專利名稱：大豆根際土壤微生物群落宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境微生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及大豆根際土壤微生物群落宏基因組 文庫(kù)的構(gòu)建及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由于培養(yǎng)條件和技術(shù)手段的限制，傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法獲得的微生物可能還不 到自然界中實(shí)際微生物總數(shù)的1%。為了更真實(shí)全面地反應(yīng)土壤微生物多樣性情況及開 發(fā)利用土壤中未可培養(yǎng)微生物資源，一種基于直接提取土壤微生物DNA并將其克隆到合適 的載體再導(dǎo)入宿主菌中構(gòu)建基因組文庫(kù)的方法逐漸發(fā)展起來，這就是土壤宏基因組學(xué)。宏 基因組學(xué)作為一種探索微生物多樣性的強(qiáng)有力工具，經(jīng)過十余年的發(fā)展，可以超越培養(yǎng)手 段而直接獲得新穎的生物催化劑和有價(jià)值的活性物質(zhì)(Handelsman，2004，Microbiol Mol Biol Rev. ；Streit et al. ,2004,Curr Opin Biotechnol. ；Schmeisser et al. ,2007,Appl Microbiol Biotechnol.)。宏基因組文庫(kù)促使人們將目光轉(zhuǎn)向微生物群落和功能研究上， 為未培養(yǎng)微生物遺傳信息的研究提供方法和手段，并用以解決醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)上的問題。宏基因組決定了生物群體的生命現(xiàn)象，包含了遠(yuǎn)比可培養(yǎng)的微生物類群更海量 的遺傳信息。國(guó)外已有很多從不同環(huán)境樣品的宏基因文庫(kù)中通過功能性篩選獲得新的抗 生素、脂肪酶、幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、DNA連接酶、膜蛋白、4-羥基丁酸脫氫酶等合成基因或基 因簇，以及對(duì)群落結(jié)構(gòu)組成和功能進(jìn)行分析的報(bào)道(Herme et al.，1999，Appl Environ Microbiol. ；Entcheva etal. ,2001, Appl Environ Microbiol. ；Beja et al. , 2002, Appl Environ Microbiol. ；Rolf Daniel,2005, Nature ；Yun et al. ,2004, Appl Environ Microbiol. ；Pathak et al. ,2009, Environ Microbiol·)。國(guó)內(nèi)也逐步開展起相關(guān)研究 (Liu et al. , 2009, Appl Microbiol Biotechnol·)。微生物生態(tài)學(xué)研究為更好的認(rèn)識(shí)環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)、變化以及微生物在其中 的活動(dòng)提供了理論依據(jù)，而分子生物學(xué)方法的引入讓我們能更充分了解土壤中的微生物群 落。而這些方法的共同基礎(chǔ)，是從土壤中提取大量不含抑制物并且具有典型群落代表性的 微生物總DNA，這也是宏基因組文庫(kù)構(gòu)建過程中至為關(guān)鍵的第一步。因此需要盡可能地使 所提取的基因組DNA具有代表性，保持較大片段以增加獲得完整的目的基因或基因簇的 可能，還要達(dá)到較高的純度以增加建庫(kù)效率。為了達(dá)到這些要求，很多實(shí)驗(yàn)室致力于摸索 DNA提取的最佳條件，也有研究者將環(huán)境樣品經(jīng)過有針對(duì)性地富集后再進(jìn)行DNA提取，但富 集培養(yǎng)極可能會(huì)導(dǎo)致樣品中微生物多樣性的降低。通過設(shè)計(jì)根際箱系統(tǒng)獲得根際土壤可 用于提取土壤總DNA，但仍然難以完全排除根毛對(duì)微生物基因組DNA的影響。而采用一種 以Nycodenz為介質(zhì)的高速密度梯度離心法，來回收和純化細(xì)菌細(xì)胞(Bertrand，et al., 2005，J Microbiol. ；Amalfitano，et al. ,2008, J Micobiol Meth.)則可獲得高純度的土 壤微生物DNA。這種“間接”的方法更適合提取未降解的DNA，因?yàn)榧?xì)菌團(tuán)處于Nycodenz介 質(zhì)中從而限制了 DNA和土壤組分的接觸，對(duì)于去除粘性土壤中腐植酸和金屬離子等效果顯 著。雖然操作難度和成本較高，但可以得到濃度和純度很高，片段較大的基因組DNA，為后續(xù)的酶切操作和構(gòu)建高質(zhì)量的文庫(kù)奠定了很好的基礎(chǔ)。大豆作為一種重要的油料農(nóng)作物，為我國(guó)食物的主要植物蛋白來源，同時(shí)又是具 高效“固氮作用”可用于改良土壤的植物。通過構(gòu)建大豆根際微生物宏基組文庫(kù)，有助于比 較完整地闡述根際微生物群落的多種特征。通過隨機(jī)挑取克隆并進(jìn)行序列測(cè)定，來鑒定和 表征根際范圍內(nèi)微生物所有存在的基因，從而了解不可培養(yǎng)微生物新的代謝途徑、基因調(diào) 控因素、未知功能基因及對(duì)病原物具有抗性的基因等。因此通過構(gòu)建根際土壤宏基因組文 庫(kù)并對(duì)部分克隆進(jìn)行測(cè)序，有助于明確根際微生物群落(包括固氮菌群)結(jié)構(gòu)、遺傳、功能 多樣性，深入探討其在改善土壤營(yíng)養(yǎng)狀況中的作用機(jī)制，對(duì)于完整揭示整個(gè)土壤微生物群 落的生態(tài)過程和功能具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問題是構(gòu)建一個(gè)能夠反映大豆根際微生物群落原位生態(tài)的宏 基因組文庫(kù)及獲得新的基因序列。(1)本發(fā)明的技術(shù)方案為通過高速密度梯度離心法獲得純凈但代表原位狀態(tài) 的根際微生物菌體細(xì)胞，提取基因組DNA后酶切回收2_8Kb的片段，與酶切并去磷酸化的 PUC19連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株并通過藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆組成一個(gè)含9504 個(gè)克隆的宏基因組文庫(kù)。隨機(jī)挑取4個(gè)陽性克隆并兩端測(cè)序，經(jīng)Blast比對(duì)證實(shí)SM-2為新
序列。
本發(fā)明所提供的宏基因組文庫(kù)隨機(jī)挑選的克隆SM-I的全序列，是具有SEQID Nol的cDNA序列
cgcctggagcactacctgctggagcaaggccatgcggtgctcagcgcctcgtccctggag60
gcggcgctggaccatttgaactccgccgtggtgatcgacctgttcctgctcgatgaacag120
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gaaagcccggcctgacagcctgatccatgacaacagcgtgaactgagaggagacttgcga960
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tcgaggatcaggtcgcgcttgatgcggccgatcaggtcgtccagcaactgCtggtg1976
本發(fā)明所提供的宏基因組文庫(kù)隨機(jī)挑選的克隆SM-2正向測(cè)序片段序列，是具有SEQID No2的DNA序列
agccatcacaaggcggcgttcgtgaccgactacttctgcacgggatcgtcgtgctcgaac60
gacgtcaattccctcacgccgcagcaagtcgattgggcgctggcctcatacgcgatcggc120
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ggcatcgattcgcaatgtcgcgtacgtcga ccgatctccg ccatggaaga tttcccgcca1080
本發(fā)明所提供的宏基因組文庫(kù)隨機(jī)挑選的克隆SM-2反向測(cè)序片段序列，是具有SEQID No3的DNA序列
cgcatcggccgggacgagtcctagttttcgcgcgacgtacgcagatccgactgtggggtg60
tcctgcgaaaagcatttcttgcgcgggcgtaaagatgcgcacgcgaacgtcgcaatcagg120
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5
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cctattcgcgggaagacgctgcccgcgcgcgttagtgcctgccgcgtactcggaattgga1080
cgacggcagtcgccttcgtattccgattgc acgcccgctg gcattggcttgctggaacga1140
gttgaaattccga1153
本發(fā)明所提供的宏基因組文庫(kù)隨機(jī)挑選的克隆SM-3正向測(cè)序片段序列，是具有SEQID No4的DNA序列
caccgctataccctggaaagcaccatggaagtgctcgccggcgaggccttcgacggctgg60
cagatcagcgagcacggcctgcgctaccagctggacctgggccgcaagcagaacaacggc120
ctgttcctcgacatgcgctacggccgccagtgggtgcaggccaacgccgcCgggCtgCgC180
gtgctcaacctgttcgcctacacctgtggcttctccgtggcggcgatggcCggCggtgCg240
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cgcctgaacggccacgacctgtcgaaggtgagcttcctcgaccacgacctgttcaagtcc360
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cagaaaggcagcttcgtcctcgacaaggactacgcccgcgtcctgcgccgcctgccggaa480
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gaagcgatacccatcgatcctgcgcacctagccccatgggtatcgcaagctccaccccac780
ccattctacaagcgccccgtaagggcgg808
本發(fā)明所提供的宏基因組文庫(kù)隨機(jī)挑選的克隆SM-3反向測(cè)序片段序列，是具有SEQID No5的DNA序列
gttgccgaagaacagcaggcgcaggcggtcgcacagcggcgtggccaccagggtgtagag60
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gtgctcgtagagctcggccttcttcagcgcgccgcgcggcaggtcatcgcgaaagcgcgc180
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gatcagcccctctcccctgggagagggttggggtgagtggatgctcacgcacccatattt840
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gtgaagcggaggctctgctcttcggtaaggag932
本發(fā)明所提供的宏基因組文庫(kù)隨機(jī)挑選的克隆SM-4正向測(cè)序片段序列，是具有SEQID No6的DNA序列
acactgtactgttttcttcaataaatgtggttgcgtagtgttctaaatgctcttccatca60
attgagttgcgcgcttttcatcgccttgttcaatggcatctaaaattgcacggtgttcat120
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gcttttttacagtggcaatttcaagcatgctgcgtgcttcQ-Q-Q-Q-Q-C C C tttgtttcat420
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actatgtgctgctgaacaattcaacaataaaccttaaaatatccacttatacatctaaat840
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C Cclclclclt C Ccltaccagtttaaatgactcataagcgctacttctaaatttgcataactttt960
gctcaattagattgtgcaac3. 3.3.3. 3. cacattggta cacatttaatttcatttctt1020
taagacggaaaacatgctgcctgaagtgactcatctagga agtgagtgtc agatgatata1080
ccgacgcatatgagctctta tgatgcaaaa ctggac1116
本發(fā)明所提供的宏基因組文庫(kù)隨機(jī)挑選的克隆SM-4反向測(cè)序片段序列，是具有SEQID No7的DNA序列
caacgccgtcaataacgattacgcctaactcgttttgtagctttagacac60
tacctgcacaccctaaaacaatcgcatcgcttttatcttcagcgagtgcttttttgcatt120
catctcgtatggttcgataagcatctgagtcaggaagctccaatttttcaacggcaatgt180
cacaagctcgaacatttttgcaaaatggcgtagccccatagcgttgagccagatgccagc240
tcatattcactgtgcgttgtaaggttgtcaccacactaaaaccggtactgacataacttg300
cagttcgcatagctgcttcggcaatcccaatcacaggtgccgaagtgatttcacgggcgg360
cataaagcgcaggatcaccaaaacaggcaatgatataggcatctacattttgctgttcac420
cttggcgaatttcctctaacacacctacggcacttagtgcttcatcataataactttcaa480
tcgttgcagggcccatttgaggactcaccgcaataatttgagtaccagaacctgcgacta540
tatttgctgatgcagcaattttttcagtcatgctttgagtggtattaggattaataatgt600
taattttcattgtacttttaccttagtcattgccgatttagcatgggcaagcggttggtt660
aagaaatcggtaaatgacaaaaccgaatcccatcccaataaaccatgtgaaattagccag720
cccagaaagttgcggtaaaagtacgcagagaataggaattaatgaagcaggaattaaggc780
ataaaaggcagagtggttataaccatttttgtaccaatacaaacctttagtatctaaggt840
atatagatcatccacttcgattttttgttttttaacgaggtaaaaatcgggcgagcaata900
caccaaaaagtggaccgataaatgcgcctaaaatatcatgttgtaatgatcacttgaggt960
￡Ι ￡1￡1￡Ι ￡1￡1￡Ι tccatggggtatgaaaattg aactactgctgcatcaatcc acccatgcgc1020
actagtttggctcgtgaaacatagaaaattcagccagtga ctagtagcga cattaatccg1080
atgtgccatcatagtcagctactcaatcacctaaggttatcagttgccaccat1133
所用的基因組DNA提取方法為細(xì)菌基因組DNA提取法，DNA和pUC19載體酶切時(shí)
使用的內(nèi)切酶為I3St I，酶切后的DNA片段與載體連接時(shí)使用T4DNA Ligase0連接產(chǎn)物采 用CaC12轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。(2)本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果是我們通過根際箱系統(tǒng)，收集大豆根際土壤樣本，使用高速密度梯度離心法分離、純 化獲得菌體細(xì)胞，從而得到大片段、高濃度、高純度的基因組DNA。既能代表大豆根際微生物 群落的原位狀態(tài)，又可無須純化直接進(jìn)行后續(xù)的酶切等分子生物學(xué)操作，并且能夠有效排 除植物和微生物互作研究中植物根系殘留物對(duì)微生物基因組的影響。從構(gòu)建的文庫(kù)中隨機(jī) 挑取克隆進(jìn)行兩端測(cè)序后，經(jīng)由生物信息學(xué)的方法證實(shí)存在未見報(bào)道過的新序列。因此，我 們構(gòu)建的這個(gè)包含9504個(gè)陽性克隆的宏基因組文庫(kù)存在新的微生物基因序列，對(duì)于從生 態(tài)基因組的角度闡述大豆根際微生物群落生態(tài)及其功能具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值。


圖1用于獲得大豆根際土壤樣本的根際箱示意圖(Α為大豆生長(zhǎng)區(qū)，B為根際區(qū)，C 和D為水)圖2高速密度梯度離心法回收得到的菌體細(xì)胞(Α為菌體細(xì)胞帶)圖3細(xì)菌基因組總DNA電泳4不同限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA后效率比較電泳5基因組DNA酶切圖譜圖6與載體連接后的外源DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后藍(lán)白斑篩選圖7陽性克隆保存圖8克隆菌檢與質(zhì)量驗(yàn)證
具體實(shí)施例方式
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實(shí)施例1、大豆根際土壤樣本的獲得與菌體回收通過在根際箱(圖1)中定期取樣，獲得大豆根際土壤樣本，置于-20°C冰箱備用。 利用高速密度梯度離心法回收菌體新鮮土壤樣品加入焦磷酸鈉緩沖液)，勻漿分散 土壤顆粒后低速離心(15°C，280g，aiiin)得到上清液，然后將上清液高速離心(IOOOOg)得 到菌泥沉淀。用0. 8%的氯化鈉溶液重懸后，將Nycodenz (Axis-shied Poc, Oslo, Norway) 溶液(8g/10ml)加入離心管底部托起泥漿，使用甩平轉(zhuǎn)子進(jìn)行密度梯度離心G°C，14500g， 90min)。吸出白色的細(xì)胞層(菌體帶)(圖2)，用0. 8%的氯化鈉溶液稀釋后高速離心， 15000g,20min)獲得菌體沉淀。密度梯度離心法操作難度較高，但可以有效排除根際樣品中 根毛的影響，且為后續(xù)操作中得到高純度的基因組DNA提供保證。利用該菌體提取純化流 程獲得的菌體最終得率在30%以上，且獲得的菌體細(xì)胞在一定程度上代表了原始土壤中的 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性，并能直接用于較大片段DNA分離提取，無需再純化。實(shí)施例2細(xì)菌基因組總DNA的提取與酶切按照細(xì)菌基因組DNA的提取方法，提取得到高純度、高濃度，可直接用于后續(xù)酶 切操作的基因組總DNA( > 23Kb)(圖3)。將得到的每份樣品的DNA分別測(cè)定濃度后，等 量混合作為一份總基因組DNA樣品進(jìn)行后續(xù)操作。經(jīng)稀釋測(cè)定濃度后，建立60ul酶切體 % :10XBuffer6y L, Pst I 或 EcoR I 或 Hind III (TaKaRa Biotech. Co. , Ltd. , Dalian, 01土皿)3111^，模板0嫩33111^，滅菌水補(bǔ)齊到60 μ L。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，同等條件下酶切效率為 Pst I > EcoR I > Hind III (圖4)，故使用使用I^st I酶切(圖5)?；厥漳繕?biāo)片段范圍 為2-8Kb，為了提高大片段酶連和轉(zhuǎn)化效率，需要分開回收。一部分為2-5Kb，另一部分為 5-8Kb，分別回收純化備用。實(shí)施例3酶切片段與載體連接及轉(zhuǎn)化將使用Pst I 酶切后的 PUC19 載體(TaKaRa Biotech. Co.，Ltd.，Dalian, China) 去磷酸化后過Gel extraction kit中的純化小柱(Omega Bio-Tek，USA)純化，然后按比 例與酶切后的基因組DNA連接。酶連體系為=IOXiMDNALigase Buffer (TaKaRa Biotech. Co.，Ltd.，Dalian, China) 2 μ L, DNA 片段 12 μ L, pUC19 3 μ L, T4DNALigase 1 μ L,滅菌水補(bǔ) 平至20yL，16°C酶連過夜。實(shí)施例4挑取陽性克隆與菌檢驗(yàn)證將含有約5ug外源DNA的連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化DH5 α高效感受態(tài)細(xì)胞(Tiangen， Beijing，China)。每管連接產(chǎn)物QOul)轉(zhuǎn)化4管感受態(tài)細(xì)胞，復(fù)蘇后每管菌液均勻分開涂 布2-3塊直徑12cm平板預(yù)先涂布X-Gal和IPTG(Amresco)。37°C培養(yǎng)12 16h后，藍(lán) 白斑法篩選含有重組質(zhì)粒的陽性克隆(圖6)。共計(jì)轉(zhuǎn)化30管感受態(tài)細(xì)胞，涂布約80塊左 右平板，得到9504個(gè)陽性克隆(圖7)。每板隨機(jī)挑取5個(gè)克隆進(jìn)行PCR菌檢(圖8)。完 整基因文庫(kù)應(yīng)包含的克隆數(shù)目，預(yù)測(cè)公式為Ν= 1η(1-ρ)/1η(1- ·)。實(shí)施例5陽性克隆測(cè)序與功能分析隨機(jī)挑取陽性克隆兩端測(cè)序，得到的序列(SEQ ID Nol,SEQ ID No2，SEQ ID No3， SEQID No4，SEQ ID No5，SEQ ID No6)去除兩端引物后，進(jìn)行BLAST-N鑒定分析。比對(duì)分析 表明，SM-2(SEQ ID No2)與已知序列同源性很低，為新序列。
權(quán)利要求
1.一種大豆根際土壤宏基因組文庫(kù)，其特征是將提取的土壤微生物DNA進(jìn)行酶切后獲 得的2-81Λ的DNA片段連接入pUC19載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過藍(lán)白斑篩選獲得的9504個(gè) 陽性克隆。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆根際土壤宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征是將土壤 樣本勻漿并經(jīng)Nycodenz介質(zhì)高速密度梯度離心后，獲得純凈的根際微生物菌體細(xì)胞，提取 DNA并酶切回收2-8Kb的目標(biāo)片段，連接pUC19載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過藍(lán)白斑篩選獲得 陽性克隆。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆根際土壤宏基因組文庫(kù)中的所有克隆在微生物資源開 發(fā)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于環(huán)境微生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及大豆根際土壤宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建及其應(yīng)用，其特征包括根際土壤樣本獲得、菌體細(xì)胞回收、細(xì)菌基因組DNA提取、DNA酶切及與pUC19連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌后藍(lán)白斑篩選得到陽性克隆，及構(gòu)建成含9504個(gè)陽性克隆的宏基因組文庫(kù)，隨機(jī)挑取克隆測(cè)序并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。該發(fā)明在明確根際微生物群落(包括固氮菌群)結(jié)構(gòu)、遺傳、功能多樣性具有重要的意義，并為深入探討其在改善土壤營(yíng)養(yǎng)狀況中的作用機(jī)制、開發(fā)利用大豆根際土壤中的不可培養(yǎng)微生物資源及深入揭示整個(gè)土壤微生物群落的生態(tài)過程和功能提供重要的信息，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C40B50/06GK102071471SQ20101061434
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者孔令如, 戚金亮, 李永春, 李愛倩, 楊永華, 楊統(tǒng)一, 湯程貽, 王焱, 黃惺祺 申請(qǐng)人:南京大學(xué)