本發(fā)明屬于蘑菇鑒定領(lǐng)域，特別涉及一種中國美味蘑菇(A.sinodeliciosus)的鑒定方法。

背景技術(shù)：

我國蘑菇鑒定從20世紀(jì)初就已有，但一直較為原始，且鑒定不準(zhǔn)確，很多情況下不能定位到種的水平。隨著顯微鏡在蘑菇鑒定中的應(yīng)用，微觀結(jié)構(gòu)觀察已應(yīng)用于蘑菇的鑒定中。但顯微鑒定較為復(fù)雜且準(zhǔn)確度不高。20世紀(jì)后期，分子序列逐漸在鑒定中有所應(yīng)用，但也只能是作為參考。蘑菇屬(Agaricus)中的種類多達(dá)上千種，而中國的蘑菇屬(Agaricus)種類占世界的很大一部分。而中國蘑菇屬(Agaricus)種類的鑒定一直沒有快捷的方法，特別是對(duì)具有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蘑菇種類的鑒定，便于維護(hù)研究人員的權(quán)益，因此發(fā)現(xiàn)并鑒定從而進(jìn)行蘑菇屬(Agaricus)具有重要經(jīng)濟(jì)意義種類的鑒定利用勢(shì)在必行。

面對(duì)這種形勢(shì)，需要研究快速鑒定蘑菇屬(Agaricus)種類的技術(shù)研究和方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種中國美味蘑菇(A.sinodeliciosus)的鑒定方法，該方法通過采用外部形態(tài)特征、解剖結(jié)構(gòu)顏色變化、化學(xué)試劑和分子序列鑒定相結(jié)合的方法對(duì)中國美味蘑菇進(jìn)行鑒定，具有鑒定準(zhǔn)確性高、定位準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，在我國蘑菇(Agaricus sp.)品種的鑒定中具有代表性，具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的一種中國美味蘑菇(A.sinodeliciosus)的鑒定方法，包括：

(1)外部形態(tài)鑒定

中國美味蘑菇(A.sinodeliciosus)外部形態(tài)包括：10-35cm大的菌蓋，5-20cm粗的菌柄，由粉紅色、肉色變化成褐色至暗黑色的菌褶，位于菌柄上部的菌環(huán)以及整個(gè)子實(shí)體全部埋生于地下45-55公分且周圍有樹木生長；

(2)解剖鑒定

將中國美味蘑菇從菌蓋和菌柄的中間剖開，靜置，剖面由白色變?yōu)榉奂t色；

(3)化學(xué)試劑鑒定

取事先配制好的5％KOH溶液，滴于新鮮中國美味蘑菇子實(shí)體菌蓋表面，靜置，KOH溶液滴定處變?yōu)闇\黃色；

(4)分子序列鑒定

①DNA提?。禾崛】侱NA，測(cè)定濃度后調(diào)節(jié)至100ng/μL備用；

②PCR擴(kuò)增：選用正向引物ITS5和ITS4擴(kuò)增中國美味蘑菇核糖體RNA部分18S、ITS1、5.8S、ITS2和部分28S的DNA片段；反應(yīng)體系：總量20μL，包含有Taq酶5U、10mmol/L dNTP 2.5μL、10×PCR擴(kuò)增緩沖液(50mmol/L KCl、15mmol/L MgCl₂、100mmol/Ltris-HCl，pH 9)5μL、10μmol/L引物各2.5μL、模版DNA 100ng；PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4min，34個(gè)循環(huán)中94℃40s、52℃40s、72℃50s，最后72℃延伸8min；

③PCR測(cè)序：經(jīng)ITS擴(kuò)增片段進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過比對(duì)拼接后確定最終序列；

④ITS序列分析：將測(cè)序好的序列利用NCBI中的Genebank中準(zhǔn)確可靠的序列進(jìn)行Blast比對(duì)，通常序列相似度大于99％，即可判定為同一種；

經(jīng)上述步驟(1)～(4)的鑒定，確定為中國美味蘑菇(Agaricus sinodeliciosus)。

所述步驟(2)中的靜置時(shí)間為2～3分鐘。

所述步驟(3)中的靜置時(shí)間為5～6分鐘。

所述步驟(4)中的提取總DNA的方法為采用改良的CTAB法提取總DNA，包括：

1)將-20℃冷凍干燥的中國美味蘑菇子實(shí)體0.1g研磨成粉末，加入65℃預(yù)熱的2×CTAB抽提液，65℃保溫45min以上，間或輕搖混勻；

2)12000rpm，4℃離心20min，取上清液；

3)加入等體積的酚、氯仿和異戊醇的混合液，其中酚、氯仿和異戊醇的體積比為25：24：1，輕輕混勻10min，12000rpm，4℃離心10min，取上清液移入新離心管中；

4)加入等體積的氯仿、異戊醇混合液，其中的氯仿、異戊醇的體積比為24：1，輕輕混勻10min，12000rpm，4℃離心10min，取上清液移入新離心管中；

5)加入2/3體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖動(dòng)5min，8000rpm，4℃離心10min，去上清；

6)將沉淀依次用體積百分?jǐn)?shù)為75％的乙醇、10mmol/L醋酸鉀各洗滌2～3次，每次8000rpm，室溫離心5min；

7)加入預(yù)冷的體積百分?jǐn)?shù)為95％的乙醇，輕輕上下顛倒，8000rpm室溫離心10min，棄乙醇，真空抽干或自然晾干；

8)加入100uL 10×TE緩沖液，輕輕敲打使沉淀溶解；

9)加入1uL 10mg/mL RNaseA 37℃水浴1hr，去除RNA，即得DNA提取物。

所述步驟(4)中的正向引物ITS5為：5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAGG-3’，反向引物ITS4為5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’。

有益效果

本發(fā)明通過采用外部形態(tài)特征、解剖結(jié)構(gòu)顏色變化、化學(xué)試劑和分子序列鑒定相結(jié)合的方法對(duì)中國美味蘑菇進(jìn)行鑒定，具有鑒定準(zhǔn)確性高、定位準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，在我國蘑菇(Agaricus sp.)品種的鑒定中具有代表性，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為中國美味蘑菇子實(shí)體；

圖2為中國美味蘑菇剖開顏色變化；

圖3為中國美味蘑菇化學(xué)試劑鑒定顏色變化。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實(shí)施例1

取某地野生中國美味蘑菇：

(1)外部形態(tài)鑒定

中國美味蘑菇(A.sinodeliciosus)外部形態(tài)包括：10-35cm大的菌蓋，5-20cm粗的菌柄，由粉紅色、肉色變化成褐色至暗黑色的菌褶，位于菌柄上部的菌環(huán)以及整個(gè)子實(shí)體全部埋生于地下45-55公分且周圍有樹木生長；

(2)解剖鑒定

將中國美味蘑菇從菌蓋和菌柄的中間剖開，靜置2min，剖面由白色變?yōu)榉奂t色；

(3)化學(xué)試劑鑒定

取事先配制好的5％KOH溶液，滴于新鮮中國美味蘑菇子實(shí)體菌蓋表面，靜置5min，KOH溶液滴定處變?yōu)闇\黃色；

(4)分子序列鑒定

①DNA提?。禾崛】侱NA，測(cè)定濃度后調(diào)節(jié)至100ng/μL備用；

②PCR擴(kuò)增：選用真菌正向引物ITS5和反向引物ITS4擴(kuò)增中國美味蘑菇核糖體RNA部分18S、ITS1、5.8S、ITS2和部分28S的DNA片段；反應(yīng)體系：總量20μL，包含有Taq酶5U、10mmol/L dNTP 2.5μL、10×PCR擴(kuò)增緩沖液(50mmol/L KCl、15mmol/L MgCl₂、100mmol/Ltris-HCl，pH 9)5μL、10μmol/L引物各2.5μL、模版DNA 100ng；PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，30個(gè)循環(huán)中94℃50s、51℃50s、72℃1min，最后72℃延伸10min；

③PCR測(cè)序：經(jīng)ITS擴(kuò)增片段進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過比對(duì)拼接后確定最終序列；

④ITS序列分析：將測(cè)序好的序列利用NCBI中的Genebank中準(zhǔn)確可靠的序列進(jìn)行Blast比對(duì)，通常序列相似度大于99％，即可判定為同一種；

提取總DNA的方法為采用改良的CTAB法提取總DNA，包括：

1)將-20℃冷凍干燥的中國美味蘑菇子實(shí)體0.1g研磨成粉末，加入65℃預(yù)熱的2×CTAB抽提液，65℃保溫45min以上，間或輕搖混勻；

2)12000rpm，4℃離心20min，取上清液；

3)加入等體積的酚、氯仿和異戊醇的混合液，其中酚、氯仿和異戊醇的體積比為25：24：1，輕輕混勻10min，12000rpm，4℃離心10min，取上清液移入新離心管中；

4)加入等體積的氯仿、異戊醇混合液，其中的氯仿、異戊醇的體積比為24：1，輕輕混勻10min，12000rpm，4℃離心10min，取上清液移入新離心管中；

5)加入2/3體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖動(dòng)5min，8000rpm，4℃離心10min，去上清；

6)將沉淀依次用體積百分?jǐn)?shù)為75％的乙醇、10mmol/L醋酸鉀各洗滌2～3次，每次8000rpm，室溫離心5min；

7)加入預(yù)冷的體積百分?jǐn)?shù)為95％的乙醇，輕輕上下顛倒，8000rpm室溫離心10min，棄乙醇，真空抽干或自然晾干；

8)加入100uL 10×TE緩沖液，輕輕敲打使沉淀溶解；

9)加入1uL 10mg/mL RNaseA 37℃水浴1hr，去除RNA，即得DNA提取物。

真菌正向引物ITS5：5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAGG-3’，反向引物ITS4為5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’。

ITS序列為：

TTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAGTCCTACCTGATTTGAGGTCAAGCATTCGAGAAATTGTCCTGAGACGATTAGAAGCTGAACATCACAGAAAGCAATCCCCTCGCCAGTGTAGATAAATTATCACACTTGTGGCAGATCGCAGACGGTTCTGCTAATGCATTTCAGAGGAGCTGACCCCAAGCAAGTGGCCAGCAAGCCCCCACAATCCAAGCTCTCCTTTACAACAAAGTATTGGGGAGTTGAGAATATAATGACACTCAAACAGGCATGCTCCTCGGAATACCAAGGAGCGCAAGATGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGCTGAAAGTTGTATAATAATTTTCATAGGCATATAAGCCCACGTAAAAACATTCAATGACATTCTACAGAGTATAATGAATAACATAGTCTCTGACAGGAAAAAGATTCCATGGTCAAGGTCAAGGACAGCACTGTTTACACACTGCAAGTCCTTATCCAGCAAGAGCTGATAGGCTGACCACTTCCCTCAATACCTGAAAAAGACTACAAAAGGTGCACAGGTGGATGAAAATGAAGTCCAGACAGGTGTGCACATGCTCCAAAGAGCCAGCTACAACCCGTCTAGAAAACATAATTCAATAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAA。

鑒定結(jié)果：結(jié)合外觀、解剖結(jié)構(gòu)顏色變化和化學(xué)試劑顏色變化，以及分子序列的綜合比較，鑒定的蘑菇子實(shí)體為中國美味蘑菇(Agaricus sinodeliciosus)。