本發(fā)明涉及重金屬污染生物防治
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，涉及一株蠟狀芽孢桿菌y10及其在耐鎘和/或降低有效鎘含量中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：鎘是最強(qiáng)的重金屬元素之一，其污染具有隱蔽性，不可逆性、長期性以及危害性等特點(diǎn)。過量的鎘會抑制正常的植物生長，在可食用的部分還會通過食物鏈進(jìn)入到人體當(dāng)中，危害人類的生理健康，如上世紀(jì)發(fā)生在日本富山縣通川流域的“骨痛病”，以及湖南衡陽的鎘大米事件等。鎘被植物大量吸收后能產(chǎn)生各種生理毒害反應(yīng)，通過損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)，破壞植物呼吸作用、光合作用和營養(yǎng)代謝等影響植物的正常代謝活動和生長發(fā)育，致使作物減產(chǎn)，乃至死亡。且鎘污染事件頻發(fā)，因此鎘污染的治理以及預(yù)防，目前是國際性的難題與研究熱點(diǎn)，備受關(guān)注。利用生物修復(fù)鎘污染的土壤與水體具有獨(dú)特的作用，以其具有良好的社會、生態(tài)效益，易被廣大群眾接受，符合可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略，也具有廣闊的應(yīng)用前景。微生物既可以吸收重金屬儲藏與胞內(nèi)，也可以改變根際微環(huán)境，降低土壤中重金屬的毒性，如改變鎘存在的形式，分泌相關(guān)多肽將鎘螯合成為無效鎘。現(xiàn)如今主要的糧食作物耕地正處于鎘污染狀態(tài)，因此減少耕地中的鎘含量以及降低有效鎘含量至關(guān)重要。蠟狀芽孢桿菌具有降解大氣、水體和土壤中二甲基二硫醚的能力，達(dá)到有效降解含硫惡臭物而起到保護(hù)環(huán)境的作用；降解多環(huán)芳烴（其中28種被視為持久性有機(jī)污染物）能力；降解除草劑草甘膦、敵草胺和烯酰嗎啉農(nóng)藥殘留、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥。也可特異性分泌角蛋白酶將禽類羽毛降解為多肽與氨基酸；分泌氨肽酶，將蛋白質(zhì)深度水解、減弱蛋白酶解液的苦味，制備生產(chǎn)生物活性多肽；產(chǎn)磷脂酶c將卵磷脂降解產(chǎn)生可供植物利用的磷肥，促進(jìn)南方紅豆杉實(shí)生苗和楊樹苗的生長發(fā)育，以及能夠促進(jìn)中國楓香苗的生長；其可作為外生菌根輔助細(xì)菌，與菌根真菌雙接種可顯著促進(jìn)菌根真孢子萌發(fā)和菌絲生長，提高菌根侵染率，從而達(dá)到促進(jìn)植物生長，如黑松（林木）的生長。當(dāng)然其也具有較好的抑菌活性，能夠明顯抑制有害大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和金黃色葡萄球菌。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一株蠟狀芽孢桿菌y10，所述菌株具有快速繁殖、較強(qiáng)耐酸堿耐鹽能力、生長勢良好以及具有分泌促生長物質(zhì)促進(jìn)植物生長的能力。本發(fā)明的另一目的在于提供蠟狀芽孢桿菌y10菌株在耐鎘和/或降低有效鎘含量中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下方案予以實(shí)現(xiàn)的：一株蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus）y10，所述菌株于2016年10月31日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心（gdmcc），菌種保藏號為gdmccno：60097，分類命名為蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus），保藏地址為廣東省廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓。所述蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus）y10菌株具有如下形態(tài)和生理、生化特性：a、菌體形態(tài)特性：蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus）y10細(xì)胞呈棒桿狀。b、菌落形態(tài)特性：在lb瓊脂平板上生長速度較快，菌落圓形，呈乳白色，中間凸起（37℃，生長24小時），菌落直徑5-7毫米。ph生長范圍較廣，可耐ph值3-9，最適生長溫度是37℃及最佳生長ph值7。c、生理生化特性：兼性好氧，能以淀粉、葡萄糖、檸檬酸鹽、尿素、d-核糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、吐溫80、l-絡(luò)氨酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長；不能發(fā)酵以阿拉伯糖、甘露醇、木糖、乳糖、棉籽糖、鼠李糖、d-半乳糖、松三塘、蜜二糖，七葉苷、纖維二糖為碳源。菌株耐nacl的濃度達(dá)2.0%；對5μg/ml鏈霉素、新霉素，50μg/ml氨芐青霉素、紅霉素；而對卡拉霉素、慶大霉素、和四環(huán)素氯霉素耐受性差、低濃度（5μg/ml）就能抑制其生長。進(jìn)一步地，所述菌株的16srdna序列如seqidno：1所示。所述蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus）y10生長和代謝過程中可以產(chǎn)生胞內(nèi)巰基蛋白，將溶液中的鎘富集與細(xì)胞內(nèi)，降低溶液中的鎘含量，改菌株還能分泌小分子物質(zhì)至胞外與有效鎘結(jié)合降低有效鎘的含量，從而達(dá)到降低溶液中鎘的含量。因此，本發(fā)明要求保護(hù)蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus）y10菌株在耐鎘和/或降低有效鎘含量中的應(yīng)用。一種耐鎘和/或降低有效鎘含量的菌劑，含有如上所述的蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus）y10菌株及輔料。優(yōu)選地，所述菌劑中y10菌株的細(xì)胞密度od600為1。一種耐鎘和/或降低有效鎘含量的方法，將如上所述y10菌株制成od600為1的種子液，然后將種子液接種于鎘污染的樣品中，30～37℃培養(yǎng)3～36h。優(yōu)選地，所述種子液接種于鎘污染的樣品中后，y10菌株在鎘污染的樣品中的最終細(xì)胞濃度od600為0.025。優(yōu)選地，種子液接種于鎘污染的樣品中后在37℃培養(yǎng)24h，處理鎘的效果最好。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明提供了一株蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus）y10，所述蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus）y10能夠在液體培養(yǎng)基中快速大量繁殖，其生長和代謝過程中產(chǎn)生很多的胞內(nèi)巰基蛋白，并將溶液中的鎘富集與細(xì)胞內(nèi)，從而降低溶液中的鎘含量，并且該菌株可以分泌小分子物質(zhì)至胞外與有效鎘結(jié)合降低有效鎘的含量，從而達(dá)到降低溶液中鎘的含量。可用于制備耐鎘和/或降低環(huán)境中鎘重金屬的菌劑，進(jìn)而用于受鎘污染的水資源和耕地土壤中。附圖說明圖1為菌株蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus）y10接種到不同濃度含鎘液體培養(yǎng)基中，不同時間處理后各處理的鎘濃度；其中鎘濃度分別為0、100、200、400μm。l代表離心處理后得上清液，g代表過濾處理后得濾液。圖2為菌株y10的菌落圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本
技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。實(shí)施例1一、菌株的分離和純化：發(fā)明人通過分離純化廣西梧縣野生稻中的內(nèi)生菌獲得蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus）y10，分離純化的具體步驟為：將從廣西梧縣采取回來的野生稻用自來水沖洗干凈，再用將從廣西采取回來的野生稻用蒸餾水洗凈，剪下長度3～5cm根、莖、葉分別置于已經(jīng)滅過菌的碾砵當(dāng)中碾碎，再置于磷酸緩沖液中懸浮樣品，80℃高溫溫育10分鐘。取20μl上清液于1ml無菌水中稀釋，再取20μl稀釋至1ml，后取20μl涂布于滅菌的lb固體平板培養(yǎng)基中，將平板于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察菌體的生長情況，用接種環(huán)挑取長勢較好并不同形態(tài)特征的菌苔，用平板劃線法進(jìn)行反復(fù)傳代培養(yǎng)，直至菌落的顏色、形狀、大小、質(zhì)地和透明度一樣。最后通過簡單染色（石碳酸復(fù)紅染色）和顯微鏡鏡檢（油鏡），進(jìn)一步觀察其形態(tài)，以長度均一、寬度一致、染色情況統(tǒng)一為菌株純化標(biāo)準(zhǔn)。純化后的菌株于15%的甘油中-20℃和-80℃保存。二、耐鎘菌株的篩選1、對步驟一所分離、純化到的菌株劃線于固體lb培養(yǎng)基平板，24h后將純化的菌株接種到8ml含600μmol/ml鎘的lb液體培養(yǎng)基中，37℃、120rpm培養(yǎng)24h，觀察菌體生長情況，挑選出生長良好的菌體進(jìn)行初篩。2、將步驟1得到具有耐鎘生長的菌株，接種到100ml含0、100、200、400μmol.ml-1鎘的lb液體培養(yǎng)基中，37℃、120rpm培養(yǎng)0、3、6、9、12、24和36h，期間各采樣一次進(jìn)行樣品處理。于0、3、6、9、12、24和36h采取的菌液樣品進(jìn)行處理：14000rpm離心，獲得上清液；一部分上清液用0.22μm的過濾器進(jìn)行過濾得濾液，樣品處理后利用原子吸收分光光度計測定處理液中的鎘含量。在測定不同處理液中的鎘含量后，數(shù)據(jù)如圖1，表明y10具有將培養(yǎng)基中的鎘富集與菌體細(xì)胞內(nèi)，并且同樣會分泌胞外蛋白將有效鎘螯合成為無效鎘，從而降低溶液中的鎘含量。因此，采用上述方法成功篩選獲得一株能對鎘具有強(qiáng)耐受性且降低溶液中可溶性鎘含量和更低的有效鎘含量的菌株，命名為y10，數(shù)據(jù)見圖1。從圖1結(jié)果可以看出，在不同濃度鎘處理下，菌株蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus）y10在處理不同時間后，溶液中的有效鎘含量呈現(xiàn)明顯下降趨勢，并且過濾后濾液中的有效鎘含量明顯少于離心上清液中。且在24h后，100μm過濾濾液中的鎘含量由原來的11.25mg/l降至0.0242mg/l；200μm（22.5mg/l）鎘濃度下，離心液上清液中的鎘含量降至6.0001mg/l，過濾濾液中的鎘含量降至4.627mg/l；400μm（45mg/l）鎘濃度下，離心液上清液中的鎘含量降至25.2145mg/l，過濾濾液中的鎘含量降至21.4687mg/l。將分離純化后的菌株y10在lb平板上培養(yǎng)1～2d后，收集平板上的菌體。保存于15%滅菌甘油(-20℃和-80℃)。實(shí)施例2菌株的鑒定和保藏：實(shí)施例1分離得到的一株蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus）y10具有如下形態(tài)和生理、生化特性：a、菌體形態(tài)特性：蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus）y10菌株呈棒桿狀。b、菌落形態(tài)特性：在lb瓊脂平板上生長速度較快，菌落圓形，呈乳白色，中間凸起（37℃，生長24小時），菌落直徑5～7毫米（如圖2）。ph生長范圍較廣，可耐ph值3～9，最適生長溫度是37℃及最佳生長ph值7。c、生理生化特性：兼性好氧，能以淀粉、葡萄糖、檸檬酸鹽、尿素、d-核糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、吐溫80、l-絡(luò)氨酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長；不能發(fā)酵以阿拉伯糖、甘露醇、木糖、乳糖、棉籽糖、鼠李糖、d-半乳糖、松三塘、蜜二糖，七葉苷、纖維二糖為碳源。菌株耐nacl的濃度達(dá)2.0%；對5μg/ml鏈霉素、新霉素，50μg/ml氨芐青霉素、紅霉素耐受；而對卡拉霉素、慶大霉素、和四環(huán)素氯霉素耐受性差、低濃度（5μg/ml）就能抑制其生長。所述的蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus）分子分類地位的確定：采用細(xì)菌16srrna基因通用引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將pcr產(chǎn)物直接測序，獲得菌株的16srdna序列（如seqidno：1所示），將16srdna序列輸入genbank進(jìn)行blast比對，初步確定本發(fā)明的y10菌株在分類學(xué)中的屬、種的位置。結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的y10菌株與蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus）模式菌株atcc14579相似性為100%，結(jié)合上述形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性、16srrna系統(tǒng)發(fā)育分析及文獻(xiàn)查閱，本發(fā)明的y10應(yīng)歸屬于蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus）。本發(fā)明所述的蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus）y10已于2016年10月31日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心（gdmcc），菌種保藏號為gdmccno：60097，分類命名為蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus），保藏地址為廣東省廣州市先烈中路100號。實(shí)施例4耐鎘菌株在高濃度鎘條件下巰基含量測定：對具有耐鎘能力的蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus）y10劃線與lb平板上，待其生長12h后，挑取單菌落接種于lb液體培養(yǎng)基中，37℃、120rpm培養(yǎng)12h，致使其生長至對數(shù)生長期，測定其od值。后將其接種至100ml含400μmolml-1鎘的lb液體培養(yǎng)基中，使其菌體終濃度od6000為0.025，37℃、120rpm培養(yǎng)36h。用1.5ml離心管收集菌液，12000rpm，4℃離心10min，后將菌體與上清液分隔開，用于不同試驗測定。將菌體用pbs洗滌2次，再用pbs重懸，凍融法裂解細(xì)胞，bradford蛋白定量法測定蛋白含量，ellman法定量測定巰基含量。同樣方法將上清液代替細(xì)胞裂解液，測定上清液中的蛋白含量以及巰基含量，實(shí)驗結(jié)果如表1。表1為鎘處理菌體與上清液中巰基含量鎘處理c(-sh)(巰基/蛋白mol/mg)c(-sh)(巰基/蛋白mol/mg)y10無5.440×10-54.601×10-6y10有61.010×10-54.836×10-6注明：巰基含量是表示蛋白中含有的巰基量。表1中數(shù)據(jù)說明，在鎘濃度500μm（56.25mg/l）條件下，菌株y10合成的胞內(nèi)蛋白巰基含量為61.01×10-5mol/mg，是空白菌株中的11.22倍；而菌體合成的胞外蛋白巰基含量相差不遠(yuǎn)，但是其胞外蛋白或者小分子物質(zhì)也可以與有效鎘結(jié)合，使有效鎘沉默。結(jié)果表明菌株蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus）y10具有耐鎘生長特性，具有合成大量含巰基胞內(nèi)蛋白，將胞外的鎘富集于胞內(nèi)的能力，并且不影響菌體的生長，其也可以分泌胞外物質(zhì)與胞外的有效鎘結(jié)合，使之成為無效鎘，從而進(jìn)一步降低有效鎘含量，達(dá)到緩解鎘的毒害脅迫作用。sequencelisting<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一株蠟狀芽孢桿菌y10及其在耐鎘和/或降低有效鎘含量中的應(yīng)用<130><160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>1512<212>dna<213>16srdna<400>1ttattggagagtttgatcctggctcaggatgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaa60gtcgagcgaatggattaagagcttgctcttatgaagttagcggcggacgggtgagtaaca120cgtgggtaacctgcccataagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggata180acattttgaaccgcatggttcgaaattgaaaggcggcttcggctgtcacttatggatgga240cccgcgtcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccg300acctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggc360agcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgat420gaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtgctagttgaataagc480tggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggt540aatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggtggttt600cttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactgggagac660ttgagtgcagaagaggaaagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcgtagagatatgg720aggaacaccagtggcgaaggcgactttctggtctgtaactgacactgaggcgcgaaagcg780tggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagt840gttagagggtttccgccctttagtgctgaagttaacgcattaagcactccgcctggggag900tacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcat960gtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgaaaaccc1020tagagatagggcttctccttcgggagcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagct1080cgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgcca1140tcattaagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatga1200cgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaa1260agagctgcaagaccgcgaggtggagctaatctcataaaaccgttctcagttcggattgta1320ggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcgg1380tgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacaccc1440gaagtcggtggggtaacctttttggagccagccgcctaaggtgggacagatgattggggt1500gaagtcgtaaca1512當(dāng)前第1頁12