院生物研宄所；請求保藏的參考生物材料:AS-F3-2，建議的分類命名:產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)，該生物材料已于2014年04月28日由本保藏中心收到，并登記入冊，由2014年04月28日起保存三十年，在期滿前收到提供生物樣品的請求后再延續(xù)保存五年；該生物材料的存活性經(jīng)本保藏中心于2014年04月28日檢測，結(jié)果為存活。
[0038]如圖1所示，本發(fā)明實施例的耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株制備方法包括以下步驟:
[0039]SlOl:菌株誘變，對產(chǎn)琥珀酸放線桿菌菌株AS-R2分別進行紫外線(UV)誘變和亞硝基胍(NTG)誘變；
[0040]S102:誘變菌株的篩選，在耐酸平板上篩選出經(jīng)紫外線(UV)誘變和亞硝基胍(NTG)誘變后耐酸性最強的菌落，刮到生理鹽水中，梯度稀釋，涂布于溴甲酚綠平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d ;挑選變色圈較大的菌落，記號筆做標記，分別挑取一環(huán)變色圈較大的菌落于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并測其琥珀酸產(chǎn)量；產(chǎn)量高的菌株繼續(xù)用于基因組改組；
[0041]S103:第一輪基因組改組，以誘變篩選得到的多株突變株為出發(fā)菌株，制備其原生質(zhì)體，并對所制備的原生質(zhì)體滅活，再融合，最后篩選Fl代融合子；
[0042]S104:第二輪基因組改組，以第一輪基因組改組得到的融合子為出發(fā)菌株，繼續(xù)原生質(zhì)體制備、滅活與融合，并篩選F2代融合子；
[0043]S105:第三輪基因組改組，以第二輪基因組改組得到的融合子為出發(fā)菌株，繼續(xù)原生質(zhì)體制備、滅活與融合，并篩選F3代融合子；
[0044]S106:對獲得的F3代突變株傳代10次，驗證其遺傳穩(wěn)定性。
[0045]在步驟SlOl中，菌株誘變的方法包括:
[0046]第一步，紫外線誘變(UV):挑取原始菌株——產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(A.succinogenes)于裝有活化培養(yǎng)基的試管中，活化24h，以3%接種量接種于裝有活化培養(yǎng)基的試管中進行二次活化，活化24h，再以3%接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)至對數(shù)期，取5ml于已滅菌的培養(yǎng)皿中，放入滅菌的磁力攪拌棒，紫外燈下30cm處于磁力攪拌器上紫外照射50s，時間到，關(guān)閉磁力攪拌器，取Iml誘變菌液于9ml生理鹽水，梯度稀釋至10_7，取梯度為10_5、10_6及10 _7的菌液涂布于耐pH 5.1?3.9平板上，每個梯度涂10個平板，于厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下避光培養(yǎng)3?5d ;
[0047]第二步，亞硝基胍(NTG)誘變:出發(fā)菌株培養(yǎng)至對數(shù)期，取4.75ml菌液，加入0.25ml亞硝基胍(NTG)母液(終濃度為500 μ g/mL)，于37°C保溫90min，以冷的生理鹽水稀釋100倍，終止反應(yīng)，生理鹽水梯度稀釋至10_7，取梯度為10_5、10_6及10 _7的菌液涂布于耐pH 5.1?3.9平板上，每個梯度涂10個平板，于厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下避光培養(yǎng)3?5d。
[0048]在步驟S103中，出發(fā)菌株原生質(zhì)體的制備方法:
[0049]挑取多株突變株各一環(huán)于活化培養(yǎng)基中活化一代(培養(yǎng)24h)，按3%接種量二次活化于活化培養(yǎng)基中(培養(yǎng)24h)，然后以3%接種量接種到含O?2.5%甘氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2?14h，取1ml培養(yǎng)液于已滅菌的離心管中，以轉(zhuǎn)速8000r/min離心15min，倒出上清液，菌體沉淀重懸于1ml滲透壓穩(wěn)定液中，離心洗滌菌體2次，菌體沉淀繼續(xù)重懸于1ml滲透壓穩(wěn)定液中，搖勻后，加入終濃度為0.02?0.14mg/ml的溶菌酶溶液，在18?47°C水浴鍋中恒溫酶解20?80min ;酶解完成后，從水浴鍋中取出并以轉(zhuǎn)速6000r/min離心15min，得到的沉淀以滲透壓穩(wěn)定液洗滌2次，沉淀重懸于1ml滲透壓穩(wěn)定液中，得到的懸液就是原生質(zhì)體懸液。
[0050]原生質(zhì)體滅活方法是:將各株突變株酶解得到的原生質(zhì)體懸液等量混合均勻，再均分為兩份，一份采取熱滅活方式滅活，另一份采取紫外滅活方式滅活；(I)熱滅活:將用于熱滅活的原生質(zhì)體懸液放于60°c水浴鍋中，避光恒溫滅活10?60min ; (2)紫外滅活:將用于紫外滅活的原生質(zhì)體懸液均分，每份含原生質(zhì)體懸液10ml，倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，放入滅菌的磁力攪拌棒，紫外燈下30cm處于磁力攪拌器上紫外照射15?40min。
[0051]原生質(zhì)體融合方法:取熱滅活和紫外滅活后的原生質(zhì)體懸液等體積混合均勻，加入40 %聚乙一■醇PEG 6000，在20 C條件下保溫6min，以促融滅活的原生質(zhì)體；融合完成后，從水浴鍋中取出并以轉(zhuǎn)速6000r/min離心15min，得到的沉淀以滲透壓穩(wěn)定液洗滌2次，沉淀重懸于滲透壓穩(wěn)定液中，所得到的懸液就是原生質(zhì)體融合后的融合子懸液；
[0052]融合子篩選:對所得到的融合子懸液梯度稀釋，涂布于再生平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下避光培養(yǎng)3?5d ;再生培養(yǎng)基上長出的菌落全都刮到生理鹽水中，稀釋涂布于耐PH3.8?3.2平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d ;耐酸平板上長出的菌落再刮到生理鹽水中，梯度稀釋涂布溴甲酚綠平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d，挑選變色圈較大的菌落，并用記號筆做標記；分別將選定的變色圈較大的菌落各挑取一環(huán)于發(fā)酵培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)，并測琥珀酸產(chǎn)量。
[0053]在步驟S102中，發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖30g/L，酵母浸粉10g/L，Na2HPO40.3g/L，NaH2P049.6g/L，K2HP043g/L，MgCl20.4g/L，lmol/L NaOH 溶液調(diào)至 pH 7.0，121°C滅菌 20min ；耐酸平板培養(yǎng)基:發(fā)酵培養(yǎng)基(配方上)，0.01mol/L鹽酸溶液調(diào)至目的pH值，與瓊脂添加量為2%的等體積蒸餾水分開滅菌后混合，121°C滅菌20min ;溴甲酚綠平板培養(yǎng)基:發(fā)酵培養(yǎng)基(配方上)，溴甲酚綠0.1 %，瓊脂1.5%，lmol/L NaOH溶液調(diào)至pH 7.0，121°C滅菌20mino
[0054]活化培養(yǎng)基:TSA培養(yǎng)基，配方為:胰蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，pH自然，121°C滅菌20min ;亞硝基胍(NTG)母液:取Ig亞硝基胍(NTG)加入1ml丙酮作為助溶劑，取Iml亞硝基胍(NTG)丙酮溶液加入9ml磷酸鹽緩沖液；滲透壓穩(wěn)定液:順丁烯二酸 2.33g/L，MgCl.6Η204.07g/L，蔗糖 171.13g/L，pH 7.0，121°C滅菌 20min ;溶菌酶溶液:稱取0.1g溶菌酶，將其溶解于1mL滲透壓穩(wěn)定液中，配制成10mg/mL的酶液，膜濾除菌，于4°C條件下保存?zhèn)溆谩?br> [0055]再生雙層培養(yǎng)基:下層為發(fā)酵培養(yǎng)基再加入滲透壓穩(wěn)定液和2%瓊脂；上層與下層相同，瓊脂添加量改為0.5%。
[0056]本發(fā)明的產(chǎn)琥泊酸放線桿菌(A.succinogenes)AS-F3_2在pH5.0條件下，發(fā)酵36h，產(chǎn)琥珀酸產(chǎn)量達25.2g/L。
[0057]本發(fā)明的具體步驟包括:
[0058]步驟一，菌株誘變:
[0059]對產(chǎn)琥I自酸放線桿菌(A.succiniproducens) AS-R2分別進行紫外線(UV)誘變和亞硝基胍(NTG)誘變；
[0060]紫外線誘變(UV):挑取原始菌株--產(chǎn)琥I自酸放線桿菌(A.succiniproducens)
AS-R2于裝有活化培養(yǎng)基的試管中，活化24h，以3%接種量接種于裝有活化培養(yǎng)基的試管中進行二次活化，活化24h，再以3%接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)至對數(shù)期，取5ml于已滅菌的培養(yǎng)皿中，放入滅菌的磁力攪拌棒，紫外燈下30cm處于磁力攪拌器上紫外照射50s，時間到，關(guān)閉磁力攪拌器，取Iml誘變菌液于9ml生理鹽水，梯度稀釋至10'取梯度為 10_5、10_6及 10 I的菌液涂布于耐 pH 5.1、pH 4.8、pH 4.5、pH 412 及 ρΗ3.9平板上，每個梯度涂10個平板，于厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下避光培養(yǎng)3?5d ;
[0061]亞硝基胍(NTG)誘變:出發(fā)菌株培養(yǎng)至對數(shù)期，取4.75ml菌液，加入0.25ml亞硝基胍(NTG)母液(終濃度為500 μ g/mL)，于37°C保溫90min，以冷的生理鹽水稀釋100倍，終止反應(yīng)，生理鹽水梯度稀釋至10_7，取梯度為10_5、10_6及10_7的菌液涂布于耐pH 5.UpH4.8、pH 4.5、pH 4.2及pH 3.9平板上，每個梯度涂10個平板，于厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下避光培養(yǎng)3?5d ;
[0062]步驟二，誘變菌株的篩選:
[0063]在耐酸平板上篩選出經(jīng)紫外線(UV)誘變和亞硝基胍(NTG)誘變后耐酸性最強的菌落，刮到生理鹽水中，梯度稀釋，涂布于溴甲酚綠平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d;挑選變色圈較大的菌落，記號筆做標記，分別挑取一環(huán)變色圈較大的菌落于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并測其琥珀酸產(chǎn)量；產(chǎn)量高的菌株繼續(xù)用于基因組改組；
[0064]步驟三，基因組改組:
[0065]第一輪基因組改組:
[0066]以誘變篩選得到的多株突變株為出發(fā)菌株，制備其原生質(zhì)體，并對所制備的原生質(zhì)體滅活，再融合，最后篩選Fl代融合子；
[0067]出發(fā)菌株原生質(zhì)體的制備:
[0068]挑取多株突變株各一環(huán)于活化培養(yǎng)基中活化一代(培養(yǎng)24h)，按3%接種量二次活化于活化培養(yǎng)基中(培養(yǎng)24h)，然后以3%接種量接種到含O?2.5%甘氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2?14h，取1ml培養(yǎng)液于已滅菌的離心管中，以轉(zhuǎn)速8000r/min離心15min，倒出上清液，菌體沉淀重懸于1ml滲透壓穩(wěn)定液中，離心洗滌菌體2次，菌體沉淀繼續(xù)重懸于1ml滲透壓穩(wěn)定液中，搖勻后，加入終濃度為0.02?0.14mg/ml的溶菌酶溶液，在18?47°C水浴鍋中恒溫酶解20?80min ;酶解完成后，從水浴鍋中取出并以轉(zhuǎn)速6000r/min離心15min，得到的沉淀以滲透壓穩(wěn)定液洗滌2次，沉淀重懸于1ml滲透壓穩(wěn)定液中，得到的懸液就是原生質(zhì)體懸液；
[0069]原生質(zhì)體滅活:
[0070]將各株突變株酶解得到的原生質(zhì)體懸液等量混合均勻，再均分為兩份，一份采取熱滅活方式滅活，另一份采取紫外滅活方式滅活；
[0071]熱滅活:將用于熱滅活的原生質(zhì)體懸液放于60°C水浴鍋中，避光恒溫滅活10?60min ；
[0072]紫外滅活:將用于紫外滅活的原生質(zhì)體懸液均分，每份含原生質(zhì)體懸液10ml，倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，放入滅菌的磁力攪拌棒，紫外燈下30cm處于磁力攪拌器上紫外照射15?40min，時間到，關(guān)閉磁力攪拌器；
[0073]以上所述滅活過程都要避光進行；
[0074]原生質(zhì)體融合:
[0075]取熱滅活和紫外滅活后的原生質(zhì)體懸液等體積混合均勻，加入40%聚乙二醇PEG6000，在20°C下保溫6min，以促融滅活的原生質(zhì)體；融合完成后，從水浴鍋中取出并以轉(zhuǎn)速6000r/min離心15min，得到的沉淀以滲透壓穩(wěn)定液洗滌2次，沉淀重懸于滲透壓穩(wěn)定液中，所得到的懸液就是原生質(zhì)體融合后的融合子懸液；
[0076]融合子篩選:
[0077]對所得到的融合子懸液梯度稀釋，涂布于再生平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下避光培養(yǎng)3?5d ;再生培養(yǎng)基上長出的菌落全都刮到生理鹽水中，稀釋涂布于耐pH3.8平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d ;耐酸平板上長出的菌落再刮到生理鹽水中，梯度稀釋涂布溴甲酚綠平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d，挑選變色圈較大的菌落，并用記號筆做標記；分別將選定的變色圈較大的菌落各挑取一環(huán)于發(fā)酵培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)，并測琥珀酸產(chǎn)量；篩選產(chǎn)量高的融合子，這就是第一輪基因組改組得到的Fl代突變株；
[0078]第二輪基因組改組:
[0079]以第一輪基因組改組得到的融合子為出發(fā)菌株，繼續(xù)原生質(zhì)體制備、滅活與融合，方法與第一輪基因組改組時相同，并篩選F2代融合子:
[0080]第二輪基因組改組的融合子篩選:
[0081]對所得到的融合子懸液梯度稀釋，涂布于再生平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下避光培養(yǎng)3?5d ;再生培養(yǎng)基上長出的菌落全都刮到生理鹽水中，稀釋涂布于耐pH3.5平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d ;耐酸平板上長出的菌落再刮到生理鹽水中，梯度稀釋涂布溴甲酚綠平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d，挑選變色圈較大的菌落，并用記號筆做標記；分別將選定的變色圈較大的菌落各挑取一環(huán)于發(fā)酵培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)，并測琥珀酸產(chǎn)量；篩選產(chǎn)量高的融合子，這就是第二輪基因組改組得到的F2代突變株；
[0082]第三輪基因組改組:
[0083]以第二輪基因組改組得到的融合子為出發(fā)菌株，繼續(xù)原生質(zhì)體制備、滅活與融合，方法與第一輪基因組改組時相同，并篩選F3代融合子；
[0084]第三輪基因組改組的融合子篩選:
[0085]對所得到的融合子懸液梯度稀釋，涂布于再生平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下避光培養(yǎng)3?5d ;再生培養(yǎng)基上長出的菌落全都刮到生理鹽水中，稀釋涂布于耐pH3.2平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d ;耐酸平板上長出的菌落再刮到生理鹽水中，梯度稀釋涂布溴甲酚綠平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d，挑選變色圈較大的菌落，并用記號筆做標記；分別將選定的變色圈較大的菌落各挑取一環(huán)于發(fā)酵培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)，并測琥珀酸產(chǎn)量；篩選產(chǎn)量高的融合子，這就是第三輪基因組改組得到的F3代突變株；
[0086]對獲得的F3代突變株傳代10次，驗證其遺傳穩(wěn)定性；
[0087]本發(fā)明的具體實施例:
[0088]實施例1
[0089]原生質(zhì)體制備條件:
[0090]挑取多株突變株各一環(huán)于活化培養(yǎng)基中活化一代(培養(yǎng)24h)，按3%接種量二次活化于活化培養(yǎng)基中(培養(yǎng)24h)，然后以3%接種量接種到含1.0 %甘氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6h，取1ml培養(yǎng)液于已滅菌的離心管中，以轉(zhuǎn)速8000r/min離心15min，倒出上清液，菌體沉淀重懸于1ml滲透壓穩(wěn)定液中，離心洗滌菌體2次，菌體沉淀繼續(xù)重懸于1ml滲透壓穩(wěn)定液中，搖勻后，加入終濃度為0.08mg/ml的溶菌酶溶液，在37°C水浴鍋中恒溫酶解40min ;酶解完成后，從水浴鍋中取出并以轉(zhuǎn)速6000r/min離心15min，得到的沉淀以滲透壓穩(wěn)定液洗滌2次，沉淀重懸于1ml滲透壓穩(wěn)定液中，得到的懸液就是原生質(zhì)體懸液。
[0091]實施例2
[0092]原生質(zhì)體滅活:
[0093]將各株突變株酶解得到的原生質(zhì)體懸液等量混合均勻，再均分為兩份，一份采取熱滅活方式滅活，另一份采取紫外滅活方式滅活；
[0094]熱滅活:將用于熱滅活的原生質(zhì)體懸液放于60°C水浴鍋中，避光恒溫滅活30min ;
[0095]紫外滅活:將用于紫外滅活的原生質(zhì)體懸液均分，每份含原生質(zhì)體懸液10ml，倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，放入滅菌的磁力攪拌棒，紫外燈下30cm處于磁力攪拌器上紫外照射35min，時間到，關(guān)閉磁力攪拌器；
[0096]以上所述滅活過程都要避光進行；
[0097]實施例3
[0098]基因組改組:
[0099](I)菌株誘變:
[0100]對產(chǎn)琥I自酸放線桿菌(A.succiniproducens) AS-R2分別進行紫外線(UV)誘變和亞硝基胍(NTG)誘變(具體方法如上文所述);
[0101](2)誘變菌株的篩選:
[0102]在耐酸平板上篩選出經(jīng)紫外線(UV)誘變和亞硝基胍(NTG)誘變后耐酸性最強的菌落，刮到生理鹽水中，梯度稀釋，涂布于溴甲酚綠平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d;挑選變色圈較大的菌落，記號筆做標記，分別挑取一環(huán)變色圈較大的菌落于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并測其琥珀酸產(chǎn)量；產(chǎn)量高的菌株繼續(xù)用于基因組改組；
[0103](3)基因組改組
[0104]第一輪基因組改組:
[0105]以誘變篩選得到的多株突變株為出發(fā)菌株，以實例I所述的制備條件制備其原生質(zhì)體，并對所制備的原生質(zhì)體以實例2所述條件進行滅活；取熱滅活和紫外滅活后的原生質(zhì)體懸液等體積混合均勻，加入40%聚乙二醇PEG 6000，在20°C下保溫6min，以促融滅活的原生質(zhì)體；融合完成后，從水浴鍋中取出并以轉(zhuǎn)速6000r/min離心15min，得到的沉淀以滲透壓穩(wěn)定液洗滌2次，沉淀重懸于滲透壓穩(wěn)定液中，所得到的懸液就是原生質(zhì)體融合后的融合子懸液；
[0106]對所得到的融合子懸液梯度稀釋，涂布于再生平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下避光培養(yǎng)3?5d ;再生培養(yǎng)基上長出的菌落全都刮到生理鹽水中，稀釋涂布于耐pH3.8平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d ;耐酸平板上長出的菌落再刮到生理鹽水中，梯度稀釋涂布溴甲酚綠平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d，挑選變色圈較大的菌落，并用記號筆做標記；分別將選定的變色圈較大的菌落各挑取一環(huán)于發(fā)酵培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)，并測琥珀酸產(chǎn)量；篩選產(chǎn)量高的融合子，這就是第一輪基因組改組得到的Fl代突變株；
[0107]第二輪基因組改組:
[0108]以第一輪基因組改組得到的融合子為出發(fā)菌株，繼續(xù)原生質(zhì)體制備、滅活與融合，方法與第一輪基因組改組時相同，得到融合子懸液；
[0109]對所得到的融合子懸液梯度稀釋，涂布于再生平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下避光培養(yǎng)3?5d ;再生培養(yǎng)基上長出的菌落全都刮到生理鹽水中，稀釋涂布于耐pH3.5平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d ;耐酸平板上長出的菌落再刮到生理鹽水中，梯度稀釋涂布溴甲酚綠平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d，挑選變色圈較大的菌落，并用記號筆做標記；分別將選定的變色圈較大的菌落各挑取一環(huán)于發(fā)酵培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)，并測琥珀酸產(chǎn)量；篩選產(chǎn)量高的融合子，這就是第二輪基因組改組得到的F2代突變株；
[0110]第三輪基因組改組:
[0111]以第二輪基因組改組得到的融合子為出發(fā)菌株，繼續(xù)原生質(zhì)體制備、滅活與融合，方法與第一輪基因組改組時相同，得到融合子懸液；
[0112]對所得到的融合子懸液梯度稀釋，涂布于再生平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下避光培養(yǎng)3?5d ;再生培養(yǎng)基上長出的菌落全都刮到生理鹽水中，稀釋涂布于耐pH3.2平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d ;耐酸平板上長出的菌落再刮到生理鹽水中，梯度稀釋涂布溴甲酚綠平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d，挑選變色圈較大的茵落，并用記號筆做標記；分別將選定的變色圈較大的菌落各挑取一環(huán)于發(fā)酵培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)，并測琥珀酸產(chǎn)量；篩選產(chǎn)量高的融合子，這就是第三輪基因組改組得到的F3代突變株;
[0113]所得原始菌株、誘變突變株及改組菌株產(chǎn)酸量比較圖與琥珀酸標品及菌株AS-F3-2發(fā)酵液中琥珀酸高效液相色譜圖見說明書附圖；
[0114]對獲得的F3代突變株傳代10次，在pH5.0條件下發(fā)酵36h分析其生長量和產(chǎn)酸量，驗證其遺傳穩(wěn)定性；結(jié)果表明改組菌株AS-F3-2和AS-F3-3具有穩(wěn)定的遺傳性。
[0115]本發(fā)明在確定產(chǎn)琥珀酸放線桿菌ATCC55618菌株生長的臨界pH為4.5之后，對其進行紫外誘變，篩選出能夠在PH4.3的固體平板上生長的菌株M1，對Ml進行兩輪紫外-亞硝基胍復(fù)合誘變，篩選出琥珀酸高產(chǎn)菌株AS-R2，該菌株在pH4.1條件下可以生長繁殖，但是在PH5.0條件下，產(chǎn)酸量僅為16.54g/L。目前，本發(fā)明采用基因組改組技術(shù)獲得了耐酸性高產(chǎn)菌株AS-F3-2，在pH3.2條件下可以生長繁殖，在pH5.0條件下，產(chǎn)琥珀酸產(chǎn)量達25.2g/L0
[0116]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株，其特征在于，該耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株以一株產(chǎn)琥珀酸放線桿菌為原始菌株，通過紫外線和亞硝基胍誘變，再經(jīng)基因組改組篩選，獲得耐酸性強且琥珀酸產(chǎn)量高的突變株AS-F3-2 ;產(chǎn)琥珀酸放線桿菌AS-F3-2，由原始菌株產(chǎn)琥珀酸放線桿菌ATCC 55618經(jīng)復(fù)合誘變和基因組改組后篩選獲得，已經(jīng)保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號:CGMCC9099。
2.如權(quán)利要求1所述的耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株，其特征在于，所述菌株是以一株產(chǎn)琥珀酸放線桿菌ATCC55618為原始菌株，通過紫外線和亞硝基胍誘變，分別通過pH4.1和溴甲酚綠平板篩選獲得耐酸和產(chǎn)量提高菌株AS-UVl，AS-UV2，AS-NTGl和AS-NTG2 ;分別將上述4株突變菌株進行原生質(zhì)體制備，并等量混勻后均分為2份，一份采用加熱滅活，另一份采用紫外滅活，然后混合進行原生質(zhì)體融合、再生，并在低PH和溴甲酚綠平板篩選獲得耐酸和產(chǎn)量提高Fl代突變菌株AS-F1-8 ;然后將Fl代菌株制備原生質(zhì)體，進行第二輪基因組改組，連續(xù)經(jīng)3輪基因組改組后篩選，獲得耐酸性強且琥珀酸產(chǎn)量高的突變株AS-F3-2，該菌株在pH3.2條件下能夠生長繁殖，在pH5.0條件下發(fā)酵36小時，產(chǎn)酸量為25.2g/L。
3.—種耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株制備方法，其特征在于，該耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株制備方法包括以下步驟: 步驟一，菌株誘變，對產(chǎn)琥珀酸放線桿菌菌株AS-R2分別進行紫外線誘變和亞硝基胍誘變； 步驟二，誘變菌株的篩選，在PH4.1的平板上篩選出經(jīng)紫外線誘變和亞硝基胍誘變后耐酸性最強的菌落，刮到生理鹽水中，梯度稀釋，涂布于溴甲酚綠平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d ;挑選變色圈較大的菌落，記號筆做標記，分別挑取一環(huán)變色圈較大的菌落于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并測琥珀酸產(chǎn)量；產(chǎn)量高的菌株繼續(xù)用于基因組改組； 步驟三，第一輪基因組改組，以誘變篩選得到的多株突變株為出發(fā)菌株，制備原生質(zhì)體，并對所制備的原生質(zhì)體滅活，再融合，最后篩選Fl代融合子； 第一輪基因組改組的融合子篩選: 對所得到的融合子懸液梯度稀釋，涂布于再生平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下避光培養(yǎng)3?5d，再生培養(yǎng)基上長出的菌落全都刮到生理鹽水中，稀釋涂布于pH3.8平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d，耐酸平板上長出的菌落再刮到生理鹽水中，梯度稀釋涂布溴甲酚綠平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d，挑選變色圈較大的菌落，并用記號筆做標記，分別將選定的變色圈較大的菌落各挑取一環(huán)于發(fā)酵培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)，并測琥珀酸產(chǎn)量，篩選產(chǎn)量高的融合子是第一輪基因組改組得到的Fl代突變株； 步驟四，第二輪基因組改組，以第一輪基因組改組得到的Fl代突變株為出發(fā)菌株，繼續(xù)原生質(zhì)體制備、滅活與融合，并篩選F2代融合子； 第二輪基因組改組的融合子篩選: 對所得到的融合子懸液梯度稀釋，涂布于再生平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下避光培養(yǎng)3?5d，再生培養(yǎng)基上長出的菌落全都刮到生理鹽水中，稀釋涂布于pH3.5平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d，耐酸平板上長出的菌落再刮到生理鹽水中，梯度稀釋涂布溴甲酚綠平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d，挑選變色圈較大的菌落，并用記號筆做標記，分別將選定的變色圈較大的菌落各挑取一環(huán)于發(fā)酵培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)，并測琥珀酸產(chǎn)量，篩選產(chǎn)量高的融合子是第二輪基因組改組得到的F2代突變株； 步驟五，第三輪基因組改組，以第二輪基因組改組得到的F2代突變株為出發(fā)菌株，繼續(xù)原生質(zhì)體制備、滅活與融合，并篩選F3代融合子； 第三輪基因組改組的融合子篩選: 對所得到的融合子懸液梯度稀釋，涂布于再生平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下避光培養(yǎng)3?5d ;再生培養(yǎng)基上長出的菌落全都刮到生理鹽水中，稀釋涂布于耐pH3.2平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d ;耐酸平板上長出的菌落再刮到生理鹽水中，梯度稀釋涂布溴甲酚綠平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d，挑選變色圈較大的菌落，并用記號筆做標記；分別將選定的變色圈較大的菌落各挑取一環(huán)于發(fā)酵培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)，并測琥珀酸產(chǎn)量；篩選產(chǎn)量高的融合子，這是第三輪基因組改組得到的F3代突變株； 步驟六，對獲得的F3代突變株傳代10次，驗證遺傳穩(wěn)定性，獲得耐酸性強且琥珀酸產(chǎn)量高的突變株AS-F3-2。
4.如權(quán)利要求3所述的耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株制備方法，其特征在于，在步驟一中，菌株誘變的方法包括: 第一步，紫外線誘變:挑取原始菌株一一產(chǎn)琥珀酸放線桿菌于裝有活化培養(yǎng)基的試管中，活化24h，以3%接種量接種于裝有活化培養(yǎng)基的試管中進行二次活化，活化24h，再以3%接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)至對數(shù)期，取5ml于已滅菌的培養(yǎng)皿中，放入滅菌的磁力攪拌棒，紫外燈下30cm處于磁力攪拌器上紫外照射50s，時間到，關(guān)閉磁力攪拌器，取Iml誘變菌液于9ml生理鹽水，梯度稀釋至10_7，取梯度為10_5、10_6及10 7的菌液涂布于PH4.1平板上，每個梯度涂10個平板，于厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下避光培養(yǎng)3?5d ； 第二步，亞硝基胍誘變:出發(fā)菌株培養(yǎng)至對數(shù)期，取4.75ml菌液，加入0.25ml亞硝基胍母液，終濃度為500 μ g/mL，于37°C保溫90min，以冷的生理鹽水稀釋100倍，終止反應(yīng)，生理鹽水梯度稀釋至10_7，取梯度為10_5、10_6及10 _7的菌液涂布于耐pH 4.1平板上，每個梯度涂10個平板，于厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下避光培養(yǎng)3?5d。
5.如權(quán)利要求3所述的耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株制備方法，其特征在于，在步驟三中，出發(fā)菌株原生質(zhì)體的制備方法: 挑取多株突變株各一環(huán)于活化培養(yǎng)基中活化一代，培養(yǎng)24h，按3%接種量二次活化于活化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，然后以3%接種量接種到含O?2.5%甘氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2?14h，取1ml培養(yǎng)液于已滅菌的離心管中，以轉(zhuǎn)速8000r/min離心15min，倒出上清液，菌體沉淀重懸于1ml滲透壓穩(wěn)定液中，離心洗滌菌體2次，菌體沉淀繼續(xù)重懸于1ml滲透壓穩(wěn)定液中，搖勻后，加入終濃度為0.02?0.14mg/ml的溶菌酶溶液，在18?47°C水浴鍋中恒溫酶解20?80min ;酶解完成后，從水浴鍋中取出并以轉(zhuǎn)速6000r/min離心15min，得到的沉淀以滲透壓穩(wěn)定液洗滌2次，沉淀重懸于1ml滲透壓穩(wěn)定液中，得到的懸液就是原生質(zhì)體懸液。
6.如權(quán)利要求3所述的耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株制備方法，其特征在于，原生質(zhì)體滅活方法:將各株突變株酶解得到的原生質(zhì)體懸液等量混合均勻，再均分為兩份，一份采取熱滅活方式滅活，另一份采取紫外滅活方式滅活； 熱滅活:將用于熱滅活的原生質(zhì)體懸液放于60°C水浴鍋中，避光恒溫滅活10?60min ；紫外滅活:將用于紫外滅活的原生質(zhì)體懸液均分，每份含原生質(zhì)體懸液10ml，倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，放入滅菌的磁力攪拌棒，紫外燈下30cm處于磁力攪拌器上紫外照射15?40mino
7.如權(quán)利要求3所述的耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株制備方法，其特征在于，原生質(zhì)體融合方法:取熱滅活和紫外滅活后的原生質(zhì)體懸液等體積混合均勻，加入40%聚乙二醇PEG6000，在20°C條件下保溫6min，以促融滅活的原生質(zhì)體；融合完成后，從水浴鍋中取出并以轉(zhuǎn)速6000r/min離心15min，得到的沉淀以滲透壓穩(wěn)定液洗滌2次，沉淀重懸于滲透壓穩(wěn)定液中，所得到的懸液就是原生質(zhì)體融合后的融合子懸液。
8.如權(quán)利要求3所述的耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株制備方法，其特征在于，融合子篩選方法:對所得到的融合子懸液梯度稀釋，涂布于再生平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下避光培養(yǎng)3?5d ;再生培養(yǎng)基上長出的菌落全都刮到生理鹽水中，稀釋涂布于pH3.2平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d ;耐酸平板上長出的菌落再刮到生理鹽水中，梯度稀釋涂布溴甲酚綠平板，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)3?5d，挑選變色圈較大的菌落，并用記號筆做標記；分別將選定的變色圈較大的菌落各挑取一環(huán)于發(fā)酵培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37°C下培養(yǎng)，并測琥珀酸產(chǎn)量。
9.如權(quán)利要求3所述的耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株制備方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法:葡萄糖 30g/L，酵母浸粉 10g/L，Na2HPO40.3g/L，NaH2P049.6g/L，K2HP043g/L，MgCl20.4g/L，Imol/LNaOH溶液調(diào)至pH 7.0，121°C滅菌20min ;耐酸平板培養(yǎng)基:發(fā)酵培養(yǎng)基的組分上，0.01mol/L鹽酸溶液調(diào)至目的pH值，與瓊脂添加量為2 %的等體積蒸餾水分開滅菌后混合，121°C滅菌20min;溴甲酚綠平板培養(yǎng)基:發(fā)酵培養(yǎng)基的組分上，溴甲酚綠0.1%，瓊脂 1.5%，Imol/LNaOH 溶液調(diào)至 pH 7.0，121°C滅菌 20min。
10.如權(quán)利要求3所述的耐酸性高產(chǎn)琥珀酸的菌株制備方法，其特征在于，活化培養(yǎng)基的制備方法:TSA培養(yǎng)基，配方為:胰蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，pH自然，121°C滅菌20min ;亞硝基胍母液:取Ig亞硝基胍加入1ml丙酮作為助溶劑，取Iml亞硝基胍丙酮溶液加入9ml磷酸鹽緩沖液；滲透壓穩(wěn)定液:順丁烯二酸2.33g/L，MgCl.6H204.07g/L，蔗糖171.13g/L，pH 7.0，121°C滅菌20min ;溶菌酶溶液:稱取0.1g溶菌酶，將其溶解于1mL滲透壓穩(wěn)定液中，配制成10mg/mL的酶液，膜濾除菌，于4°C條件下保存?zhèn)溆茫? 再生雙層培養(yǎng)基下層為發(fā)酵培養(yǎng)基再加入滲透壓穩(wěn)定液和2%瓊脂；上層與下層相同，瓊脂添加量改為0.5%。
【文檔編號】C12N15/03GK104480054SQ201410604254
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】王玉華, 夏飛飛, 姚曼, 于寒松, 劉俊梅, 樸春紅, 代偉長, 劉彥隆 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學