技術領域：

本發(fā)明屬于食品安全的分子生物學檢測方法領域，特別涉及一種金黃色葡萄球菌的LAMP引物組及檢測試劑盒。

背景技術：
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金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）屬于微球菌科葡萄球菌屬，是一種革蘭氏陽性球菌，廣泛分布于自然界，如：空氣、水、灰塵、地面及人和動物的排泄物中，是人類化膿性感染以及細菌性中毒中最常見的病原體之一。如條件適宜，金黃色葡萄球菌會大量繁殖，產(chǎn)生一定量的腸毒素，引起食物中毒。近年來，美國疾病控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌，而我國每年由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件已居于全世界第四位。目前，世界各國都把金黃色葡萄球菌列為食品衛(wèi)生的法定檢測項目。金黃色葡萄球菌所引起的疾病已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，嚴重危害人類安全和健康。

目前我國對于金黃色葡萄球菌包括耐藥金黃色葡萄球菌的檢測方法包括傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)及生化鑒定、免疫檢測和PCR檢測技術等。傳統(tǒng)檢測金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)方法操作繁瑣，檢測時間長，且靈敏度較低；免疫學方法縮短了檢測時間，雖然靈敏度較高但特異性差。采用PCR技術可以快速、靈敏地從食品中檢測金黃色葡萄球菌，但因PCR技術對模板DNA的質(zhì)量有較高要求，需要的熱循環(huán)及凝膠電泳等設備價格昂貴而很難在基層得到推廣及現(xiàn)場快速測定。

環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術是一種新型等溫核酸擴增方法，主要利用4種不同的特異性引物識別靶基因的6個特定區(qū)域，并利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶（BstDNAploymerase），在恒溫條件（65℃左右）下快速擴增核酸，保證了擴增的高特異性和高效率，在1h內(nèi)能達到10⁹～10¹⁰靶序列拷貝。LAMP方法具有操作簡單、檢測快速、靈敏度和特異性高且成本低廉等優(yōu)點，已在核酸研究、疾病診斷、病原檢測等領域得到廣泛應用。

技術實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于提供一種金黃色葡萄球菌的LAMP引物組。根據(jù)金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因（nuc）保守區(qū)序列設計環(huán)介導等溫擴增引物，利用LAMP技術擴增靶基因的特定區(qū)域，從分子水平上實現(xiàn)金黃色葡萄球菌的快速檢測，為金黃色葡萄球菌檢測提供一種更有效更快速的核酸篩查檢測方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述LAMP檢測試劑盒及使用方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

一種金黃色葡萄球菌的LAMP引物組，包括一對外引物、一對內(nèi)引物和一環(huán)引物，其核苷酸序列分別如下所示：

SAnuc-F3:CGCTACTAGTTGCTTAGTGTTA，

SAnuc-B3:GCTAAGCCACGTCCATAT；

SAnuc-FIP:ACTGTTGGATCTTCAGAACCACCAAGTCTAAGTAGCTCAGCAA，

SAnuc-BIP:AGCGATTGATGGTGATACGGTTCAGGACCATATTTCTCTACACC；

SAnuc-LF:TACGCCGTTATCTGTTTGTGA，

SAnuc-LB:AGGTCAACCAATGACATTCAGA。

一種含有上述LAMP引物組的檢測試劑盒，包括以下物質(zhì)：（1）DNA聚合酶；（2）2×反應緩沖液；（3）熒光染料；（4）密封液；（5）標準陽性模板；（6）陰性對照；（7）上述的LAMP引物組。

在上述檢測試劑盒中，所述LAMP引物組的濃度的比例如下：外引物、內(nèi)引物、環(huán)引物的摩爾比為：1-2：4-8：2-4。

在上述檢測試劑盒中，所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶。

在上述檢測試劑盒中，所述2×反應緩沖液包含buffer緩沖液、甜菜堿和dNTPs，三者體積比為10：8：7。

在上述檢測試劑盒中，所述熒光染料為濃度是0.02mM的SYTO-9。

在上述檢測試劑盒中，所述密封液為礦物油。

在上述檢測試劑盒中，所述標準陽性模板為金黃色葡萄球菌標準菌株基因組DNA；所述陰性對照為滅菌超純水。

使用上述LAMP試劑盒檢測金黃色葡萄球菌的方法，包括以下步驟：

（1）待檢樣品的提?。翰捎盟蠓◤拇龣z樣品中提取DNA；

（2）反應體系及條件：25μl反應體系含有：SAnuc-F3 0.2μM，SAnuc-B3 0.2μM，SAnuc-FIP 0.8μM，SAnuc-BIP 0.8μM，SAnuc-LF 0.4μM，SAnuc-LB 0.4μM，2×反應液12.5μl，DNA聚合酶8U，SYTO-9 0.5μl，待檢樣品2μl，用超純水補齊至25μl；密封液加入體積為20μl；同時設置陽性對照和陰性對照；將配置好的PCR管混勻后離心，63℃反應45～60min，并在80℃持續(xù)2min；

（3）檢測結(jié)果判斷：將上述反應管置于熒光PCR儀（如ABI stepone、ZYD-S1）中，根據(jù)擴增曲線來判斷檢測結(jié)果。擴增曲線呈“S”形，檢測結(jié)果為陽性，即檢測樣品中含有金黃色葡萄球菌；無“S”形擴增曲線出現(xiàn)，檢測結(jié)果為陰性，即檢測樣品不含有金黃色葡萄球菌。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

（1）特異性好：本發(fā)明根據(jù)金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因（nuc）設計六條特異引物，對靶基因6個區(qū)域進行特異擴增，特異性強，且與其他菌株無交叉反應。

（2）快速高效：整個擴增只用45～60min即可完成，擴增產(chǎn)量可達10⁹～10¹⁰個拷貝；

（3）操作便捷：不需要使用昂貴、精密的設備，對儀器要求低，只需要一部恒定溫度儀就能反應和檢測，條件比較簡單；

（4）鑒定簡單：可通過觀察擴增曲線直接判斷陰陽性，不需要繁瑣的電泳等其他任何分析步驟，適合現(xiàn)場檢測。

附圖說明：

圖1為LAMP靈敏性實驗結(jié)果示意圖；其中，從左至右依次為濃度1ng/μl、100pg/μl、10 pg/μl和1 pg/μl金黃色葡萄球菌基因組DNA模板LAMP反應結(jié)果。

圖2為LAMP特異性實驗結(jié)果示意圖；

具體實施方式：

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做詳細的說明，但不應該當作對本發(fā)明的限制。

實施例1：一種金黃色葡萄球菌的LAMP引物的設計合成和檢測試劑盒的建立

（1）LAMP引物的設計合成

根據(jù)文獻報道，以金黃色葡萄球菌nuc基因作為靶基因，采用引物設計軟件Primer Explorer 4.0設計包括環(huán)引物在內(nèi)的6條LAMP引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，6條引物序列如下：

SEQ NO.1 :SAnuc-F3:CGCTACTAGTTGCTTAGTGTTA

SEQ NO.2 :SAnuc-B3:GCTAAGCCACGTCCATAT

SEQ NO.3 :SAnuc-FIP: ACTGTTGGATCTTCAGAACCACCAAGTCTAAGTAGCTCAGCAA

SEQ NO.4:SAnuc-BIP:

AGCGATTGATGGTGATACGGTTCAGGACCATATTTCTCTACACC

SEQ NO.5 :SAnuc-LF:TACGCCGTTATCTGTTTGTGA

SEQ NO.6 :SAnuc-LB:AGGTCAACCAATGACATTCAGA

（2）金黃色葡萄球菌LAMP檢測試劑盒除包括上述LAMP引物組外，還包括DNA聚合酶、2×反應液、熒光染料、密封液、陽性對照和陰性對照。其中反應液包含buffer緩沖液、甜菜堿和dNTPs，各成分體積比為10：8：7。

（3）檢測方法：

1）待檢樣品的提?。翰捎盟蠓ǎ瑢悠废♂屢褐蠓?，上清液作為擴增反應DNA模板。

2）恒溫基因擴增檢測反應體系及條件：25μl反應體系含有：SAnuc-F3 0.2μM，SAnuc-B3 0.2μM，SAnuc-FIP 0.8μM，SAnuc-BIP 0.8μM，SAnuc-LF 0.4μM，SAnuc-LB 0.4μM，2×反應液12.5μl，DNA聚合酶8U，SYTO-9 0.5μl，待檢樣品2μl，用超純水補齊至25μl。密封液加入體積為20μl。同時設置陽性對照和陰性對照。

將配置好的PCR管混勻后離心，63℃反應45～60min，并在80℃持續(xù)2min。

3）檢測結(jié)果判斷：將上述反應管置于熒光PCR儀（如ABI stepone、ZYD-S1）中，根據(jù)擴增曲線來判斷檢測結(jié)果。擴增曲線呈“S”形，檢測結(jié)果為陽性，即檢測樣品中含有金黃色葡萄球菌；無“S”形擴增曲線出現(xiàn)，檢測結(jié)果為陰性，即檢測樣品不含有金黃色葡萄球菌。

實施例2： LAMP靈敏度實驗

將金黃色葡萄球菌標準菌株接種于營養(yǎng)肉湯，36℃±1℃培養(yǎng)18小時。應用Magen細菌基因DNA提取試劑盒提取培養(yǎng)產(chǎn)物中的細菌DNA。將金黃色葡萄球菌標準菌株抽提的DNA進行10倍梯度稀釋，分別以1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl五個梯度濃度DNA作為模板和陰性對照（滅菌超純水）按照實施例1的反應體系和條件建立檢測方法，以確定試劑盒檢測方法的靈敏度。

參見圖1，結(jié)果表明：將金黃色葡萄球菌基因組DNA進行10倍梯度稀釋后，建立的金黃色葡萄球菌LAMP檢測試劑盒可檢測樣品中1pg/μl的金黃色葡萄球菌DNA。

實施例3: LAMP特異性實驗

應用實施例1的LAMP檢測試劑盒對鼠傷寒沙門氏菌、阪崎腸桿菌、單細胞增生李斯特氏菌、福氏志賀氏菌、大腸埃希氏菌及副溶血性弧菌按照上述反應體系和條件進行特異性實驗，檢測結(jié)果如圖2所示。設置金黃色葡萄球菌基因組DNA為陽性對照，滅菌雙蒸水為陰性對照。從圖2中可以看出，只有金黃色葡萄球菌出現(xiàn)“S”形擴增曲線，呈現(xiàn)陽性結(jié)果，其他菌株均未出現(xiàn)“S”形曲線，呈現(xiàn)陰性結(jié)果直至反應時間延長至60min。說明實施例1的LAMP反應體系只對金黃色葡萄球菌有特異性。

SEQUENCE LISTING

<110> 中華人民共和國廣州機場出入境檢驗檢疫局，暨南大學，廣州雙螺旋基因技術有限公司

<120> 一種金黃色葡萄球菌的LAMP引物組及檢測試劑盒與使用方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列SAnuc-F3

<400> 1

cgctactagt tgcttagtgt ta 22

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列SAnuc-B3

<400> 2

gctaagccac gtccatat 18

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列SAnuc-FIP

<400> 3

actgttggat cttcagaacc accaagtcta agtagctcag caa 43

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<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列SAnuc-BIP

<400> 4

agcgattgat ggtgatacgg ttcaggacca tatttctcta cacc 44

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列SAnuc-LF

<400> 5

tacgccgtta tctgtttgtg a 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列SAnuc-LB

<400> 6

aggtcaacca atgacattca ga 22