肺癌易感基因的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs7975232的檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)肺癌易感性基因的方法及其檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)原發(fā)性支氣管肺癌易感性基因的方法，它包括檢測(cè)維生素D受體基因（VDR）多態(tài)性位點(diǎn)rs7975232位點(diǎn)的基因型，rs7975232帶有C基因型的個(gè)體，肺癌的易感性顯著高于普通人群。本發(fā)明還公開(kāi)了相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有擴(kuò)增rs7975232位點(diǎn)的引物，還可以包括擴(kuò)增VDR基因啟動(dòng)子內(nèi)包含rs7975232位點(diǎn)的區(qū)域的引物。利用本發(fā)明檢測(cè)rs7975232位點(diǎn)的基因型，方法簡(jiǎn)單易行，快速高效，成本低廉，為肺癌的診斷和治療提供有意義的參考數(shù)據(jù)。
【專利說(shuō)明】肺癌易感基因的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs7975232的檢測(cè)方 法及檢測(cè)試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，涉及人維生素 D受體基因 （VDR gene)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP)位點(diǎn) rs7975232 及其與 原發(fā)性支氣管肺癌相關(guān)性的檢測(cè)。本發(fā)明還涉及檢測(cè)這個(gè)SNP位點(diǎn)的方法和試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 研究顯示，肺癌（lung cancer)是一種多因素、多基因疾病，由環(huán)境與遺傳因素共 同致病的常見(jiàn)而多發(fā)的惡性腫瘤，對(duì)人類健康造成了極大的影響。隨著分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展， 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的肺癌相關(guān)基因，但是肺癌的發(fā)病機(jī)制仍然不完全清楚，肺癌的早期 診斷和預(yù)防問(wèn)題仍然未能完全解決。肺癌是遺傳因子和環(huán)境共同作用的結(jié)果，由于環(huán)境因 素(如吸煙、大氣污染）是可以控制和確認(rèn)的，而對(duì)肺癌遺傳學(xué)因素卻是固定不變的。因此， 對(duì)可變因素的控制，如對(duì)肺癌危險(xiǎn)因素的預(yù)防，可以在一定程度上延緩和防止肺癌的發(fā)病， 但是對(duì)固定不變的遺傳因素的認(rèn)識(shí)不足卻在一定程度上嚴(yán)重影響著對(duì)肺癌發(fā)病、診斷和治 療。因此對(duì)肺癌遺傳學(xué)的研究十分必要（Alberg AJ, Brock MV, Samet JM. Epidemiology of lung cancer:looking to the future[J]. J Clin Oncol. 2005;23:3175-3185)。
[0003] 近年來(lái)，有關(guān)肺癌治療的研究更多地集中在肺癌的治療領(lǐng)域，在肺癌化療、靶向治 療方面國(guó)內(nèi)外已取得突飛猛進(jìn)的發(fā)展。但是，這些手段并不能從根本上控制肺癌發(fā)??；目 前對(duì)人類肺癌驅(qū)動(dòng)基因的研究雖有一定進(jìn)展，但仍十分有限。因此，從肺癌發(fā)病相關(guān)基因入 手，研究肺癌發(fā)病機(jī)制是今后肺癌防治研究的主要方向之一，具有重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用 前景，如果通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源性抑癌機(jī)制治療肺癌，將會(huì)促進(jìn)我國(guó)生物醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，并為我 國(guó)每年節(jié)省巨大的醫(yī)療費(fèi)用。
[0004] 大量針對(duì)肺癌的基礎(chǔ)研究顯示，維生素 D與抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抗新生血管形成、 抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多種機(jī)制相關(guān)。人類VDR基因定位于12ql2_14,包含11個(gè)外 顯子。在人體代謝通路中，維生素 D的活化形式1，25 (OH) 2D3通過(guò)與維生素 D受體（VDR)結(jié)合 而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，因此VDR的表達(dá)決定了 1，25 (OH) 2D3能否有效發(fā)揮作用，故VDR基因被 認(rèn)為可能與肺癌發(fā)病相關(guān)(李榕，韓寶惠.維生素 D與肺癌[J].腫瘤，2010 ;30 :443-446)。 rs7975232位點(diǎn)是VDR基因常見(jiàn)的酶切位點(diǎn)，但與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性研究較少，沒(méi)有證 實(shí)rs7975232與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性的報(bào)道。
[0005] 綜上所述，為了最終實(shí)現(xiàn)治療肺癌，本領(lǐng)域迫切需要尋求原發(fā)性支氣管肺癌易感 基因，并開(kāi)發(fā)檢測(cè)原發(fā)性支氣管肺癌易感基因的方法、試劑盒，以及相關(guān)的治療藥物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)(包括早期診斷）肺癌易感基因單核苷酸多態(tài)性位 點(diǎn)的方法及檢測(cè)試劑盒。
[0007] 本發(fā)明提供了一種肺癌易感性基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)方法，即檢測(cè)VDR 基因 rs7975232位點(diǎn)的基因型，rs7975232帶有C基因型的個(gè)體肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著高于 普通人群。
[0008] 所述的rs7975232,位于VDR的啟動(dòng)子中（片段重疊群contig :NT_029419. 12位置 10382143C/A)其中，脫氧核糖核酸（DNA)序列編號(hào)：rs7975232位置基于SEQ ID NO :1/6 ; 引物1基于SEQ ID NO :2/6 ;引物2基于SEQ ID NO :3/6 ;探針1基于SEQ ID NO :4/6 ;探 針2基于SEQ ID NO :5/6 ;擴(kuò)增產(chǎn)物基于SEQ ID NO :6/6。
[0009] 具體而言，該方法包括步驟：（a)抽提樣品的基因組DNA，擴(kuò)增獲得VDR基因啟動(dòng) 子；(b)檢測(cè)步驟（a)產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs7975232的基因型。
[0010] 所述的擴(kuò)增VDR基因啟動(dòng)子的引物序列如SEQ ID N02和SEQ ID N03所示。
[0011] 所述的檢測(cè)rs7975232的基因型的探針序列如SEQ ID N04和SEQ ID N05所示。
[0012] 上述方法中涉及的測(cè)序、擴(kuò)增、抽提基因組DNA等技術(shù)均可采用本領(lǐng)域的常規(guī)操 作方法。
[0013] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)肺癌易感基因的試劑盒，它含有與位點(diǎn)rS7975232結(jié)合的 探針。
[0014] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，與位點(diǎn)rs7975232結(jié)合的探針的序列如SEQ ID N0:4 和 SEQ ID NO : 5 所示。
[0015] 上述試劑盒還可以包括特異性擴(kuò)增VDR基因啟動(dòng)子中包含rs7975232位點(diǎn)的區(qū)域 的引物。
[0016] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，與特異性擴(kuò)增VDR基因啟動(dòng)子中包含rs7975232位點(diǎn) 的區(qū)域的引物的序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示。
[0017] 本發(fā)明經(jīng)過(guò)多年研究，首次證明了 VDR基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs7975232(位于 VDR啟動(dòng)子中，片段重疊群contig :NT_029419. 12位置10382143C/A)與肺癌密切相關(guān)，而 且發(fā)現(xiàn)了它的新功能=VDR基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs7975232位于VDR，啟動(dòng)子中（片段重 疊群contig :NT_029419. 12位置10382143C/A)基因型的改變將導(dǎo)致肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高， 其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在VDR基因 rs7975232A - C在病例和對(duì)照組中的分布存在顯著性 差異（p〈0. 05)，該SNP多態(tài)性可改變轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0018] 本發(fā)明提供了一種對(duì)個(gè)體的肺癌易感性進(jìn)行判斷的方法，它包括步驟：檢測(cè)該個(gè) 體的VDR基因 rs7975232位點(diǎn)的基因型，以此判斷該個(gè)體患肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是否高于普通 人群。
[0019] 在一優(yōu)選例中，所述的差異是選自rs7975232的單核苷酸多態(tài)性。rs7975232位 于VDR，啟動(dòng)子中（片段重疊群contig :NT_029419. 12位置10382143C/A)。其中，脫氧核糖 核酸（DNA)序列編號(hào)：rs7975232位置基于SEQ ID NO :1/6。
[0020] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)樣品是否存在VDR基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，包括步 驟：
[0021] (a)用VDR基因啟動(dòng)子特異性引物擴(kuò)增樣品的基因組DNA，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和
[0022] (b)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs7975232的基因型。
[0023] VDR基因的詳細(xì)序列可參見(jiàn)登錄號(hào)為rs7975232的核苷酸序列（可參見(jiàn)網(wǎng)址 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
[0024] 本發(fā)明人對(duì)VDR基因中的啟動(dòng)子中（片段重疊群contig :NT_029419. 12位置 10382143C/A)區(qū)域進(jìn)行了測(cè)序。
[0025] VDR基因 rs7975232位點(diǎn)的多態(tài)性可直接用于肺癌的個(gè)性化治療。在使用本發(fā)明 VDR基因 rs7975232位點(diǎn)的多態(tài)性時(shí)，還可同時(shí)使用其他治療肺癌的藥劑。
[0026] 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效的本發(fā)明VDR蛋白以及藥學(xué)上 可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于）：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙 醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式， 例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠 囊之類的藥物組合物，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊在 無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天〇. 1微克/千克體重-約10 毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
[0027] 使用所述的藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的VDR蛋白或其拮抗劑、激動(dòng)劑施用 于普哺乳動(dòng)物，其中該安全有效劑量通常至少約〇. 1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下 不超過(guò)約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0. 1微克/千克體重-約100毫克/千克 體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范 圍之內(nèi)。
[0028] 檢測(cè)VDR基因的rs7975232的基因型可為進(jìn)一步診斷肺癌提供有意乂的參考數(shù) 據(jù)。檢測(cè)可以針對(duì)基因組DNA，也可針對(duì)VDR基因的擴(kuò)增片段。VDR基因的rs7975232的基 因型可采用已有的技術(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。
[0029] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)原發(fā)性支氣管肺癌易感性基因的方法，它包括檢測(cè)維生素 D受體基因（VDR)的rs7975232位點(diǎn)的基因型，rs7975232帶有C基因型的個(gè)體，肺癌的易 感性顯著高于普通人群。本發(fā)明還公開(kāi)了相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒,該試劑盒含有擴(kuò)增rs7975232 位點(diǎn)的引物，還可以包括擴(kuò)增VDR基因啟動(dòng)子區(qū)域的引物。利用本發(fā)明檢測(cè)rs7975232位 點(diǎn)的基因型，方法簡(jiǎn)單易行，快速高效，成本低廉，為提供簡(jiǎn)捷的肺癌的診治新途徑提供有 意義的參考數(shù)據(jù)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1是VDR基因 rs7975232位點(diǎn)基因型的檢測(cè)結(jié)果。
[0031] 圖2是測(cè)序結(jié)果截圖，顯示了 rs7975232的一種SNP基因型的測(cè)序結(jié)果，其中， rs7975232 位于 VDR，啟動(dòng)子中（片段重疊群 contig :NT_029419. 12 位置 10382143C/A)。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克?。粚?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0033] 實(shí)施例1 熒光PCR檢測(cè)
[0034] 一、實(shí)驗(yàn)材料
[0035] 7900HT熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，聚合酶鏈反應(yīng)液（TaqMan EXPress Master Mix)由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI)定制合成。
[0036] 二、引物及探針設(shè)計(jì)與合成：
[0037] 以VDR基因啟動(dòng)子的部分序列為模板，使用Primer ExpreSSTM2.0軟件分析 TaqMan引物和探針位點(diǎn)，并由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI)定制合成。
[0038] 檢測(cè)用引物：
[0039] VDR基因 rs7975232 上游引物序列：5 ' -TGTACGTCTGCAGTGTGTTGGAC-3 '（SEQ ID N02)
[0040] VDR 基因 rs7975232 下游引物序列：5 ' -AGGTCTGGATCCTAAATGCACG-3 ' (SEQ ID N03)
[0041] 熒光探針：
[0042] VDR 基因 rs7975232 熒光探針 I :5 ' -VIC-AGCTGGGCACCTCACTGC-TAMRA-3 ' (SEQ ID N04)
[0043] VDR 基因 rs7975232 熒光探針 2 :5 ' -FAM-AGCTGGGCCCCTCACTGC-TAMRA-3 ' (SEQ ID N05)
[0044] 三、樣本檢測(cè)：
[0045] 實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)72例肺癌病例和67例正常對(duì)照人群，每例收集血樣標(biāo)本約2ml，用酚 /氯仿抽屜基因組DNA，抽提結(jié)果用微量紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)（INFINIGEN公司）檢測(cè)。
[0046] 按如下體系進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，最后用SDS2. 3掃描并聚類分析
[0047]

【權(quán)利要求】
1. 一種肺癌易感性基因的檢測(cè)方法，其特征在于，檢測(cè)VDR基因 rs7975232位點(diǎn)的基因 型，rs7975232帶有C基因型的個(gè)體肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著高于普通人群。
2. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，rs7975232位點(diǎn)位于VDR基因啟動(dòng)子 內(nèi)。
3. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括步驟： (a) 抽提樣品的基因組DNA，擴(kuò)增獲得VDR基因啟動(dòng)子中包含rs7975232位點(diǎn)的區(qū)域； (b) 檢測(cè)步驟（a)產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs7975232的基因型。
4. 如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，擴(kuò)增VDR基因啟動(dòng)子中包含rs7975232 位點(diǎn)的區(qū)域的引物序列如SEQ ID N02和SEQ ID N03所示。
5. 如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，檢測(cè)rs7975232的基因型的探針序列如 SEQ ID N04 和 SEQ ID N05 所示。
6. -種檢測(cè)肺癌易感基因的試劑盒，其特征在于，它含有與位點(diǎn)rs7975232結(jié)合的探 針。
7. 如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，與位點(diǎn)rs7975232結(jié)合的探針的序列如 SEQ ID NO :4 和 SEQ ID NO :5 所示。
8. 如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，它還包括特異性擴(kuò)增VDR基因啟動(dòng)子中包 含rs7975232位點(diǎn)的區(qū)域的引物。
9. 如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，特異性擴(kuò)增VD R基因啟動(dòng)子中包含 rs7975232位點(diǎn)的區(qū)域的引物的序列如SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104419759SQ201310401408
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月5日
【發(fā)明者】韓寶惠, 李榕, 樓煜清, 張巖巍, 李營(yíng) 申請(qǐng)人:上海市胸科醫(yī)院