本發(fā)明屬于中藥材分子鑒別領(lǐng)域，具體涉及利用ISSR分子標(biāo)記方法對(duì)冬蟲夏草及其相似種進(jìn)行鑒別。

技術(shù)背景

冬蟲夏草[Cordyceps sinensis(Berk)Sacc]，鱗翅目蝙蝠蛾科蝠蛾屬幼蟲被中國被毛孢(Hirsutella sinensis)寄生后形成的蟲菌復(fù)合體，為國家二級(jí)保護(hù)瀕危物種，具有補(bǔ)肺益腎，止血，化痰的功效。因其極高的臨床藥用價(jià)值與滋補(bǔ)保健作用，冬蟲夏草日益受到人們的青睞，但由于其資源被過度采挖和氣候的變化，產(chǎn)量連年下滑，價(jià)格不斷攀升，不良商家為牟取暴利，使用冬蟲夏草相似品種的偽品，包括中國被毛孢菌絲體、蟲草花、蘭坪蟲草和古尼蟲草等替代和冒充冬蟲夏草，嚴(yán)重的擾亂了冬蟲夏草市場(chǎng)秩序，也給市場(chǎng)管理帶來了一定的挑戰(zhàn)。

市場(chǎng)上很多由冬蟲夏草粉碎后制成的冬蟲夏草膠囊和片劑產(chǎn)品很難通過傳統(tǒng)的外觀、顯微等常規(guī)手段被鑒別。加之冬蟲夏草中尚未發(fā)現(xiàn)特征性小分子成分，而常用的化學(xué)分析方法存在一定問題，如檢測(cè)不夠精確，對(duì)于含量較低的冬蟲夏草復(fù)方產(chǎn)品也很難鑒定，所需檢測(cè)的樣品量大，進(jìn)而對(duì)珍貴瀕危中藥造成一定浪費(fèi)。而分子標(biāo)記技術(shù)具有靈敏度高、重復(fù)性好、所需檢測(cè)的樣品量少等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛用于中藥原料的質(zhì)量檢測(cè)和鑒定。

目前，使用分子生物學(xué)方法對(duì)冬蟲夏草進(jìn)行鑒別的技術(shù)文獻(xiàn)較多，但都存在一定的局限性。如論文《冬蟲夏草與5種人工發(fā)酵菌絲體的DNA分子鑒別方法》公開了一種方法，利用ITS序列(5.8S rDNA和28S rDNA基因間隔序列)能夠?qū)Χx夏草和多種人工發(fā)酵蟲草菌絲粉進(jìn)行鑒別，但PCR擴(kuò)增之后需要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序，耗時(shí)較長。專利《一種冬蟲夏草分子身份證及鑒定方法》(申請(qǐng)?zhí)枺?01510117046.6)公開了一種分子身份證和方法可以準(zhǔn)確的將冬蟲夏草與形態(tài)特征相似的偽品區(qū)分開，同樣需要測(cè)序。專利《一種快速檢測(cè)冬蟲夏草的方法》(申請(qǐng)?zhí)枺?01610270920.4)公開了一種鑒別冬蟲夏草的方法，無需DNA測(cè)序，能夠鑒別冬蟲夏草、蛹蟲草、古尼蟲草、涼山蟲草和/或蟬花，但不能有效的鑒別中國被毛孢菌絲體，且公開實(shí)施例中冬蟲夏草樣品僅為四川一個(gè)產(chǎn)地樣品，對(duì)不同青海、西藏省份樣品適應(yīng)性不明確。論文《青海省冬蟲夏草的遺傳變異及親緣關(guān)系的形態(tài)性狀和ISSR分析》公開了一種ISSR分析標(biāo)記方法，提供了多條ISSR引物，該文獻(xiàn)從不同產(chǎn)地冬蟲夏草間的差異，實(shí)現(xiàn)區(qū)分不同產(chǎn)地的冬蟲夏草真品，但卻沒有提供與冬蟲夏草偽品區(qū)分的方法，即真品與偽品之間的差異與不同產(chǎn)地真品之間的差異的比較，無法用于分辨真?zhèn)纹贰?/p>

因此，研究真品冬蟲夏草之間的共同點(diǎn)，尋找可靠的引物，開發(fā)一種無需對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)便捷、靈敏、穩(wěn)定且實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好的分子鑒別方法來分辨真品冬蟲夏草和偽品冬蟲夏草成為一個(gè)重要的研究內(nèi)容。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)難題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種冬蟲夏草鑒別用ISSR-PCR引物，該引物不但可以用于冬蟲夏草的真?zhèn)舞b定，還可以用于中國被毛孢菌絲體、蟲草花、蘭坪蟲草及古尼蟲草的鑒定；同時(shí)提供了含有該引物的用于ISSR-PCR鑒定用的擴(kuò)增體系；結(jié)合使用該擴(kuò)增體系，本發(fā)明公開了一種基于ISSR-PCR技術(shù)的快速、準(zhǔn)確鑒定冬蟲夏草、中國被毛孢菌絲體、蟲草花、蘭坪蟲草及古尼蟲草的方法。

一方面，本發(fā)明提供了一種冬蟲夏草鑒別用ISSR-PCR引物，所述引物用于冬蟲夏草、中國被毛孢菌絲體、蟲草花、蘭坪蟲草和/或古尼蟲草的鑒別，其特征在于，所述引物的核苷酸序列表示如下：

SEQ ID NO.1：5’-AGAGAGAGAGAGAGGC-3’或

SEQ ID NO.2：5’-AGTGTGTGTGTGTGT-3’。

另一方面，本發(fā)明提供了一種冬蟲夏草鑒別用ISSR-PCR擴(kuò)增體系，其特征在于，所述ISSR-PCR擴(kuò)增體系包括如權(quán)利要求1所述的引物SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明所述冬蟲夏草鑒別用ISSR-PCR擴(kuò)增體系本發(fā)明所述的引物SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2、rTaq酶、Mg²⁺、dNTPs、PCR緩沖液。

在一些實(shí)施例中，在本發(fā)明所述的ISSR-PCR擴(kuò)增體系中，其特征在于，所述rTaq酶為5U/μL、Mg²⁺為25mM、dNTPs為2.5mM、10倍的PCR緩沖液；引物SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2為10μM。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明所述的ISSR-PCR擴(kuò)增體系總體積為50μL，含有0.5μL的5U/μL rTaq酶、3.0μL的25mM Mg²⁺、2.0μL的2.5mM dNTPs、1.0μL的10μM引物SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2、2.0μL的10倍PCR緩沖液、0.2μL的25ng/L模板DNA、其余為水。

另一方面，本發(fā)明提供了一種冬蟲夏草ISSR鑒別方法，其特征在于包括如下步驟：

1)提取對(duì)照品基因組DNA；所述對(duì)照品為冬蟲夏草、中國被毛孢菌絲體、蟲草花、蘭坪蟲草或古尼蟲草；

2)利用本發(fā)明所述的ISSR-PCR擴(kuò)增體系對(duì)步驟1)中的對(duì)照品基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增；

3)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；

4)構(gòu)建ISSR分子標(biāo)記的圖譜；

5)按照步驟1)至3)相同條件處理供試品得到供試品電泳圖譜，比對(duì)供試品電泳圖譜與步驟4)構(gòu)建的ISSR分子標(biāo)記圖譜進(jìn)行鑒別。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明所述冬蟲夏草ISSR鑒別方法的步驟1)中所述提取對(duì)照品基因組DNA包括：分別稱取正品冬蟲夏草、中國被毛孢菌絲體、蟲草花、蘭坪蟲草和古尼蟲草這五種對(duì)照品0.2g，分別研磨至粉狀，然后用CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)提取緩沖液分別裂解，再加入飽和醋酸鈉溶液，混勻，冰浴，離心，取上清液與異丙醇混勻，靜置后離心，棄去上清液，用70％乙醇洗滌沉淀，進(jìn)行除鹽，自然晾干至乙醇完全揮發(fā)；最后加TE緩沖液溶解，即得5個(gè)對(duì)照品基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明所述冬蟲夏草ISSR鑒別方法的步驟1)中所述提取對(duì)照品基因組DNA包括：分別稱取正品冬蟲夏草、中國被毛孢菌絲體、蟲草花、蘭坪蟲草和古尼蟲草這五種對(duì)照品0.2g，分別在預(yù)冷陶瓷研缽中加入液氮研磨至粉狀，然后迅速轉(zhuǎn)移樣品至離心管，加入3mL的65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，65℃水浴裂解30-40min，中間每隔10min翻轉(zhuǎn)混勻1次；加入1/10體積預(yù)冷的飽和醋酸鈉溶液，混勻，冰浴5min，4℃下12000rpm離心5min；取上清液與等體積異丙醇混勻，靜置60s，4℃下12000rpm離心5min；棄去上清液，用預(yù)冷的70％乙醇洗滌沉淀，進(jìn)行除鹽，自然晾干至乙醇完全揮發(fā)；最后加入100-300μL的TE緩沖液溶解，即得5個(gè)對(duì)照品品基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明所述冬蟲夏草ISSR鑒別方法步驟1)中所述CTAB提取緩沖液組成成分包含2％體積重量比例的CTAB、1.4M NaCl、20mM EDTA(乙二胺四乙酸)、100mM pH＝8.0的Tric-HCl、2％巰基乙醇。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明所述冬蟲夏草ISSR鑒別方法步驟2)中所述擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，48.2℃退火1min，72℃延伸2min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明所述冬蟲夏草ISSR鑒別方法步驟3)瓊脂糖凝膠電泳條件為：擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.6％瓊脂糖凝膠電泳，使用GelRed核酸染料，電壓為5V/cm，時(shí)間為1h。

另一方面，本發(fā)明提供了一種本發(fā)明所述冬蟲夏草ISSR鑒別方法的應(yīng)用，其用于鑒定冬蟲夏草復(fù)方產(chǎn)品中是否含有正品冬蟲夏草。

本發(fā)明的優(yōu)益之處在于：

(1)本發(fā)明成功構(gòu)建的冬蟲夏草分子標(biāo)記圖譜與其他分子生物學(xué)鑒定方法相比較，更具有操作快捷、重復(fù)性、穩(wěn)定性、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，不需要經(jīng)過測(cè)序，節(jié)約經(jīng)濟(jì)與時(shí)間成本。

(2)本發(fā)明構(gòu)建的ISSR分子標(biāo)記圖譜具有多態(tài)性高、基因分型能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好的特征，對(duì)不同產(chǎn)地冬蟲夏草真品都有較好的適應(yīng)性，同時(shí)對(duì)包括中國被毛孢菌絲體在內(nèi)的多個(gè)相似種偽品有較好的差異性。

(3)本發(fā)明能夠準(zhǔn)確鑒別冬蟲夏草復(fù)方片劑和膠囊產(chǎn)品中是否真正含有正品冬蟲夏草，即使含有少量的冬蟲夏草也能很靈敏的檢測(cè)。

附圖說明：

圖1所示是正品冬蟲夏草與4種偽品以引物SEQ ID NO.1進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳的顯影圖，其中泳道1為青海冬蟲夏草、泳道2為中華被毛孢菌絲體、泳道3為蟲草花、泳道4為蘭坪蟲草、泳道5為古尼蟲草，泳道M為100bp DNA Marker。

圖2所示是不同產(chǎn)地冬蟲夏草樣品以引物SEQ ID NO.1進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳的顯影圖，其中泳道1為青海冬蟲夏草、泳道2為西藏冬蟲夏草、泳道3為四川冬蟲夏草、泳道M為100bp DNA Marker。

圖3所示是正品冬蟲夏草與4種偽品以引物SEQ ID NO.2進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳的顯影圖，其中泳道1為青海冬蟲夏草、泳道2為中華被毛孢菌絲體、泳道3為蟲草花、泳道4為蘭坪蟲草、泳道5為古尼蟲草，泳道M為100bp DNA Marker。

圖4所示是不同產(chǎn)地冬蟲夏草樣品以引物SEQ ID NO.2進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳的顯影圖，其中泳道1為青海冬蟲夏草、泳道2為西藏冬蟲夏草、泳道3為四川冬蟲夏草、泳道M為100bp DNA Marker。

圖5所示為構(gòu)建得到的冬蟲夏草及4種相似種偽品的ISSR分子標(biāo)記圖譜，其中，泳道1-5根據(jù)引物SEQ ID NO.1進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳描繪，分別為青海冬蟲夏草、中國被毛孢菌絲體、蟲草花、蘭坪蟲草、古尼蟲草；泳道6-10根據(jù)引物SEQ ID NO.2進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳描繪，分別為青海冬蟲夏草、中國被毛孢菌絲體、蟲草花、蘭坪蟲草、古尼蟲草；泳道M為100bp DNA Marker。

圖6所示是市售冬蟲夏草復(fù)方產(chǎn)品以引物SEQ ID NO.1進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳的顯影圖，其中泳道1為供試品、泳道M為100bp DNA Marker。

圖7所示是市售冬蟲夏草復(fù)方產(chǎn)品以引物SEQ ID NO.2進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳的顯影圖，其中泳道1為供試品、泳道M為100bp DNA Marker。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

取正品冬蟲夏草、中國被毛孢菌絲體、蟲草花、古尼蟲草、蘭坪蟲草5個(gè)對(duì)照品，分別提取其基因組DNA，然后加入引物SEQ ID NO.1進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，具體操作步驟如下：

1)提取對(duì)照品基因組DNA：

分別稱取正品冬蟲夏草、中國被毛孢菌絲體、蟲草花、蘭坪蟲草和古尼蟲草這五種對(duì)照品0.2g，分別在預(yù)冷陶瓷研缽中加入液氮研磨至粉狀，然后迅速轉(zhuǎn)移樣品至離心管，加入3mL在65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，65℃水浴裂解30-40min，中間每隔10min翻轉(zhuǎn)混勻1次；加入1/10體積預(yù)冷的飽和醋酸鈉溶液，混勻，冰浴5min，4℃下12000rpm離心5min；取上清液與等體積異丙醇混勻，靜置60s，4℃下12000rpm離心5min；棄去上清液，用預(yù)冷的70％乙醇洗滌沉淀，除鹽，自然晾干至乙醇完全揮發(fā)；最后加入100-300μL TE緩沖液溶解，即得5個(gè)對(duì)照品基因組DNA；

上述CTAB提取緩沖液組成成分包含2％體積重量比例的CTAB、1.4M NaCl、20mM EDTA、100mM pH＝8.0的Tric-HCl、2％巰基乙醇。

2)進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)：

分別以步驟1)中5個(gè)對(duì)照品基因組DNA為模板，再加入引物SEQ ID NO.1、rTaq酶、Mg2+、dNTPs、PCR緩沖液在PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增；

其中50μL供試樣品ISSR-PCR擴(kuò)增體系的組成為：5U/μL rTaq酶0.5μL、25mM Mg²⁺3.0μL、2.5mM dNTPs 2.0μL、10μM引物SEQ ID NO.1 1.0μL、10倍PCR buffer 2.0μL、25ng/L模板DNA 0.2μL、其余為水。

擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，48.2℃退火1min，72℃延伸2min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。

3)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳：

將步驟2)中擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，電泳條件為：擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.6％瓊脂糖凝膠電泳，使用GelRed核酸染料，電壓為5V/cm，時(shí)間為1h。用凝膠成像儀記錄擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果如圖1。

由圖1可知，通過引物SEQ ID NO.1擴(kuò)增獲得的冬蟲夏草與4種偽品(中國被毛孢菌絲體、蟲草花、尼古蟲草、蘭坪蟲草)的PCR分子圖譜有明顯不同，可以有效進(jìn)行鑒別。

實(shí)施例2

采集來自于青海、西藏、四川3個(gè)不同產(chǎn)地的野生冬蟲夏草，分別提取其基因組DNA，然后加入引物SEQ ID NO.1進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，具體操作步驟同實(shí)施例1。用凝膠成像儀記錄擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果如圖2。

由圖2可知，通過引物SEQ ID NO.1擴(kuò)增獲得的三個(gè)不同省份的冬蟲夏草樣品分子圖譜基本一致，表明該引物和方法對(duì)不同產(chǎn)地冬蟲夏草有很好的適應(yīng)性。

實(shí)施例3

取正品冬蟲夏草、中國被毛孢菌絲體、蟲草花、古尼蟲草、蘭坪蟲草5個(gè)對(duì)照品，分別提取其基因組DNA，然后加入引物SEQ ID NO.2進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。除引物SEQ ID NO.1換成SEQ ID NO.2，其他具體操作步驟同實(shí)施例1。用凝膠成像儀記錄擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果如圖3。

由圖3可知，通過引物SEQ ID NO.2擴(kuò)增獲得的冬蟲夏草與4種偽品(中國被毛孢菌絲體、蟲草花、尼古蟲草、蘭坪蟲草)的PCR分子圖譜有明顯不同，可以有效進(jìn)行鑒別。

實(shí)施例4

采集來自于青海、西藏、四川3個(gè)不同產(chǎn)地的野生冬蟲夏草，分別提取其基因組DNA，然后加入引物SEQ ID NO.2進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。除引物SEQ ID NO.1換成SEQ ID NO.2，具體操作步驟同實(shí)施例1。用凝膠成像儀記錄擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果如圖4。

由圖4可知，通過引物SEQ ID NO.2擴(kuò)增獲得的三個(gè)不同省份的冬蟲夏草樣品分子圖譜基本一致，表明該引物和方法對(duì)不同產(chǎn)地冬蟲夏草有很好的適應(yīng)性。

根據(jù)以上實(shí)施例1-4構(gòu)建ISSR-PCR分子標(biāo)記圖譜

根據(jù)實(shí)施例1和實(shí)施例3結(jié)果呈現(xiàn)的凝膠電泳條帶建立圖譜，采用軟件Bandscan，擴(kuò)增條帶的有無以總亮度值作為選擇依據(jù)，選取擴(kuò)增條帶亮度值≥0.2的條帶記錄為特征條帶，有擴(kuò)增帶的用“▁”表示，沒有擴(kuò)增帶的不做標(biāo)記，構(gòu)建正品冬蟲夏草、中國被毛孢菌絲體、蟲草花、蘭坪蟲草、古尼蟲草5個(gè)樣品的分子標(biāo)記圖譜，如圖5所示。

實(shí)施例5

取市售冬蟲夏草復(fù)方膠囊產(chǎn)品，提取其基因組DNA，然后加入引物SEQ ID NO.1進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，具體操作步驟同實(shí)施例1。用凝膠成像儀記錄擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果如圖6。

將市售產(chǎn)品由引物SEQ ID NO.1擴(kuò)增獲得的凝膠電泳圖譜6與已構(gòu)建的分子標(biāo)記圖譜5進(jìn)行比對(duì)，其特征條帶與圖5中的冬蟲夏草特征條帶一致，表明該產(chǎn)品中含有正品冬蟲夏草。

實(shí)施例6

取市售冬蟲夏草復(fù)方膠囊產(chǎn)品，提取其基因組DNA，然后加入引物SEQ ID NO.2進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，具體操作步驟同實(shí)施例1。用凝膠成像儀記錄擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果如圖7。

將市售產(chǎn)品由引物SEQ ID NO.2擴(kuò)增獲得的凝膠電泳圖譜7與已構(gòu)建的分子標(biāo)記圖譜5進(jìn)行比對(duì)，其特征條帶與圖5中的冬蟲夏草特征條帶一致，表明該產(chǎn)品中含有正品冬蟲夏草。

需要注意的是，上述僅以優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，并不能局限本發(fā)明的權(quán)利范圍，因此不脫離本發(fā)明思想的情況下，凡運(yùn)用本發(fā)明說明書和附圖部分的內(nèi)容所進(jìn)行的等效變化，均理同包含在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。