本發(fā)明涉及腫瘤基因領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測肺癌的引物組及檢測方法。
背景技術(shù)：
：肺癌是目前中國和全球最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在中國及全球范圍內(nèi)均居于首位。很多肺癌確診時(shí)已經(jīng)為中晚期或伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其5年生存率約為15％。由于低劑量螺旋CT等新的診斷技術(shù)的應(yīng)用，肺癌的早期診斷能力得到很大提升。但是低劑量螺旋對中央型肺癌以及小肺癌(<3mm)診斷的假陽性率較高，其臨床應(yīng)用受到一定限制。因此，我們需要進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)志物來輔助肺癌的早期檢測與輔助診斷。近來，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CirculatingTumorCells，CTCs)檢測的出現(xiàn)給患者的檢測帶來了新的希望。CTCs是從腫瘤病灶脫離并移位至血液中的腫瘤細(xì)胞，是惡性腫瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要原因，也是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的重要因素。與其他組織學(xué)標(biāo)本如骨髓等相比，外周血標(biāo)本容易獲取，且對患者創(chuàng)傷小，是臨床上常規(guī)檢測較為理想的標(biāo)本來源。CTCs檢測有助于腫瘤的早期診斷、判斷患者預(yù)后、評估抗腫瘤藥物的療效及制定個(gè)體化治療方案。與傳統(tǒng)的診斷方法相比，CTCs檢測可更加敏感地發(fā)現(xiàn)疾病的變化，且對患者沒有副作用。CTC的檢測通常通過抽取一定體積的血液進(jìn)行。檢測分為兩類，包括不捕獲(富集)直接檢測和先捕獲(富集)后檢測，其中后者為主流的檢測方法。先捕獲(富集)后檢測的方法也分為兩類，即正選和負(fù)選。正選主要是通過CTC表面標(biāo)志物或細(xì)胞的物理性質(zhì)(大小、密度)進(jìn)行捕獲；前者是基于免疫磁球技術(shù)和微流控芯片技術(shù)，后者是基于過濾、離心的原理。負(fù)選則是通過白細(xì)胞表面標(biāo)志物間接捕獲CTC。然而基于先捕獲(富集)后檢測的方法有著明顯的缺陷。它嚴(yán)重依賴于腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)，因此無法捕獲未表達(dá)表面腫瘤標(biāo)記物的CTC細(xì)胞。采用RT-PCR的方法檢測CTC細(xì)胞的特異性基因是CTC細(xì)胞檢測的另外一種方式。首先抽取一定體積的血液，通過密度梯度離心的方式富集CTCs，然后通過RT-PCR的方式檢測特定基因的mRNA，以此判斷CTCs是否存在，并通過檢測CT值的變化給CTCs定量。這種方法檢測CTCs費(fèi)用低，敏感度高，而且容易自動(dòng)化。目前RT-PCR方法檢測肺癌CTCs的標(biāo)準(zhǔn)還沒有建立。我們通過檢測肺癌患者的CTCs特征基因，確定肺癌CTCs的檢測方法和檢測標(biāo)準(zhǔn)。這些檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)的建立有助于腫瘤患者的早期診斷、判斷患者預(yù)后、評估抗腫瘤藥物(包括NK和CAR-T免疫治療)的療效及制定個(gè)體化治療方案。針對上述問題，本發(fā)明開發(fā)一種高靈敏的多基因聯(lián)合檢測方法，通過聯(lián)合檢測Survivin、CK7、TTF-1、SKP2、CK19、Folatereceptor、N-cadherin、CD133和hTERT9個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)腫瘤的早期檢測。本發(fā)明設(shè)計(jì)和運(yùn)用靶特異性引物組，大幅度提高檢測的靈敏度。該檢測方法的檢出率可達(dá)到95％，同時(shí)具備了靈敏度高，特異性好，快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于檢測肺癌的引物組及檢測方法，本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種用于檢測肺癌的引物組，包含：本發(fā)明的引物組可通過以下兩種方法實(shí)現(xiàn)肺癌的檢測。方法1：PCR方法。(1)將權(quán)利要求1所述的9對引物分別加入到單個(gè)PCR反應(yīng)管中，并均加入核酸提取物、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTP；其中，PCR反應(yīng)的每個(gè)循環(huán)的條件為94攝氏度、30s；55攝氏度、30s；72攝氏度、10s；(2)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行檢測。方法2：熒光定量PCR方法(1)將權(quán)利要求1所述的9對引物分別加入到單個(gè)PCR反應(yīng)管中，并均加入核酸提取物、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTP；分別加入2×ChamQSYBRqPCRMasterMix，其中，PCR反應(yīng)的每個(gè)循環(huán)的條件為95攝氏度、10s和60攝氏度、30s；40個(gè)循環(huán)；每管設(shè)立三個(gè)復(fù)孔；(2)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，并實(shí)時(shí)檢測熒光；(3)根據(jù)熒光檢測結(jié)果計(jì)算出的Ct值，判斷是否有標(biāo)志物靶基因表達(dá)于樣品中。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過設(shè)計(jì)特異性PCR引物，開發(fā)出用于肺癌早期檢測的多基因聯(lián)合檢測方法。此方法：(1)建立的PCR體系可對Survivin、CK7、TTF-1、SKP2、CK19、Folatereceptor、N-cadherin、CD133和hTERT基因進(jìn)行聯(lián)合檢測；(2)通過同時(shí)對多個(gè)基因進(jìn)行檢測肺癌檢出率可達(dá)到98％；(3)靈敏度高，低至1-5拷貝的基因表達(dá)水平均可檢出；(4)特異性強(qiáng)，正常人或非肺癌病人樣本不會產(chǎn)生非特異性信號；(5)檢測速度快，操作簡單，費(fèi)用低廉。附圖說明圖1為實(shí)施例中健康人外周血樣本檢測陰性PCR圖。圖2為實(shí)施例中非肺癌患者外周血樣本檢測陰性PCR圖。圖3為實(shí)施例中非肺癌患者癌組織樣本檢測陰性PCR圖。圖4為實(shí)施例中肺癌患者外周血樣本檢測陽性PCR圖。圖5為實(shí)施例中肺癌患者組織樣本檢測陽性PCR圖。圖中，M.100bpmarker；1.B2M；2.Survivin；3.CK7；4.TTF-1；5.SKP2；6.CK19；7.Folatereceptor；8.N-cadherin；9.CD133；10.hTERT。具體實(shí)施方式本發(fā)明針對目前肺癌中的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因，通過聯(lián)合檢測Survivin、CK7、TTF-1、SKP2、CK19、Folatereceptor、N-cadherin、CD133和hTERT9個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)肺癌的早期檢測。針對目前檢測方法靈敏度低，檢測過程復(fù)雜繁瑣，檢測所需時(shí)間長，無法滿足臨床檢測的實(shí)際需求。針對上述問題，設(shè)計(jì)出用于檢測上述9個(gè)基因的一整套特異性引物組。根據(jù)上述9個(gè)基因的參考序列設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，其PCR產(chǎn)物長度最優(yōu)是在180-200bp之間，退火溫度不高于60度，GC含量在40-60％之間，符合一般引物設(shè)計(jì)軟件的要求。通過采用實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)檢測體系，實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因聯(lián)合的高靈敏檢測，其檢測方法如下所述。本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。如未特別指明之處，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的《分子可隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版(ColdSpringHarborlaboratoryPress)、《細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，北京，中國，2001年)、《RNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊》(科學(xué)出版社，北京，中國，2004年)、《免疫檢測技術(shù)》(科學(xué)出版社，北京，中國，1991)等實(shí)驗(yàn)手冊以及本文所引用的參考文獻(xiàn)中所列方法來實(shí)施。其中，所用的(帶標(biāo)記的)探針、引物可以委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1:基因選擇多項(xiàng)研究表明，單基因篩查敏感度約為20-30％，大部分用于腫瘤早期篩查的單個(gè)基因檢測，其檢測敏感度或特異度偏低，不能滿足臨床需要。采用多基因聯(lián)合檢測可以有效解決敏感度低的問題，提高腫瘤早期篩查和診斷的準(zhǔn)確度。YuY,XuG等人(YuY,XuG,CaoJetal.Combinationoffourgenemarkerstodetectcirculatingtumorcellsintheperipheralbloodofpatientswithadvancedlungadenocarcinomausingreal-timePCR.OncologyLetters,Volume5,Number4,2013,pp.1400-1406).同時(shí)檢測Survivin、CK7、TTF-1、hTERT基因，結(jié)果表明聯(lián)合檢測4個(gè)基因用于肺癌早期診斷的敏感度為82.35％，準(zhǔn)確率達(dá)86％。為了提高早期腫瘤的檢出率，提高腫瘤患者的治愈率，改善病人預(yù)后，我們對肺癌和正常組織的差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選。我們通過大量比對實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Survivin、CK7、TTF-1、SKP2、CK19、Folatereceptor、N-cadherin、CD133和hTERT組成的基因組對肺癌具有較高的檢出率，達(dá)到98％，相對于現(xiàn)有的檢測技術(shù)，產(chǎn)生了意想不到的技術(shù)效果，具有顯著的進(jìn)步。實(shí)施例2:引物篩選(1)設(shè)計(jì)引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3，具體為：利用生物信息學(xué)軟件對靶基因A-I序列進(jìn)行分析，利用序列分析軟件設(shè)計(jì)特異性引物組，利用NCBI引物搜索軟件檢測各配對引物在人基因組中的特異性，分別設(shè)計(jì)出3對特異性擴(kuò)增引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3；表1：PCR檢測引物(2)外周血樣品的處理收集某醫(yī)院收治并經(jīng)病理證實(shí)的肺癌患者外周血，清晨7點(diǎn)，空腹，經(jīng)肘靜脈采集新鮮血液，存放于抗凝管中，搖勻，常溫下保存≤4hr。2.1將抗凝管中的全血樣本加入等體積PBS(pH7.0)，于室溫3000rpm離心5min，去除上層血漿；2.2向保留液體中，加入等體積氯化銨紅細(xì)胞裂解液(可購自碧云天)，于室溫200rpm離心8min混勻后，以3000rpm室溫離心5min，棄去上清；2.3將下層血細(xì)胞和生理鹽水按照體積比1:2～2:1混合后，加入Ficoll分離液，混合液與Ficoll分離液的體積比為1:2～2:1，離心力為700g，離心20～40min；2.4吸棄上清，取細(xì)胞沉淀，洗滌，即得到PBMC；2.5取PBMC用于核酸提取，多余的PBMC用RNA保護(hù)劑重懸，保存于-20度。(3)核酸的提取3.1取不多于5×105的PBMC，加入250μLBufferRLTPlus，吹打混勻；3.2將裂解液轉(zhuǎn)移至gDNA清除離心型柱中，8000×g(10,000rpm)離心30s。收集流穿液，棄離心柱；3.3加入1倍體積的70％乙醇(350μL)至流穿液中，吹打混勻；3.4將樣品轉(zhuǎn)移至RNeasyMinElute離心柱，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；3.5在RNeasyMinElute離心柱中加入700μLBufferRW1，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；3.6在RNeasyMinElute離心柱中加入500μLBufferRPE，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；3.7將RNeasyMinElute離心柱置于新的2mL收集管中，打開蓋子，全速離心5min，使乙醇揮發(fā)；3.8將RNeasyMinElute離心柱置于新的1.5mL收集管中，加入20μLRNase-freeH2O，蓋緊蓋子，全速離心1min洗脫RNA。(4)模板cDNA的獲得4.1準(zhǔn)確測得樣品RNA濃度；4.2嚴(yán)格按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書在冰上制備反轉(zhuǎn)錄體系；成分體積5×Mix8μLRNA500ngRNase-freeH2O至40μL4.3輕柔混勻以上反應(yīng)體系，并利用離心機(jī)短暫離心，55度20min，85度2min，獲得模板cDNA；(5)普通PCR擴(kuò)增用TaqDNA聚合酶配置反應(yīng)體系，用引物為a-i和人內(nèi)參基因(B2M)進(jìn)行PCR擴(kuò)增各樣品，產(chǎn)物用1％凝膠檢測；擴(kuò)增體系PCR反應(yīng)條件是95℃預(yù)變性3分鐘，1個(gè)循環(huán)；95℃變性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸10秒，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7分鐘。(6)熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增根據(jù)設(shè)計(jì)的特異引組a-i，通過熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，體系如下：成分體積2×ChamQSYBRqPCRMasterMix10μLcDNA2μL引物-F0.4μL引物-R0.4μLRNase-freeH2O7.2μLTotal20μL95℃預(yù)變性20s，1個(gè)循環(huán)；95℃10s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)；每管設(shè)立三個(gè)復(fù)孔；根據(jù)步驟5和6的pcr結(jié)果，篩選出以下引物組，作為本發(fā)明用于檢測肺癌的引物組。實(shí)施例3：效果驗(yàn)證根據(jù)實(shí)施例2的篩選結(jié)果，采用下表所述的引物組對200個(gè)腫瘤樣本進(jìn)行檢測。其中，其中，EPCAM的正向引物為AATGATGTGGACATAGCTGA，反向引物為TAGACCCTGCATTGAGAATT；VEGF的正向引物為GTGCCCGCTGCTGTCTAATG，反向引物為CACATCTGCAAGTACGTTCG。1～7號引物組的檢出率如上表所示，從表中可以看出，引物組中，隨著引物數(shù)量的增加，在一定程度上可以提高其檢出率。進(jìn)一步地，通過比較5～7號引物組可以發(fā)現(xiàn)，引物組內(nèi)的組合對于檢出率的高低有重要影響。同時(shí)在相同的檢測基因數(shù)量情況下，5號引物組的檢出率高于6、7號引物組。因此，我們優(yōu)選5號引物組的基因組合用于肺癌的檢測。進(jìn)一步通過研究發(fā)現(xiàn)，5號引物組中，Survivin在細(xì)胞分化過程中參與了凋亡的調(diào)節(jié)，與腫瘤進(jìn)展過程中有助于細(xì)胞的增殖相關(guān)；CK7、CK19的表達(dá)可提示上皮細(xì)胞來源的腫瘤；TTF-1是轉(zhuǎn)錄激活因子，在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用；SKP2參與細(xì)胞凋亡于周期的調(diào)控，與腫瘤的侵襲性與轉(zhuǎn)移活性相關(guān)；Folatereceptor是一種通過聚糖磷酯酰肌醇連接在細(xì)胞膜上的糖蛋白，在眾多上皮來源的惡性腫瘤中過度表達(dá)；N-cadherin是重要的粘附分子，其表達(dá)下調(diào)或功能喪失與腫瘤失分化、浸潤性生長、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后明顯相關(guān)；CD133是腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物，表達(dá)越高代表腫瘤的惡性程度越高；hTERT是人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶，在人腫瘤組織中過表達(dá)。由上可知，本發(fā)明并不是將9對引物進(jìn)行簡單疊加組合，9對引物相鋪相成，在功能上彼此支持，使得檢出率得到大幅度提升，取得了意想不到的技術(shù)效果。綜上所述，本發(fā)明中選擇的基因涉及腫瘤的代謝、增殖、侵襲等方面，可較為全面的檢測出肺癌的細(xì)胞生物學(xué)特征。實(shí)施例4：特異性分析根據(jù)實(shí)施例2的篩選結(jié)果，采用下表所述的引物組對正常人外周血樣本(圖1)、非肺癌病人的外周血(圖2)和非肺癌病人腫瘤組織樣本(圖3)、肺癌病人的外周血樣本(圖4)和組織樣本(圖5)進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖1-5所示，從圖中可見所述的引物組在正常人外周血(圖1)、非肺癌病人的外周血(圖2)和腫瘤組織樣本(圖3)中檢測到基因的低表達(dá)或者不表達(dá)。在肺癌病人的外周血樣本(圖4)和組織(圖5)中可檢測到多個(gè)基因的表達(dá)，分別為6/9和7/9，說明本發(fā)明中所述引物組具有高度的特異性。當(dāng)前第1頁1 2 3