本發(fā)明涉及腫瘤基因領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤的引物組及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：腦膠質(zhì)瘤(別名：神經(jīng)膠質(zhì)瘤英文：glioma)也稱為膠質(zhì)細(xì)胞瘤，是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占所有顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的一半，廣義是指所有神經(jīng)上皮來源的腫瘤，狹義是指源于各類膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤。腦膠質(zhì)瘤死亡率非常高，造成其病死率居高不下的原因是由于腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)部位隱蔽，無法直接看到，早期腦膠質(zhì)瘤癥狀不明顯，仍缺乏簡(jiǎn)便實(shí)用的診斷方法。因此對(duì)腦膠質(zhì)瘤的早期診斷十分必要。目前腦膠質(zhì)瘤的診斷方法包括影像學(xué)檢查，細(xì)胞病理學(xué)和組織病理學(xué)診斷。影像學(xué)檢查包括淋巴造影、ct掃描、核磁共振檢查等，但是其效率較低并且檢測(cè)準(zhǔn)確度不高。通常的細(xì)胞和組織病理學(xué)檢測(cè)包括細(xì)胞活檢，需要通過外科手術(shù)或者穿刺的方法從患者上獲取腫瘤組織的檢材。不但不方便，而且會(huì)對(duì)患者造成人體傷害，甚至可能造成穿刺道腫瘤轉(zhuǎn)移。近來，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcells，ctcs)檢測(cè)的出現(xiàn)給患者的檢測(cè)帶來了新的希望。ctcs是從腫瘤病灶脫離并移位至血液中的腫瘤細(xì)胞，是惡性腫瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要原因，也是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的重要因素。與其他組織學(xué)標(biāo)本如骨髓等相比，外周血標(biāo)本容易獲取，且對(duì)患者創(chuàng)傷小，是臨床上常規(guī)檢測(cè)較為理想的標(biāo)本來源。ctcs檢測(cè)有助于腫瘤的早期診斷、判斷患者預(yù)后、評(píng)估抗腫瘤藥物的療效及制定個(gè)體化治療方案。與傳統(tǒng)的診斷方法相比，ctcs檢測(cè)可更加敏感地發(fā)現(xiàn)疾病的變化，且對(duì)患者沒有副作用。ctc的檢測(cè)通常通過抽取一定體積的血液進(jìn)行。檢測(cè)分為兩類，包括不捕獲(富集)直接檢測(cè)和先捕獲(富集)后檢測(cè)，其中后者為主流的檢測(cè)方法。先捕獲(富集)后檢測(cè)的方法也分為兩類，即正選和負(fù)選。正選主要是通過ctc表面標(biāo)志物或細(xì)胞的物理性質(zhì)(大小、密度)進(jìn)行捕獲；前者是基于免疫磁球技術(shù)和微流控芯片技術(shù)，后者是基于過濾、離心的原理。負(fù)選則是通過白細(xì)胞表面標(biāo)志物間接捕獲ctc。然而基于先捕獲(富集)后檢測(cè)的方法有著明顯的缺陷。它嚴(yán)重依賴于腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)，因此無法捕獲未表達(dá)表面腫瘤標(biāo)記物的ctc細(xì)胞。采用rt-pcr的方法檢測(cè)ctc細(xì)胞的特異性基因是ctc細(xì)胞檢測(cè)的另外一種方式。首先抽取一定體積的血液，通過密度梯度離心的方式富集ctcs，然后通過rt-pcr的方式檢測(cè)特定基因的mrna，以此判斷ctcs是否存在，并通過檢測(cè)ct值的變化給ctcs定量。這種方法檢測(cè)ctcs費(fèi)用低，敏感度高，而且容易自動(dòng)化。目前采用rt-pcr方法檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤ctcs的標(biāo)準(zhǔn)還沒有完全建立。我們通過檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤患者的ctcs特征基因，確定腦膠質(zhì)瘤ctcs的檢測(cè)方法和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。這些檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)的建立有助于腫瘤患者的早期診斷、判斷患者預(yù)后、評(píng)估抗腫瘤藥物，包括nk和car-t免疫治療的療效及制定個(gè)體化治療方案。針對(duì)上述問題，本發(fā)明開發(fā)一種高靈敏的多基因聯(lián)合檢測(cè)的試劑盒，通過聯(lián)合檢測(cè)cea、ck8、epcam、muc1、ck18、ck19和klf4共7個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)腫瘤的早期篩查或診斷。本發(fā)明設(shè)計(jì)運(yùn)用靶向特異性引物組，大幅度提高檢測(cè)的靈敏度。該檢測(cè)方法的檢出率可達(dá)到96％，同時(shí)具備了靈敏度高，特異性好，快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤的引物組及檢測(cè)方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種用于檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤的引物組，包含：本發(fā)明的引物組可通過以下兩種方法實(shí)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤的檢測(cè)。方法1：pcr方法。(1)將權(quán)利要求1所述的7對(duì)引物分別加入到單個(gè)pcr反應(yīng)管中，并均加入核酸提取物、反轉(zhuǎn)錄酶、rna酶抑制劑、dna聚合酶、dntp；其中，pcr反應(yīng)的每個(gè)循環(huán)的條件為94攝氏度、30s；55攝氏度、30s；72攝氏度、10s；(2)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和pcr反應(yīng)，用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行檢測(cè)。方法2：熒光定量pcr方法(1)將權(quán)利要求1所述的7對(duì)引物分別加入到單個(gè)pcr反應(yīng)管中，并均加入核酸提取物、反轉(zhuǎn)錄酶、rna酶抑制劑、dna聚合酶、dntp；分別加入2×chamqsybrqpcrmastermix，其中，pcr反應(yīng)的每個(gè)循環(huán)的條件為95攝氏度、10s和60攝氏度、30s；40個(gè)循環(huán)；每管設(shè)立三個(gè)復(fù)孔；(2)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和pcr反應(yīng)，并實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光；(3)根據(jù)熒光檢測(cè)結(jié)果計(jì)算出的ct值，判斷是否有標(biāo)志物靶基因表達(dá)于樣品中。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過設(shè)計(jì)特異性pcr引物，開發(fā)出用于腦膠質(zhì)瘤早期檢測(cè)的多基因聯(lián)合檢測(cè)方法。此方法：(1)建立的pcr體系可對(duì)cea、ck8、epcam、muc1、ck18、ck19和klf4基因進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)；(2)通過同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤檢出率可達(dá)到96％；(3)靈敏度高，低至1-5拷貝的基因表達(dá)水平均可檢出；(4)特異性較強(qiáng)，正常人或非腦膠質(zhì)瘤病人樣本不會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性信號(hào)；(5)檢測(cè)速度快，操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低廉。附圖說明圖1為實(shí)施例中健康人外周血樣本檢測(cè)陰性pcr圖。圖2為實(shí)施例中非腦膠質(zhì)瘤腫瘤患者外周血樣本檢測(cè)陰性pcr圖。圖3為實(shí)施例中非腦膠質(zhì)瘤患者組織樣本檢測(cè)陰性pcr圖。圖4為實(shí)施例中腦膠質(zhì)瘤患者外周血檢測(cè)陽(yáng)性pcr圖。圖5為實(shí)施例中腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織檢測(cè)陽(yáng)性pcr圖。圖中，m.100bpmarker；1.b2m；2.cea；3.ck8；4.epcam；5.muc1；6.ck18；7.ck19；8.klf4具體實(shí)施方式本發(fā)明針對(duì)目前腫瘤中主要的驅(qū)動(dòng)性突變基因，聯(lián)合檢測(cè)cea、ck8、epcam、muc1、ck18、ck19和klf4共7個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)腦膠質(zhì)瘤的早期篩查或診斷。針對(duì)目前檢測(cè)方法靈敏度低，檢測(cè)過程復(fù)雜繁瑣，檢測(cè)所需時(shí)間長(zhǎng)，無法滿足臨床檢測(cè)的實(shí)際需求。針對(duì)上述問題，設(shè)計(jì)出用于檢測(cè)上述7個(gè)基因的一整套特異性引物組。根據(jù)上述7個(gè)基因的參考序列設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，其pcr產(chǎn)物長(zhǎng)度最優(yōu)是在180-220bp之間，退火溫度不高于60度，gc含量在40-60％之間，符合一般引物設(shè)計(jì)軟件的要求。通過采用實(shí)時(shí)熒光pcr反應(yīng)檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因聯(lián)合的高靈敏檢測(cè)，其檢測(cè)方法如下所述。本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。如未特別指明之處，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的《分子可隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版(coldspringharborlaboratorypress)、《細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，北京，中國(guó)，2001年)、《rna實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)》(科學(xué)出版社，北京，中國(guó)，2004年)、《免疫檢測(cè)技術(shù)》(科學(xué)出版社，北京，中國(guó)，1991)等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)以及本文所引用的參考文獻(xiàn)中所列方法來實(shí)施。其中，所用的(帶標(biāo)記的)探針、引物可以委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1:基因選擇多項(xiàng)研究表明，單基因篩查敏感度約為20-60％，大部分用于腫瘤早期篩查的單個(gè)基因檢測(cè)，其檢測(cè)敏感度或特異度偏低，不能滿足臨床需要。采用多基因聯(lián)合檢測(cè)可以有效解決敏感度低的問題，提高腫瘤早期篩查和診斷的準(zhǔn)確度。為了提高早期腫瘤的檢出率，提高腫瘤患者的治愈率，改善病人預(yù)后，我們對(duì)腦膠質(zhì)瘤和正常組織的差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選。我們通過大量比對(duì)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)cea、ck8、epcam、muc1、ck18、ck19和klf4組成的基因組對(duì)腦膠質(zhì)瘤具有較高的檢出率，達(dá)到96％。實(shí)施例2:引物篩選(1)設(shè)計(jì)引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3，具體為：利用生物信息學(xué)軟件對(duì)靶基因a-g序列進(jìn)行分析，利用序列分析軟件設(shè)計(jì)特異性引物組，利用ncbi引物搜索軟件檢測(cè)各配對(duì)引物在人基因組中的特異性，分別設(shè)計(jì)出3對(duì)特異性擴(kuò)增引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3；表1：pcr檢測(cè)引物(2)外周血樣品的處理收集某醫(yī)院收治并經(jīng)病理證實(shí)的腦膠質(zhì)瘤患者外周血，清晨7點(diǎn)，空腹，經(jīng)肘靜脈采集新鮮血液，存放于抗凝管中，搖勻，常溫下保存≤4h。2.1將抗凝管中的全血樣本加入等體積pbs(ph7.0)，于室溫3000rpm離心5min，去除上層血漿；2.2加入等體積氯化銨紅細(xì)胞裂解液，于室溫200rpm離心8min混勻后，以3000rpm室溫離心5min，棄去上清；2.3將下層血細(xì)胞和生理鹽水按照體積比1:2～2:1混合后，加入ficoll分離液，混合液與ficoll分離液的體積比為1:2～2:1，離心力為700g，離心20～40min；2.4吸棄上清，取細(xì)胞沉淀，洗滌，即得到pbmc；2.5取pbmc用于核酸提取，多余的pbmc用rna保護(hù)劑重懸，保存于-20度。(3)核酸的提取3.1取不多于5×105的pbmc，加入250μlbufferrltplus，吹打混勻；3.2將裂解液轉(zhuǎn)移至gdna清除離心型柱中，8000×g(10,000rpm)離心30s。收集流穿液，棄離心柱；3.3加入1倍體積的70％乙醇(350μl)至流穿液中，吹打混勻；3.4將樣品轉(zhuǎn)移至rneasyminelute離心柱，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；3.5在rneasyminelute離心柱中加入700μlbufferrw1，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；3.6在rneasyminelute離心柱中加入500μlbufferrpe，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；3.7將rneasyminelute離心柱置于新的2ml收集管中，打開蓋子，全速離心5min，使乙醇揮發(fā)；3.8將rneasyminelute離心柱置于新的1.5ml收集管中，加入20μlrnase-freeh2o，蓋緊蓋子，全速離心1min洗脫rna。(4)模板cdna的獲得4.1準(zhǔn)確測(cè)得樣品rna濃度；4.2嚴(yán)格按照cdna反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書在冰上制備反轉(zhuǎn)錄體系；成分體積5×mix8μlrna500ngrnase-freeh2o至40μl4.3混勻以上反應(yīng)體系，并利用離心機(jī)短暫離心，55度20min，85度2min，獲得模板cdna；(5)普通pcr擴(kuò)增用taqdna聚合酶配置反應(yīng)體系，用引物為a-g和人內(nèi)參基因(b2m)進(jìn)行pcr擴(kuò)增各樣品，產(chǎn)物用1％凝膠檢測(cè)；擴(kuò)增體系如下：成分體積2×mix10μlcdna1μl引物-f0.8μl引物-r0.8μlrnase-freeh2o7.4μlpcr反應(yīng)條件是：95℃預(yù)變性3分鐘，1個(gè)循環(huán)；95℃變性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸10秒，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7分鐘。(6)熒光實(shí)時(shí)定量pcr擴(kuò)增根據(jù)設(shè)計(jì)的特異引組a-g，通過熒光定量pcr進(jìn)行擴(kuò)增，體系如下：pcr反應(yīng)條件是：95℃預(yù)變性20s，1個(gè)循環(huán)；95℃10s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)；每管設(shè)立三個(gè)復(fù)孔；根據(jù)步驟5和6的pcr結(jié)果，篩選出以下引物組，作為本發(fā)明用于檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤的引物組。實(shí)施例3：效果驗(yàn)證根據(jù)實(shí)施例2的篩選結(jié)果，采用下表的引物組對(duì)100個(gè)腫瘤樣本進(jìn)行檢測(cè)。序號(hào)多基因聯(lián)合檢測(cè)檢出率1cea、ck8、epcam和muc170％2cea、ck8、epcam、muc1和ck1875％3cea、ck8、epcam、muc1、ck18和klf483％4cea、ck8、epcam、muc1、ck18、ck19和klf496％5cea、ck8、epcam、muc1、ck18、ck19和egfr82％6cea、ck8、epcam、muc1、ck18、ck19和htert84％其中，cea的正向引物為acagtcacgacgatcacagt，反向引物為cagctgcagcctgggactga；ck8的正向引物為gagctagacaagtactggtc，反向引物為cctcaggctgttctccaagc；epcam的正向引物為aatgatgtggacatagctga，反向引物為tagaccctgcattgagaatt；muc1的正向引物為gcctctcgatataacctgac，反向引物為tcggcggcactgacagacag；ck18的正向引物為gagctagacaagtactggtc，反向引物為cctcaggctgttctccaagc；ck19的正向引物為agctggcctacctgaagaag，反向引物為aggcttcagcatccttccgg；klf4的正向引物為cgggaagggagaagacactg，反向引物為ggttgctaccgccgcaagcc；1～6號(hào)引物組的檢出率如上表所示，從表中可以看出，引物組中，隨著引物數(shù)量的增加，在一定程度上可以提高其檢出率。進(jìn)一步地，通過比較1～6號(hào)引物組可以發(fā)現(xiàn)，引物組內(nèi)的組合對(duì)于檢出率的高低有重要影響。同時(shí)在相同的檢測(cè)基因數(shù)量情況下，4號(hào)引物組的檢出率高于5～6號(hào)引物組。因此，我們優(yōu)選4號(hào)引物組的基因組合用于腦膠質(zhì)瘤的檢測(cè)。進(jìn)一步通過研究發(fā)現(xiàn)，4號(hào)引物組中，epcam、ck8、ck18，ck19的表達(dá)可提示上皮細(xì)胞來源的腫瘤,ck的多種組分中ck18與ck19被認(rèn)為有腫瘤轉(zhuǎn)移診斷價(jià)值；muc1在腫瘤組織中多出現(xiàn)異常表達(dá)，在炎癥和腫瘤的進(jìn)展中起著重要的作用；klf4是腫瘤細(xì)胞的干性分子，表達(dá)的高低與腫瘤的惡性程度直接相關(guān)。7對(duì)引物組相鋪相成，使得檢出率得到大幅度提升。綜上所述，本專利中選擇的基因涉及腫瘤的代謝、增殖、侵襲等方面，可較為全面的檢測(cè)出腦膠質(zhì)瘤的細(xì)胞生物學(xué)特征。實(shí)施例4：特異性分析根據(jù)實(shí)施例3的篩選結(jié)果，采用4號(hào)引物組對(duì)正常人外周血樣本(圖1)、非腦膠質(zhì)瘤患者的外周血(圖2)、非腦膠質(zhì)瘤患者的腫瘤組織(圖3)進(jìn)行檢測(cè)。圖中1-8基因分別為：cea、ck8、epcam、muc1、ck18、ck19和klf4檢測(cè)結(jié)果如圖1-5所示，從圖中可見所述的引物組在正常人外周血(圖1)、非腦膠質(zhì)瘤病人的外周血(圖2)和非腦膠質(zhì)瘤病人的組織中(圖3)均未檢測(cè)到較強(qiáng)的基因表達(dá)。在腦膠質(zhì)瘤病人的外周血液樣本(圖4)和組織樣本(圖5)中可檢測(cè)到多個(gè)基因的強(qiáng)表達(dá)，分別為4/7和7/7，說明本專利中所述引物組具有高度的特異性。sequencelisting<110>上海博慷生物科技有限公司<120>一種用于檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤的引物組及檢測(cè)方法<160>14<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工合成<400>1acagtcacgacgatcacagt20<210>2<211>20<212>dna<213>人工合成<400>2cagctgcagcctgggactga20<210>3<211>20<212>dna<213>人工合成<400>3gagctagacaagtactggtc20<210>4<211>20<212>dna<213>人工合成<400>4cctcaggctgttctccaagc20<210>5<211>20<212>dna<213>人工合成<400>5aatgatgtggacatagctga20<210>6<211>20<212>dna<213>人工合成<400>6tagaccctgcattgagaatt20<210>7<211>20<212>dna<213>人工合成<400>7gcctctcgatataacctgac20<210>8<211>20<212>dna<213>人工合成<400>8tcggcggcactgacagacag20<210>9<211>20<212>dna<213>人工合成<400>9gagctagacaagtactggtc20<210>10<211>20<212>dna<213>人工合成<400>10cctcaggctgttctccaagc20<210>11<211>20<212>dna<213>人工合成<400>11agctggcctacctgaagaag20<210>12<211>20<212>dna<213>人工合成<400>12aggcttcagcatccttccgg20<210>13<211>20<212>dna<213>人工合成<400>13cgggaagggagaagacactg20<210>14<211>20<212>dna<213>人工合成<400>14ggttgctaccgccgcaagcc20當(dāng)前第1頁(yè)12