本發(fā)明屬于水禽分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于預(yù)示和鑒定鴨生長(zhǎng)和腹脂率的分子標(biāo)記方法，該分子標(biāo)記方法可應(yīng)用于家鴨肉鴨新品系標(biāo)記輔助選擇育種。

背景技術(shù)：

我國(guó)是世界上養(yǎng)鴨最多的國(guó)家，據(jù)報(bào)道，我國(guó)鴨存欄量約占世界鴨存欄總量的60％，肉鴨年屠宰量占世界肉鴨屠宰總量的75％左右。肉鴨雖然其飼養(yǎng)量不及肉雞，但在世界肉禽業(yè)中仍占有重要位置，近十年多來(lái)發(fā)展速度相當(dāng)快，尤其是在中國(guó)、東南亞等發(fā)展中國(guó)家占有重要的地位。肉鴨同其它家禽一樣具有高繁殖力、擴(kuò)繁快的優(yōu)勢(shì)，育種已從原來(lái)本品種選育發(fā)展為商業(yè)配套系選育為主，國(guó)外培育的肉鴨配套系有英國(guó)的櫻桃谷肉鴨、澳大利亞的的狄高肉鴨、美國(guó)的楓葉鴨、丹麥的海格肉鴨、麗佳肉鴨、法國(guó)的奧白星肉鴨、番鴨和日本的大阪肉鴨等。我國(guó)肉鴨品種改良、遺傳育種工作起步較晚，科學(xué)系統(tǒng)的選育是從上世紀(jì)50年代以后才得到重視和開(kāi)展。目前北京鴨選育已達(dá)到世界先進(jìn)水平。我國(guó)肉鴨良種選育主要采用常規(guī)的育種方法結(jié)合分子育種的方法，即在通過(guò)閉鎖群家系育種輔以DNA分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行選擇培育具有某個(gè)目標(biāo)性狀的肉鴨新品系。當(dāng)前DNA分子標(biāo)記技術(shù)在家禽遺傳育種中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、親緣關(guān)系研究遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位和分子標(biāo)記輔助育種等方面。針對(duì)肉鴨目標(biāo)性狀的新品系選育主要集中在生長(zhǎng)速度、飼料利用率、胴體品質(zhì)和繁殖性能等方面。生長(zhǎng)速度遺傳力高且容易度量，因此個(gè)體選擇的效果較好。但如果只注重生長(zhǎng)速度選擇的結(jié)果，在促進(jìn)肉鴨快速生長(zhǎng)的同時(shí)，容易出現(xiàn)脂肪沉積過(guò)多，降低飼料利用率并影響胴體品質(zhì)。肉鴨的胴體品質(zhì)主要目標(biāo)是增加胸腿肉產(chǎn)量和降低胴體脂肪。因此降低肉鴨脂肪沉積，培育低脂瘦肉品系已是重要的育種內(nèi)容。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們可以通過(guò)尋找控制脂肪沉積的主基因或與其連鎖的分子標(biāo)記，從而通過(guò)分子標(biāo)記實(shí)施早期選擇及間接選擇。目前，盡管在鴨脂肪沉積候選基因鑒定和應(yīng)用方面取得了一些進(jìn)展，但能夠真正能用于選擇低腹脂率進(jìn)行育種實(shí)踐的很有限，因此非常有必要尋找有效的能夠影響鴨脂肪沉積的候選基因及分子標(biāo)記。

極低密度脂蛋白受體(VLDLR)是一種細(xì)胞膜表面的蛋白質(zhì)，由846個(gè)氨基酸組成，是含ApoE的脂蛋白顆粒等多種不同配體的受體。極低密度脂蛋白受體有著5個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表皮生長(zhǎng)因子前體結(jié)構(gòu)域、含糖基結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。它主要負(fù)責(zé)結(jié)合和內(nèi)移含載脂蛋白，如極低密度脂蛋白(VLDL)，向肝外組織提供甘油三酯作為能量來(lái)源。許多研究表明，極低密度脂蛋白受體在脂肪酸代謝活躍的組織，如心臟、骨骼肌和脂肪組織中含量豐富，而且能夠選擇性地和載脂蛋白E、富含甘油三酯的脂蛋白結(jié)合。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)是脂肪沉積候選基因中一個(gè)中央節(jié)點(diǎn)(central nodes)，研究顯示PPARα可調(diào)節(jié)VLDLR基因的表達(dá)。有關(guān)VLDLR的研究大都集中在人和鼠，研究發(fā)現(xiàn)VLDLR與肥胖及體重相關(guān)，人VLDLR基因的突變還會(huì)導(dǎo)致血脂代謝紊亂，而血脂異常與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)，屬心腦血管疾病，因此受到了廣泛關(guān)注和深入研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于預(yù)示和鑒定鴨生長(zhǎng)和腹脂率的分子標(biāo)記方法及應(yīng)用。本發(fā)明以高郵鴨保種場(chǎng)純品系鴨為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)PCR測(cè)序方法檢測(cè)VLDLR基因5'UTR和信號(hào)肽編碼區(qū)的多態(tài)性，并分析不同基因型與生長(zhǎng)性狀和腹脂率的相關(guān)性，以期發(fā)現(xiàn)新的核甘酸多態(tài)性(SNPs)位點(diǎn)和能影響生長(zhǎng)和脂肪沉積的有效分子標(biāo)記信息，選育生長(zhǎng)速度快、腹脂率低的肉用家鴨，為培育優(yōu)質(zhì)的肉鴨品系奠定基礎(chǔ)。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是：

一種用于預(yù)示和鑒定鴨生長(zhǎng)和腹脂率的分子標(biāo)記方法，包括以下步驟：

以包含VLDLR基因的待測(cè)鴨全基因組DNA為模板，用Primer5.0設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增長(zhǎng)度為374bp，上下游引物序列為：

上游5’-ATTACACTGCCAAATGACC-3’；

下游5’-CGGGAACTGGGATTCTTC-3’；

產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行純化雙向測(cè)序，測(cè)序鑒定家鴨VLDLR基因5'UTR和信號(hào)肽編碼區(qū)多態(tài)性。對(duì)VLDLR基因單倍型組合與生長(zhǎng)速度和腹脂率之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)能影響生長(zhǎng)速度和腹脂率的有效分子標(biāo)記信息，從而輔助分子標(biāo)記培育出優(yōu)質(zhì)肉鴨品系。

進(jìn)一步，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μL，反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性10min，然后35個(gè)循環(huán)(94℃變性30S，53.5℃退火30S，72℃延伸30S)，72℃延伸10min，4℃保存。

進(jìn)一步，所述純化雙向測(cè)序是以PCR反應(yīng)的引物作為測(cè)序引物，和PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化測(cè)序，使用PHASE軟件統(tǒng)計(jì)SNP位點(diǎn)的單倍型、單倍型頻率及構(gòu)建單倍型組合。

測(cè)序結(jié)果與NCBI序列(HQ446852.1)進(jìn)行比對(duì)分析，得到4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)及其分型情況：

在g.151位點(diǎn)，GA基因型的頻率最高，為0.56，AA基因型的頻率最低，為0.04，等位基因頻率G>A；

在g.170位點(diǎn)，CC基因型的頻率最高，為0.50，CT基因型的頻率最低，為0.22，等位基因頻率C>T；

在g.206位點(diǎn)，AG基因型的頻率最高，為0.50，GG基因型的頻率最低，為0.17，等位基因頻率A>G；

在g.278-295位點(diǎn)，DD型的頻率最高，為0.65，DB型的頻率最低，為0.11，等位基因頻率D>B。

采用PHASE2.0軟件，對(duì)4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)構(gòu)建了單倍型、雙倍型。4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)共構(gòu)建了8種單倍型，分別為H1(GTAB)、H2(ATAD)、H3(GTGD)、H4(GCAD)、H5(GCGD)、H6(ATGD)、H7(ACAD)、H8(ACGD)。其中H8(A-C-G-D)為最主要單倍型，頻率高達(dá)29.81％，H3(GTGD)和H7(ACAD)單倍型頻率最低，均為0.96％?；?個(gè)單倍型構(gòu)建了15個(gè)雙倍型，H4H8頻率最高，為28.16％。在15個(gè)雙倍型中，除H1H1、H5H8、H2H8、H4H8以外其余雙倍型的頻率均低于5％，因此不進(jìn)行相關(guān)分析。

本發(fā)明所述的與鴨生長(zhǎng)及脂肪相關(guān)的VLDLR基因分子標(biāo)記可以應(yīng)用于鴨標(biāo)記輔助選擇育種中。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點(diǎn)是：

(1)在鴨身上證實(shí)了VLDLR的多態(tài)性和生長(zhǎng)及脂肪沉積有關(guān)。

(2)通過(guò)對(duì)鴨VLDLR基因5'UTR和信號(hào)肽編碼區(qū)多態(tài)性與生長(zhǎng)及腹脂率進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，對(duì)培育出優(yōu)質(zhì)肉鴨品系奠定了基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1是鴨VLDLR基因5'UTR和信號(hào)肽編碼區(qū)擴(kuò)增片段結(jié)果。

圖2是鴨VLDLR基因5'UTR和信號(hào)肽編碼區(qū)的多態(tài)位點(diǎn)基因型圖譜。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面通過(guò)具體的實(shí)施例來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。

實(shí)施例1

1實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)用鴨為高郵鴨，在高郵鴨繁育基地統(tǒng)一孵化、出雛，共267只。按常規(guī)方法對(duì)試驗(yàn)鴨進(jìn)行飼養(yǎng)管理和免疫，地面平養(yǎng)至第10周，飼養(yǎng)期有水池和活動(dòng)場(chǎng)地。

1.2生長(zhǎng)性能測(cè)定

分別于0、3、4、5、6、7、8、9、10周齡，每周齡第一天早上空腹稱重，記錄高郵鴨的周齡體重，于飼養(yǎng)第10周，活體翅靜脈抽取高郵鴨的血樣抗凝后保存，測(cè)定活體重后進(jìn)行屠宰，測(cè)定屠體性能指標(biāo)。屠宰測(cè)定按照全國(guó)家禽育種委員會(huì)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，測(cè)定全凈膛重、半凈膛和腹脂重，并計(jì)算腹脂率。腹脂率＝腹脂重/(全凈膛重+腹脂重)。

1.3DNA提取

用常規(guī)酚/氯仿抽提法提取基因組DNA。用微量紫外分光光度法檢測(cè)DNA的濃度和純度，其A260/A280須在1.6～1.9之間。

1.4PCR擴(kuò)增

根據(jù)Genbank中發(fā)表的鴨VLDLR基因序列，用Primer5.0設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增長(zhǎng)度為374bp，擴(kuò)增片段包含了VLDLR基因5’UTR和全部信號(hào)肽區(qū)域。

上下游引物序列為：

上游5’-ATTACACTGCCAAATGACC-3’

下游5’-CGGGAACTGGGATTCTTC-3’

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μL，反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性10min，然后35個(gè)循環(huán)(94℃變性30S，53.5℃退火30S，72℃延伸30S)，72℃延伸10min，4℃保存。

1.5測(cè)序和多態(tài)性檢測(cè)

PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳及Goldview染色后在凝膠成像儀上檢測(cè)，將產(chǎn)量高、特異性好的PCR產(chǎn)物經(jīng)送華大基因有限公司進(jìn)行純化雙向測(cè)序；利用DNAMAN軟件結(jié)合測(cè)序圖對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)分析從而準(zhǔn)確確定SNPs。

1.6統(tǒng)計(jì)方法

計(jì)算等位基因頻率，采用卡方檢驗(yàn)等位基因Hardy-Weinberg equilibrium平衡。

根據(jù)腹脂率及供試?guó)喨旱奶攸c(diǎn)，建立線性回歸模型：Y＝μ+G+e，其中：Y為性狀的測(cè)定值；μ為群體均值；G為基因型效應(yīng)；e為隨即殘差。

采用PHASE2.0軟件對(duì)單倍型和雙倍型進(jìn)行構(gòu)建并計(jì)算其頻率的大小。

采用Popgen32、PIC_CALC軟件對(duì)遺傳雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)及多態(tài)信息含量(PIC)進(jìn)行計(jì)算。

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS15.0軟件，各基因型的體重和腹脂率用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

SNPs位點(diǎn)的連鎖不平衡分析采用SHEsis軟件進(jìn)行分析并計(jì)算出r2。

2結(jié)果與分析

2.1擴(kuò)增結(jié)果

用所設(shè)計(jì)的引物對(duì)高郵鴨基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在500bp-250bp之間出現(xiàn)一條清晰的條帶，與預(yù)期片段大小(374bp)一致，且沒(méi)有非特異性擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2計(jì)算等位基因頻率

VLDLR基因5'UTR和信號(hào)肽編碼區(qū)的4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因頻率見(jiàn)表1。從表1中可看出在g.151位點(diǎn)，GA基因型的頻率最高，等位基因頻率G>A；在g.170位點(diǎn)，CC基因型的頻率最高，等位基因頻率C>T；在g.206位點(diǎn)，AG基因型的頻率最高，等位基因頻率A>G；在g.278-295位點(diǎn)，DD型的頻率最高，等位基因頻率D>B。遺傳雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)及多態(tài)信息含量(PIC)是反映群體遺傳特性的重要參數(shù)。從表1中可看出，g.206位點(diǎn)的He(遺傳雜合度)和Ne(有效等位基因數(shù))最高，分別為0.49和1.95，g.278-295位點(diǎn)的He(遺傳雜合度)和Ne(有效等位基因數(shù))最低，為0.42和1.71；g.206位點(diǎn)的PIC(多態(tài)信息含量)最高，為0.37，g.278-295位點(diǎn)最低，為0.33。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，除g.206位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)外(p＞0.05)，其余三個(gè)位點(diǎn)均不符合Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)(p＜0.05)。

表1高郵鴨群VLDLR基因5'UTR和信號(hào)肽編碼區(qū)基因頻率和平衡檢驗(yàn)(n＝267)

基因型頻率中表示方式：頻率/個(gè)數(shù)(基因型)；等位基因頻率中表示方式：等位基因頻率(等位基因)

2.3單倍型、雙倍型構(gòu)建及其頻率

采用PHASE2.0軟件，對(duì)4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)構(gòu)建了單倍型、雙倍型，并分析了相應(yīng)頻率，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)共構(gòu)建了8種單倍型，分別為H1(GTAB)、H2(ATAD)、H3(GTGD)、H4(GCAD)、H5(GCGD)、H6(ATGD)、H7(ACAD)、H8(ACGD)。其中H8(A-C-G-D)為最主要單倍型，頻率高達(dá)29.81％，H3(GTGD)和H7(ACAD)單倍型頻率最低，均為0.96％?；?個(gè)單倍型構(gòu)建了15個(gè)雙倍型，H4H8頻率最高，為28.16％。在15個(gè)雙倍型中，除H1H1、H5H8、H2H8、H4H8以外其余雙倍型的頻率均低于5％，不進(jìn)行相關(guān)性分析。

表2 4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的單倍型及其頻率

表3 4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的部分雙倍型及其頻率

2.4雙倍型對(duì)生長(zhǎng)性能及腹脂率的分析

表4列出了部分有顯著或極顯著差異的單倍型組合與生長(zhǎng)性狀及腹脂率的相關(guān)性。

由表4可看出，在0至5周齡，各雙倍型的體重均無(wú)顯著差異(P＞0.05)；在6周齡，H1H1雙倍型的體重最高，H2H8雙倍型的體重最低，兩者之間差異顯著(P＜0.05)；在7至10周齡，H1H1雙倍型的體重最高并極顯著高于H2H8雙倍型(P＜0.01)同時(shí)顯著高于H4H8雙倍型(P＜0.05)，而H2H8雙倍型與H4H8雙倍型的體重之間無(wú)顯著性的差異(P＞0.05)。對(duì)于屠宰率、半凈膛率和全凈膛率，各雙倍型均無(wú)顯著性差異，而相對(duì)于腹脂率來(lái)說(shuō)，H5H8型的腹脂率極顯著高于H1H1雙倍型和H2H8雙倍型(P＜0.01)，顯著高于H4H8雙倍型(P＜0.05)，H4H8雙倍型的腹脂率顯著高于H1H1雙倍型(P＜0.05)，H1H1雙倍型和H2H8雙倍型之間差異不顯著(P＞0.05)。最小二乘法分析結(jié)果表明，H1H1雙倍型的平均體重最高，H2H8雙倍型最低；H5H8雙倍型的腹脂率最高，H4H8雙倍型次之，H1H1雙倍型最低。雙倍型H1H1對(duì)體重有正向作用，H5H8雙倍型對(duì)腹脂率有正向作用，可以用作選擇肉鴨新品系的輔助分子標(biāo)記。

表4 4個(gè)SNP位點(diǎn)雙倍型與生長(zhǎng)性狀及腹脂率的關(guān)聯(lián)分析