本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地，涉及多重PCR檢測蠟樣芽孢桿菌毒力基因用引物組和試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
蠟樣芽胞桿菌為芽胞桿菌屬第I群中的一個種，與蘇云金芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌、炭疽芽胞桿菌和巨大芽胞桿菌的生化特征非常相似，通過過氧化氫酶試驗、動力試驗、硝酸鹽還原試驗、酪蛋白分解試驗、溶菌酶耐性試驗、V-P試驗、葡萄糖利用(厭氧)試驗、根狀生長試驗、溶血試驗、蛋白質毒素結晶試驗等生化試驗可以將蠟樣芽孢桿菌與同一屬中的其他種區(qū)分開。但是，傳統(tǒng)生化方法無法將含有致病因子的菌株區(qū)分開。
應用分子生物學手段不僅可以對蠟樣芽孢桿菌的種進行鑒定，還能夠獲得菌株攜帶致病因子(毒力基因)的信息，這些信息對于評價食品安全或者菌株致病性起到關鍵性作用。當前，已經(jīng)有一些分子生物學方法和技術對蠟樣芽孢桿菌的毒力基因進行篩查檢測，比如中國專利申請?zhí)枮?00910272677.X的發(fā)明申請公開了致病性蠟樣芽孢桿菌的環(huán)介導等溫擴增引物對與檢測方法。再如，中國專利申請?zhí)枮?01210380431.6的發(fā)明專利公開了“一種高特異高敏感檢測分泌嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的方法“；再如文獻“Diagnostic Real-Time PCR Assays for the Detection of Emetic Bacillus cereus Strains in Foods and Recent Food-Borne Outbreaks”(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,Mar.2007,p.1892–1898Vol.73,No.60099-2240)公開了一種實時熒光定量PCR方法檢測食物中毒爆發(fā)中蠟樣芽孢桿菌嘔吐毒素基因，該方法針對嘔吐毒素設計引物探針序列，擴增103bp特異性基因片段；再如文獻“Detection of Enterotoxic Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis Strains by PCR Analysis”(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,0099-2240)公開了蠟樣芽孢桿菌溶血素B L基因(hblA、hblC和hblD)、非溶血性的腸毒素Nhe基因(nheA、nheB和nheC)、腸毒素T基因(bceT)7個腸毒素相關基因的檢測方法，該方法設計了hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、bceT7個基因的特異性引物，使用普通PCR體系逐個擴增目標基因。
蠟樣芽孢桿菌毒力基因檢測通常要包括1個陽性內對照(IAC)、1個種屬鑒定基因、10個毒力基因，并且蠟樣芽孢桿菌毒力基因存在多基因并存的情況，最多可以同時存在9個腸毒素基因，所以，無論采用普通單重PCR方法、實時熒光PCR方法，還是等溫擴增PCR方法，逐個檢測毒力基因，操作繁瑣，非常耗時和耗力，并且對不同體系之間的質量控制要求較高。目前，還沒有采用多重PCR對蠟樣芽孢桿菌1個種屬鑒定基因、10個毒力基因以及陽性內對照同時檢測分析的報道。
普通單重PCR方法可以通過區(qū)分擴增產(chǎn)物大小實現(xiàn)多基因檢測，但是檢測靈敏度不高；實時熒光PCR方法和等溫擴增PCR方法具有較高的檢測靈敏度，但是同時檢測多個目標毒力基因的數(shù)量有限，無法實現(xiàn)減低工作量的目的。對蠟樣芽孢桿菌毒力基因的實際檢測中，需要一種具有較高靈敏度，較高多重檢測能力的技術手段。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于解決當前蠟樣芽孢桿菌毒力基因檢測技術中存在的問題，提供一種蠟樣芽孢桿菌毒力基因多重PCR檢測的引物組和試劑盒，
為達到以上目的，本發(fā)明提供了一種多重PCR檢測蠟樣芽孢桿菌毒力基因用引物組，其中，該引物組包括SEQ ID NO.1和3-24所示的引物，其中，所述蠟樣芽孢桿菌毒力基因包括嘔吐毒素合成酶基因B、溶血素B L基因A、溶血素B L基因C、溶血素B L基因D、非溶血性的腸毒素Nhe基因A、非溶血性的腸毒素Nhe基因B、非溶血性的腸毒素Nhe基因C、腸毒素FM基因、腸毒素T基因、細胞毒素K基因。
本發(fā)明的還提供了一種多重PCR檢測蠟樣芽孢桿菌毒力基因的檢測方法，該方法包括如下步驟：
(1)提取待測樣本的總DNA；
(2)以所述總DNA為模板，并使用本發(fā)明所述的引物組，進行多重PCR反應，獲得多重PCR擴增后的物料；
(3)對所述多重PCR擴增后的物料進行核酸電泳檢測，得到核酸電泳檢測的結果；
如果核酸電泳檢測的結果顯示所述多重PCR擴增后的物料中含有417bp的擴增產(chǎn)物，則指示所述待測樣本中含有DNA促旋酶基因B；
如果核酸電泳檢測的結果顯示所述多重PCR擴增后的物料中含有135bp的擴增產(chǎn)物，則指示所述待測樣本中含有嘔吐毒素合成酶基因B；
如果核酸電泳檢測的結果顯示所述多重PCR擴增后的物料中含有120bp的擴增產(chǎn)物，則指示所述待測樣本中含有溶血素B L基因A；
如果核酸電泳檢測的結果顯示所述多重PCR擴增后的物料中含有150bp的擴增產(chǎn)物，則指示所述待測樣本中含有溶血素B L基因C；
如果核酸電泳檢測的結果顯示所述多重PCR擴增后的物料中含有183bp的擴增產(chǎn)物，則指示所述待測樣本中含有溶血素B L基因D；
如果核酸電泳檢測的結果顯示所述多重PCR擴增后的物料中含有165bp的擴增產(chǎn)物，則指示所述待測樣本中含有非溶血性的腸毒素Nhe基因A；
如果核酸電泳檢測的結果顯示所述多重PCR擴增后的物料中含有300bp的擴增產(chǎn)物，則指示所述待測樣本中含有非溶血性的腸毒素Nhe基因B；
如果核酸電泳檢測的結果顯示所述多重PCR擴增后的物料中含有223bp的擴增產(chǎn)物，則指示所述待測樣本中含有非溶血性的腸毒素Nhe基因C；
如果核酸電泳檢測的結果顯示所述多重PCR擴增后的物料中含有363bp的擴增產(chǎn)物，則指示所述待測樣本中含有腸毒素FM基因；
如果核酸電泳檢測的結果顯示所述多重PCR擴增后的物料中含有272bp的擴增產(chǎn)物，則指示所述待測樣本中含有腸毒素T基因；
如果核酸電泳檢測的結果顯示所述多重PCR擴增后的物料中含有330bp的擴增產(chǎn)物，則指示所述待測樣本中含有細胞毒素K基因。
本發(fā)明還提供了一種多重PCR檢測蠟樣芽孢桿菌毒力基因的試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明所述的引物組和DNA聚合酶。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述的引物組在制備多重PCR檢測蠟樣芽孢桿菌毒力基因的試劑盒中的用途；其中，所述蠟樣芽孢桿菌毒力基因包括嘔吐毒素合成酶基因B、溶血素B L基因A、溶血素B L基因C、溶血素B L基因D、非溶血性的腸毒素Nhe基因A、非溶血性的腸毒素Nhe基因B、非溶血性的腸毒素Nhe基因C、腸毒素FM基因、腸毒素T基因及細胞毒素K基因。
通過上述技術方案本發(fā)明建立了蠟樣芽孢桿菌毒力基因多重PCR檢測引物組和方法，能夠實現(xiàn)血清學、病原培養(yǎng)學和免疫學所無法完成的毒力基因鑒定工作，克服其他分子生物學技術手段鑒定毒力基因的不足之處，達到如下的檢測效果：
(一)多重檢測
致病性蠟樣芽孢桿菌普遍存在多重毒力基因共存的情況，最多可達到單株細菌中攜帶9種不同的毒力基因。本發(fā)明所建立的檢測方法能夠在一次PCR反應中鑒定蠟樣芽孢桿菌的同時(通過DNA促旋酶基因B)，可篩查蠟樣芽孢桿菌的10個毒力基因cesB、hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、entFM、bceT、cytK。該檢測方法能快速簡便地確定樣品是否為蠟樣芽孢桿菌及其攜帶的毒力基因種類，進而判定其是否為致病株，能夠快速獲得檢測結果，節(jié)省時間、人力和物力成本。
(二)特異性高
本發(fā)明所建立的檢測方法的特異性主要體現(xiàn)在一整套特異性引物的特異性，所有引物都經(jīng)過BLAST比對分析，具有高度的保守性和特異性；同時經(jīng)過特異性試驗驗證能夠很好的區(qū)分與檢測目標種屬相近、生存環(huán)境相同的細菌，包括蘇云金芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、阪崎腸桿菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、單核增生性李斯特氏菌、霍亂弧菌、空腸彎曲菌、結腸彎曲菌及嗜水氣單胞菌等，證明檢測方法具有高度的特異性，能夠將非檢測目標準確分辨出來。
(三)靈敏度高
本發(fā)明所建立的檢測方法具有與單重實時熒光PCR相當?shù)臋z測靈敏度，主要是因為本發(fā)明針對所有目標基因的特異性引物對序列設計了特定的LHP序列，LHP序列中的同源通用引物能夠在第二階段PCR中提高多重PCR反應的擴增效率，降低多重PCR反應的非特異性擴增和引物二聚體的產(chǎn)生，而LHP中的6個堿基連接序列能夠保證同源通用引物擴增不同毒力基因時具有相同的擴增效率，避免多重PCR擴增過程中不同目標基因產(chǎn)量的失衡，從而總體上提高多重PCR檢測的靈敏度。本發(fā)明所建立的檢測方法在每一個反應體系中每個檢測目標的檢測靈敏度可達到103CFU/mL。
(四)成本較低
本發(fā)明所建立的多重PCR檢測方法采用普通PCR原理，減低了使用熒光探針的高成本，同時保證檢測效果。即使與普通單重PCR方法相比較，該多重檢測方法同時節(jié)省了重復檢測同一個樣本的試劑消耗，最大可節(jié)省90％的試劑成本；在操作性上一次反應檢測12個目標基因，至少節(jié)省了90％的人力成本和時間成本，原來單重檢測需要12次人工和12倍時間，現(xiàn)在使用此方法只需要1次人工和1個反應的時間。
(五)預防假陰性結果
本發(fā)明反應體系中添加的陽性內對照(IAC),可以有效的提示因為反應體系抑制原因造成的假陰性檢測結果。
本發(fā)明為蠟樣芽孢桿菌毒力基因的快速、準確篩查提供了完備的解決方案，能實現(xiàn)食物中毒事件發(fā)生后和疫情暴發(fā)后的致病性蠟樣芽孢桿菌快速篩檢與鑒定，為合理恰當處置疫情提供可靠的依據(jù)。
本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。
附圖說明
附圖是用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具體實施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中：
圖1是本發(fā)明試劑盒對三株蠟樣芽孢桿菌及其所含毒力基因的檢測結果毛細管電泳圖。
具體實施方式
以下結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
本發(fā)明的一種實施方式提供了一種多重PCR檢測蠟樣芽孢桿菌種屬基因及毒力基因用引物組，其中，該引物組能夠檢測蠟樣芽孢桿菌種屬基因：DNA促旋酶基因B，所述蠟樣芽孢桿菌毒力基因包括嘔吐毒素合成酶基因B、溶血素B L基因A、溶血素B L基因C、溶血素B L基因D、非溶血性的腸毒素Nhe基因A、非溶血性的腸毒素Nhe基因B、非溶血性的腸毒素Nhe基因C、腸毒素FM基因、腸毒素T基因以及細胞毒素K基因。(見表1)。
表1蠟樣芽孢桿菌毒力基因多重PCR檢測目標基因
優(yōu)選的，為了做好質量控制，在進行多重PCR反應時，反應體系中還加入陽性內對照(IAC)引物對，所述陽性內對照引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO.25-26所示，該引物對是以pET28a質粒為IAC模板設計的一對引物。
根據(jù)包括IAC在內的12對特異性引物對序列，設計與之匹配的LHP序列。LHP序列與每條特異性引物連接后使用，同源通用引物單獨使用。序列詳見表2。
表2蠟樣芽孢桿菌毒力基因多重PCR引物匯總表
*注：斜體為每個目標基因的特異性引物對序列
在本發(fā)明的一種實施方式中，涉及一種多重PCR檢測蠟樣芽孢桿菌毒力基因的檢測方法，所述方法包括如下步驟：
(1)提取待測樣本的總DNA；
(2)以所述總DNA為模板，并使用本發(fā)明所述的引物組，進行多重PCR反應，獲得多重PCR擴增后的物料；
(3)對所述多重PCR擴增后的物料進行核酸電泳檢測，得到核酸電泳檢測的結果；
如果核酸電泳檢測的結果顯示所述多重PCR擴增后的物料中含有417bp的擴增產(chǎn)物，則指示所述待測樣本中含有DNA促旋酶基因B；
如果核酸電泳檢測的結果顯示所述多重PCR擴增后的物料中含有135bp的擴增產(chǎn)物，則指示所述待測樣本中含有嘔吐毒素合成酶基因B；
如果核酸電泳檢測的結果顯示所述多重PCR擴增后的物料中含有120bp的擴增產(chǎn)物，則指示所述待測樣本中含有溶血素B L基因A；
如果核酸電泳檢測的結果顯示所述多重PCR擴增后的物料中含有150bp的擴增產(chǎn)物，則指示所述待測樣本中含有溶血素B L基因C；
如果核酸電泳檢測的結果顯示所述多重PCR擴增后的物料中含有183bp的擴增產(chǎn)物，則指示所述待測樣本中含有溶血素B L基因D；
如果核酸電泳檢測的結果顯示所述多重PCR擴增后的物料中含有165bp的擴增產(chǎn)物，則指示所述待測樣本中含有非溶血性的腸毒素Nhe基因A；
如果核酸電泳檢測的結果顯示所述多重PCR擴增后的物料中含有300bp的擴增產(chǎn)物，則指示所述待測樣本中含有非溶血性的腸毒素Nhe基因B；
如果核酸電泳檢測的結果顯示所述多重PCR擴增后的物料中含有223bp的擴增產(chǎn)物，則指示所述待測樣本中含有非溶血性的腸毒素Nhe基因C；
如果核酸電泳檢測的結果顯示所述多重PCR擴增后的物料中含有363bp的擴增產(chǎn)物，則指示所述待測樣本中含有腸毒素FM基因；
如果核酸電泳檢測的結果顯示所述多重PCR擴增后的物料中含有272bp的擴增產(chǎn)物，則指示所述待測樣本中含有腸毒素T基因；
如果核酸電泳檢測的結果顯示所述多重PCR擴增后的物料中含有330bp的擴增產(chǎn)物，則指示所述待測樣本中含有細胞毒素K基因。
可選的，所述核酸電泳檢測包括核酸凝膠電泳和/或核酸毛細管電泳。優(yōu)選為核酸毛細管電泳。
在本發(fā)明的一種實施方式中，采用QIaxcel全自動毛細管電泳分析儀作為結果分析的平臺?；赒Iaxcel的全自動操作和設定的智能化結果分析程序，從而實現(xiàn)結果的自動判定，第一階段(10-15個反應)長引物序列中特異性引物序列與模板中的特異性序列結合，積累一定數(shù)量的模板，同時將同源通用引物序列引入擴增子中；第二階段(30-35個反應)同源通用引物擴增第一階段積累的模板。
具體的，多重PCR反應的條件包括如下a-i的步驟：
a：94-96℃，4-6min；
b：94-96℃，15-60s，
c：50-60℃，15-60s，
d：71-73℃，60-120s，進行10-15個b-d的循環(huán)；
e：94-96℃，15-60s，
f：55-65℃,15-60s，
g：71-73℃，30-60s，進行30-35個e-g的循環(huán)；
h：71-73℃，5-10min。
其中，SEQ ID NO.3-24所示的引物的最終使用濃度各自為0.1-0.8μM，SEQ ID NO.1所示的引物的最終使用濃度為0.4-0.8μM。
在本發(fā)明的一種實施方式中，多重PCR反應體系的配置如下：
Taq DNA聚合酶1-2U，5×PCR buffer(Tris-HCl 100mM(pH8.3)，KCl250mM，tween-20 0.2％)5μL，10mm的dNTP 0.5-1.5μL，25mM的MgCl2 1-5μL，10x引物混合物2.5μL(包括陽性內對照在內的每個待測目標的長引物濃度1μm-8μm，同源通用引物濃度4μm-8μm)，pET28a 0.0003-0.01ng，DNA模板2-5μL，超純水補至25μL。
本發(fā)明的一個方面還提供了一種多重PCR檢測蠟樣芽孢桿菌毒力基因的試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明所述的引物組和DNA聚合酶。
優(yōu)選的，所述試劑盒還包括PCR反應所需的PCR反應試劑，所述反應試劑可以為反應緩沖液和dNTP。
本發(fā)明還提供了上述引物組在制備多重PCR檢測蠟樣芽孢桿菌毒力基因的試劑盒中的用途；其中，所述蠟樣芽孢桿菌毒力基因包括嘔吐毒素合成酶基因B、溶血素B L基因A、溶血素B L基因C、溶血素B L基因D、非溶血性的腸毒素Nhe基因A、非溶血性的腸毒素Nhe基因B、非溶血性的腸毒素Nhe基因C、腸毒素FM基因、腸毒素T基因、細胞毒素K基因。
下面結合實施例對本發(fā)明進行說明。
實施例1蠟樣芽孢桿菌毒力基因多重PCR檢測試劑盒的組建
該試劑盒由2×反應體系緩沖液、DNA聚合酶、10×引物混合液、陽性對照、超純水構成，其具體組分如下：
按照表2所示的序列，進行SEQ ID NO.1和3-26的引物的合成。配置多重PCR反應體系：2×PCR Buffer(Tris·HCl 40mM(pH8.3)，KCl 100mM，
tween-20 0.08％，0.0006ng/μL pet28a，1.5mM dNTP、8mM MgCl2)；25×DNA聚合酶(2U/μL)；10×引物混合液(包括IAC在內的長引物對濃度各2μM，
同源通用引物SEQ ID NO 1濃度為8μM))；陽性對照(含有9個腸毒素的蠟樣芽孢桿菌(購自中國醫(yī)學菌種保藏中心，編號為63303)。所含基因為溶血素B L基因A、溶血素B L基因C、溶血素B L基因D、非溶血性的腸毒素Nhe基因A、非溶血性的腸毒素Nhe基因B、非溶血性的腸毒素Nhe基因C、腸毒素FM基因、腸毒素T基因、細胞毒素K基因)和嘔吐型蠟樣芽孢桿菌(購自中國醫(yī)學菌種保藏中心，編號為63304。所含基因為嘔吐毒素合成酶基因B，上述兩個菌株都含有DNA促旋酶基因B)混合模板，每種均為106CFU/ml。
試劑盒檢測的反應體系為25μL，其配置如下：2×PCR Buffer 12.5μL；25×DNA聚合酶1μL；10×引物混合物2.5μL；模板5μL，超純水4μL。
實施例2試劑盒的操作和結果判斷
1、基因組的提取
取增菌液或劃線培養(yǎng)的菌落(取自上述陽性對照的兩個菌株的培養(yǎng)菌落)溶于水中，用濁度計調整細菌懸液濃度至108CFU/ml，取1ml細菌懸液，13000rpm離心3min，使用提取緩沖液(1.7％SDS，200mM Tris，pH 8，20mM EDTA，200mM NaCl)重懸菌體，加入蛋白酶K，55℃孵育1h。沸水浴10min后冰浴，13000rpm離心10min，取上清作為試劑盒檢測用模板。
2、反應體系的配制
取200μL的PCR管配置25μL的反應體系，其配置如下：2×PCR Buffer12.5μL；DNA聚合酶1μL；10×引物混合物2.5μL；模板5μL，超純水4μL。
3、PCR反應
將PCR管放入Bio-Rad C1000型PCR儀中，開啟熱蓋后，按照如下程序進行PCR反應：a：95℃5min；b：95℃15s，c：50℃30s，d：72℃90s，b-d循環(huán)10個反應；e：95℃15s，f：60℃30s，g：72℃30s，e-g循環(huán)35個反應；h：72℃5min。
4、全自動毛細管電泳分析PCR產(chǎn)物
將PCR反應管放入全自動毛細管電泳儀Qiaxcel Advanced(凱捷公司)，使用高分辨率卡夾，選擇15-2000bp的alignment marker，100-61500bp的size marker，自動分析目標條帶的大小。
5、結果判斷
根據(jù)gyrB 417bp、cesB 135bp、hblA 120bp、hblC 150bp、hblD 183bp、nheA 165bp、nheB 300bp、nheC 223bp、entFM 363bp、bceT 272bp、cytK 330bp。判定某菌株是否是蠟樣芽孢桿菌及其所含毒力基因的種類。
具體判定如下：擴增的結果如圖1所示，由圖1可知，包括空白對照在內的所有泳道均至少有一個條帶擴增，空白對照(第5泳道)有陽性內對照(532bp)的擴增，其他檢測有目標條帶和(或)陽性內對照的擴增，表明所有PCR反應均成立，排除假陰性的結果。否則視實驗無效，需要重復。
第1泳道為2000bp的size marker，在陽性內對照擴增的基礎上，第2泳道還出現(xiàn)5條PCR產(chǎn)物，120bp的是hblA的擴增條帶，150bp的是hblC的擴增條帶，183bp的是hblD的擴增條帶，330bp的是cytK的擴增條帶，417bp的是gyrB的擴增條帶。第3泳道還出現(xiàn)7條PCR產(chǎn)物，120bp的是hblA的擴增條帶，150bp的是hblC的擴增條帶，183bp的是hblD的擴增條帶，223bp的是nheC的擴增條帶，272bp的是bceT的擴增條帶，330bp的是cytK的擴增條帶，417bp的是gyrB的擴增條帶。第4泳道還出現(xiàn)10條PCR產(chǎn)物，120bp的是hblA的擴增條帶，150bp的是hblC的擴增條帶，165bp的是nheA的擴增條帶，183bp的是hblD的擴增條帶，223bp的是nheC的擴增條帶，272bp的是bceT的擴增條帶，300bp的是nheB的擴增條帶，331bp的是cytK的擴增條帶，363bp的是entFM，417bp的是gyrB的擴增條帶。對圖1的具體描述如表3：
表3
實施例3試劑盒的保存期試驗
以105CFU/mL的含有9個腸毒素基因的蠟樣芽孢桿菌和含有cesB嘔吐毒素基因的蠟樣芽孢桿菌模板混合物為評估用檢測樣本，在第0天時，分裝成9份凍存于-70℃冰箱中。將組建完畢的試劑盒放置于-20℃保存，分別取0、10、15、30、60、90、120、150、180及360天的試劑盒進行保存期試驗。保存期檢測結果如表4所示：
表4保存期試驗結果
由表4可知，試劑盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期檢測蠟樣芽孢桿菌的12個目標基因均為陽性，實驗結果表明該試劑盒的保存期至少為6個月。
實施例4試劑盒的特異性試驗
選擇蘇云金芽孢桿菌(購自中國醫(yī)學菌種保藏中心，編號為21675)、大腸埃希氏菌(購自中國醫(yī)學菌種保藏中心，編號為43317)、阪崎腸桿菌(購自中國醫(yī)學菌種保藏中心，編號為21665)、志賀氏菌(購自中國醫(yī)學菌種保藏中心，編號為51054)、金黃色葡萄球菌(購自中國醫(yī)學菌種保藏中心，編號為26003)、沙門氏菌(購自中國醫(yī)學菌種保藏中心，編號為50001)、副溶血性弧菌(購自中國醫(yī)學菌種保藏中心，編號為21617)、單核增生性李斯特氏菌(購自中國醫(yī)學菌種保藏中心，編號為54002)、霍亂弧菌(購自中國醫(yī)學菌種保藏中心，編號為1109)、空腸彎曲菌(購自中國醫(yī)學菌種保藏中心，編號為21865)、結腸彎曲菌(購自中國醫(yī)學菌種保藏中心，編號為21669)和嗜水氣單胞菌(購自中國醫(yī)學菌種保藏中心，編號為44016)這些與檢測目標菌種屬相近，存在環(huán)境相似的細菌作為待檢細菌。
應用本發(fā)明試劑盒檢測這些待檢細菌，陽性內對照均為陽性，證明檢測系統(tǒng)成立；待檢細菌均沒有非特異性的雜帶，表明本發(fā)明試劑盒能夠有效區(qū)分非目標細菌，具有較好的特異性。
實施例5試劑盒最低檢出限試驗
評估用檢測樣本(源自中國疾病預防控制中心)：選擇4個蠟樣芽孢桿菌菌株，菌株1(模板1)含有hblA、hblC、hblD、cytK四個毒力基因，菌株2(模板2)含有hblA、hblC、hblD、cytK、nheC、bceT六個毒力基因，菌株3和菌株4混合(模板3)含有cesB、hblA、hblC、hblD、cytK、nheA、nheB、nheC、bceT、entFM10個毒力基因。將3個模板的菌懸液分別調整至108CFU/mL，將3個模板梯度稀釋成105CFU/mL，104CFU/mL，103CFU/mL，102CFU/mL的檢測樣品。
使用本發(fā)明試劑盒分別檢測不同稀釋度的模板1、2、3。根據(jù)實施例2進行操作和結果判斷，試劑盒檢測11個目標基因的最低檢出限試驗結果如表5所示：
表5試劑盒檢測蠟樣芽孢桿菌11個目標基因最低檢出限試驗結果
從表5看出，試劑盒檢測cesB、hblA、hblC、hblD、cytK、nheA、nheB、nheC、bceT、entFM、gyrB基因的最低檢出限均為102CFU/mL，試劑盒總體的最低檢出限為103CFU/mL，每個PCR反應檢測每個目標基因的最低檢出限為1個目標分子。
對比例1
按照與實施例1相同的方法組裝對比試劑盒1。
區(qū)別僅在于，將SEQ ID NO.3-24所示的引物替換為SEQ ID NO.27-48所示的引物獲得對比試劑盒1，具體序列請見表6。
表6對比引物序列表
按照與實施例8和9相同的方法進行特異性和敏感性試驗，區(qū)別僅在于，將實施例1的引物組中SEQ ID NO.3-4所示的引物替換為SEQ ID NO.27-28所示的引物獲得對比引物組1。
將實施例1的引物組中SEQ ID NO.5-6所示的引物替換為SEQ ID NO.29-30所示的引物獲得對比引物組2。
將實施例1的引物組中SEQ ID NO.7-8所示的引物替換為SEQ ID NO.31-32所示的引物獲得對比引物組3。
將實施例1的引物組中SEQ ID NO.9-10所示的引物替換為SEQ ID NO.33-34所示的引物獲得對比引物組4。
將實施例1的引物組中SEQ ID NO.11-12所示的引物替換為SEQ ID NO.35-36所示的引物獲得對比引物組5。
實施例1的引物組中SEQ ID NO.13-14所示的引物替換為SEQ ID NO.37-38所示的引物獲得對比引物組6。
實施例1的引物組中SEQ ID NO.15-16所示的引物替換為SEQ ID NO.39-40所示的引物獲得對比引物組7。
實施例1的引物組中SEQ ID NO.17-18所示的引物替換為SEQ ID NO.41-42所示的引物獲得對比引物組8。
實施例1的引物組中SEQ ID NO.19-20所示的引物替換為SEQ ID NO.43-44所示的引物獲得對比引物組9。
實施例1的引物組中SEQ ID NO.21-22所示的引物替換為SEQ ID NO.45-46所示的引物獲得對比引物組10。
實施例1的引物組中SEQ ID NO.23-24所示的引物替換為SEQ ID NO.47-48所示的引物獲得對比引物組11。
其中，用對比引物組1-11分別擴增陽性對照(含有9個腸毒素的蠟樣芽孢桿菌(購自中國醫(yī)學菌種保藏中心，編號為63303。所含基因為溶血素B L基因A、溶血素B L基因C、溶血素B L基因D、非溶血性的腸毒素Nhe基因A、非溶血性的腸毒素Nhe基因B、非溶血性的腸毒素Nhe基因C、腸毒素FM基因、腸毒素T基因、細胞毒素K基因)及嘔吐型蠟樣芽孢桿菌(購自中國醫(yī)學菌種保藏中心，編號為63304)。所含基因為嘔吐毒素合成酶基因B)。
將對比引物組混合，擴增11種無關病原體樣本的總核酸與等量的陽性內對照的混合樣本。
分別按照與實施例1和2相同的方法進行特異性和最低檢出限試驗，結果顯示本對比例的引物27-48的特異性、敏感性和覆蓋率均差于實施例1-3的引物。
雖然各實驗組都檢測出了蠟樣芽孢桿菌的種屬鑒定基因DNA促旋酶基因B，但對比引物組2、3、4、11沒有擴增出對應目標的條帶，最低檢出限為每個反應每個基因為10-100個分子，較本試劑盒差。在對11種無關病原體樣本的總核酸與等量的陽性內對照的混合樣本的特異性展示中，除了陽性內對照外還有其余的雜帶，說明其特異性較本試劑盒的特異性的引物組差。
與本發(fā)明所提供的方法比較可知本發(fā)明所提供的的多重PCR檢測方法具有高度的敏感性和重復性。
以上結合附圖詳細描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本發(fā)明的技術構思范圍內，可以對本發(fā)明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護范圍。
另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。
此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應當視為本發(fā)明所公開的內容。