專(zhuān)利名稱：一種蠟樣芽孢桿菌菌株及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)涉及一種蠟樣芽孢桿菌菌株，同時(shí)還涉及其蠟樣芽孢桿菌菌株在抑制煙草黑脛病方面的用途。
背景技術(shù)：
煙草是重要的經(jīng)濟(jì)作物，也是病害危害最嚴(yán)重的作物之一，從播種到收獲，整個(gè)過(guò)程都可受到病原物的侵染，而引起侵染性病害。煙草黑胚病parasiticavar nicotianae (Breda de Hean) Tuker)是煙草生產(chǎn)危害嚴(yán)重的病害之一,在我國(guó)除東北煙區(qū)零星發(fā)生以外，包括臺(tái)灣省在內(nèi)的華南、華中、華東和西北種植煙區(qū)均廣泛發(fā)生，經(jīng)濟(jì)損失較為嚴(yán)重。目前生產(chǎn)上一般采用抗病品種、栽培防治、化學(xué)防治以及生物防治措施，但由于該病菌的游動(dòng)孢子形成速度快且數(shù)量大，侵染煙株后潛育期短、發(fā)病快，在一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)可以發(fā)生多次再侵染，同時(shí)該病有時(shí)還與其它病害混合發(fā)生，從而導(dǎo)致一些抗黑脛病品種抗性的喪失；化學(xué)防治中化學(xué)農(nóng)藥的采用，短期內(nèi)有效。但長(zhǎng)期反復(fù)施用，會(huì)造成煙株藥害、煙株農(nóng)藥殘留和病菌對(duì)農(nóng)藥的抗藥性。生物防治是國(guó)際上目前進(jìn)行植物病害防治的首選防治措施，這種從自然界中分離、篩選有益微生物并用于病原微生物的拮抗、抑制作用的防治方法，具有聞效、無(wú)毒、無(wú)殘留和低成本等特點(diǎn)。
從現(xiàn)有植物病害生物防治的研究報(bào)道來(lái)看，采用的微生物種類(lèi)有細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物。但生防菌種普遍存在著定殖不易，容易受外界條件的影響，如對(duì)光、紫外、干燥較為敏感。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述問(wèn)題而提供的一種具有抗逆性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、較穩(wěn)定、易于定殖，對(duì)光和紫外穩(wěn)定，易產(chǎn)業(yè)化、成本較低、儲(chǔ)存期長(zhǎng)、易于施用等特點(diǎn)，且對(duì)煙草有一定的促生長(zhǎng)作用的蠟樣芽孢桿菌菌株。本發(fā)明的另一目的在于提供該蠟樣芽孢桿菌菌株在抑制煙草疫霉方面的用途。一種蠟樣芽孢桿菌UmiBacillus cereus 1205)，其形態(tài)特征:1205菌株在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上，37 °C，培養(yǎng)36 h，菌落近圓形，灰白色，不透明，菌落大，3-7mm，邊緣不整齊呈擴(kuò)展?fàn)?，表面粗糙顆粒狀似毛玻璃狀或蠟狀，不分泌色素；為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，桿狀，1.0 1.3 X 3.0 5.0 μ m，成鏈，運(yùn)動(dòng)性，芽孢橢圓形，端生或次端生，芽孢膨大不明顯；能耐受7%NaCl的培養(yǎng)，接觸酶陽(yáng)性、葡萄糖發(fā)酵陽(yáng)性、淀粉水解陽(yáng)性、硝酸鹽還原陽(yáng)性、明膠液化陽(yáng)性、麥芽糖發(fā)酵陽(yáng)性 、半固體穿刺試驗(yàn)陽(yáng)性、酪素水解陽(yáng)性、VP試驗(yàn)陰性、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陰性、吲哚實(shí)驗(yàn)陰性、蔗糖發(fā)酵陰性、乳糖發(fā)酵陰性、甘露醇水解陰性。該菌種已于2012年9月26日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)),保藏號(hào):CCTCC NO: M2012382，名稱為:蠟樣芽孢桿菌1205 (.Bacillus cereus1205)。對(duì)煙草疫霉有抑制作用的蠟樣芽孢桿菌1205 (.Bacillus cereus 1205)的分離步驟:
(I)拮抗菌的分離與純化:稱取采自貴州省畢節(jié)市大方縣的IOg植煙土樣于90mL帶有玻璃珠的無(wú)菌水中，搖床上160rpm振蕩20min,靜置5min,吸取土壤懸浮液用無(wú)菌水逐級(jí)梯度稀釋。吸取0.1mL稀釋液涂布牛肉膏蛋白胨平板，37°C倒置培養(yǎng)36h，待平板長(zhǎng)出菌落后，挑取單菌落純化，編號(hào)保存，待測(cè)。(2)拮抗細(xì)菌的篩選:采用平板對(duì)峙法，倒好燕麥培養(yǎng)基平板，用5mm打孔器打取10% V8汁培養(yǎng)基上的疫霉菌絲塊放在平板中央，在其周?chē)嚯x2.5cm處對(duì)稱接種待測(cè)菌株，以不接菌體的平板為對(duì)照。重復(fù)三次，在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，觀察到有一株細(xì)菌周?chē)a(chǎn)生了明顯的抑菌圈，對(duì)煙草疫霉有明顯的拮抗效果，挑出此細(xì)菌菌株，將之編號(hào)為1205。(3)拮抗菌的鑒定:將1205菌株點(diǎn)接在普通瓊脂平板上，37 °C，培養(yǎng)36 h，菌落近圓形，灰白色，不透明，菌落大，3-7mm,邊緣不整齊呈擴(kuò)展?fàn)?，表面粗糙顆粒狀似毛玻璃狀或蠟狀，不分泌色素；為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，桿狀，1.0 1.3 X 3.0 5.0 μ m，成鏈，運(yùn)動(dòng)性，芽孢橢圓形，端生或次端生，芽孢膨大不明顯；能耐受7%NaCl的培養(yǎng)，接觸酶陽(yáng)性、葡萄糖發(fā)酵陽(yáng)性、淀粉水解陽(yáng)性、硝酸鹽還原陽(yáng)性、明膠液化陽(yáng)性、麥芽糖發(fā)酵陽(yáng)性、半固體穿刺試驗(yàn)陽(yáng)性、酪素水解陽(yáng)性、VP試驗(yàn)陰性、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陰性、吲哚實(shí)驗(yàn)陰性、蔗糖發(fā)酵陰性、乳糖發(fā)酵陰性、甘露醇水解陰性。參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)、《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《芽孢桿菌屬》，初步鑒定為芽孢桿菌屬。將1205菌株接種于牛肉膏蛋白 胨液體培養(yǎng)基中，160rpm 28°C培養(yǎng)12h，離心收集菌體。采用上海生工Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(細(xì)菌)提取基因組DNA。以提取到的DNA為模板，用正向引物
16SF(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)
和反向引物16SR(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)對(duì)菌株的16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 條件為:94°C 3min ；94°C 45s，54°C 30s, 72°C lmin，25 個(gè)循環(huán)；72°C終延伸 5min，4°C停止。PCR產(chǎn)物送由上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，長(zhǎng)度為1468bp。測(cè)序結(jié)果在GenBank中與cerews相似性為97%。綜合菌落形態(tài)、生理生化及分子鑒定,將這一菌株記為臘樣芽抱桿菌cereus 1205)。蠟樣芽孢桿菌菌株1205抑制煙草疫霉方面的應(yīng)用:
(I)將活化的1205菌株挑一環(huán)接入NYBD培養(yǎng)液(牛肉膏Sg，酵母膏5g，葡萄糖10g，水lL，pH自然，121°C，滅菌45min)中，160rpm 28°C培養(yǎng)48h，作為拮抗效果測(cè)定的發(fā)酵液。采用平板對(duì)峙法，倒好燕麥培養(yǎng)基(燕麥片30g，加入IOL蒸餾水，100°C水浴約lh，8層紗布過(guò)濾去渣，再加蒸餾水補(bǔ)足1L，瓊脂18g，pH自然，121°C，滅菌30min)平板，用5mm打孔器打取疫霉菌絲塊放在平板中央，在其周?chē)嚯x2.5cm處對(duì)稱放置三個(gè)浸泡過(guò)臘樣芽孢桿菌cereus 1205)發(fā)酵液的濾紙片(直徑為5mm),以不加發(fā)酵液的為對(duì)照，重復(fù)三次，在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，1205對(duì)煙草黑脛病菌的抑菌圈直徑達(dá)到了20.5mmο
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有明顯的有益效果，從以上技術(shù)方案可知:本發(fā)明的蠟樣芽孢桿菌(feci77心cereus 1205)來(lái)源可靠，對(duì)溫度、pH等自然環(huán)境條件的適應(yīng)范圍廣，對(duì)不良環(huán)境的耐受力強(qiáng)，能維持生態(tài)平衡，能適應(yīng)病害生態(tài)系統(tǒng)，容易培養(yǎng)和保存，抑制煙草疫霉效果好，在農(nóng)業(yè)方面有很大的應(yīng)用前景。該技術(shù)路線合理，可為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的中試數(shù)據(jù)和設(shè)計(jì)依據(jù)，實(shí)現(xiàn)液體發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)臘樣芽孢桿菌{Bacillus cereus1205)，為開(kāi)發(fā)相關(guān)生物制劑及大田推廣奠定基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式對(duì)煙草疫霉有抑制作用的蠟樣芽孢桿菌1205 (.Bacillus cereus 1205)的分離步驟:
(I)供試菌株:煙草黑胚病病原菌-煙草疫霉從ora flicoiiaaae),貴州大
學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室分離、篩選、鑒定、保存。(2)拮抗菌的分離與純化:稱取采自貴州省畢節(jié)市大方縣的IOg植煙土樣于90mL帶有玻璃珠的無(wú)菌水中，搖床上160rpm振蕩20min,靜置5min,吸取土壤懸浮液用無(wú)菌水逐級(jí)梯度稀釋。吸取0.1mL稀釋液涂布牛肉膏蛋白胨(牛肉膏5.0 g,蛋白胨10.0g, NaCl5.0g,瓊脂20g,水1L，ρΗ7.2，121。。，滅菌45min)平板，37°C倒置培養(yǎng)36h，待平板長(zhǎng)出菌落后，挑取單菌落純化，編號(hào)保存，待測(cè)。(3)拮抗細(xì)菌的篩選:米用平板對(duì)峙法，倒好燕麥培養(yǎng)基(燕麥片30g,加入IL蒸餾水，100°C水浴約lh，8層紗布過(guò)濾去渣，再加蒸餾水補(bǔ)足1L，瓊脂18g，pH自然，121°C，滅菌30min)平板，用5mm打孔器打取10%V8培養(yǎng)基(IOmL V8加去離子水90 mL, CaCO3 0.02g,瓊脂2g，pH自然，121°C，滅菌30min)上的疫霉菌絲塊放在平板中央，在其周?chē)嚯x2.5cm處對(duì)稱接種待測(cè)菌株，以不接菌體的平板為對(duì)照。重復(fù)三次，在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，觀察到有一株細(xì)菌對(duì)煙草疫霉有明顯的拮抗效果，將這株細(xì)菌編號(hào)為1205。 將活化的1205菌株挑一環(huán)接入NYBD培養(yǎng)液(牛肉膏Sg，酵母膏5g，葡萄糖10g，水1L，pH自然，121°C，滅菌45min)中，160rpm, 28°C培養(yǎng)48h，作為拮抗效果測(cè)定的發(fā)酵液。采用平板對(duì)峙法，倒好燕麥培養(yǎng)基平板，用5_打孔器打取疫霉菌絲塊放在平板中央，在其周?chē)嚯x2.5cm處對(duì)稱放置三個(gè)浸泡過(guò)1205發(fā)酵液的濾紙片(直徑為5mm)，以不加發(fā)酵液的為對(duì)照，重復(fù)三次，在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，1205對(duì)煙草疫霉的抑菌圈直徑達(dá)到了 20.5mm。同時(shí)，挑取菌落邊緣和抑菌帶接觸部位的菌絲制片，顯微觀察到煙草疫霉菌絲溶解，斷裂，原生質(zhì)凝結(jié)現(xiàn)象。拮抗菌的鑒定:1205在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上，37 °C，培養(yǎng)36 h，菌落近圓形，灰白色，不透明，菌落大，3-7mm,邊緣不整齊呈擴(kuò)展?fàn)?，表面粗糙顆粒狀似毛玻璃狀或蠟狀，不分泌色素；為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，桿狀，1.0 1.3 X 3.0 5.0 μ m，成鏈，運(yùn)動(dòng)性，芽孢橢圓形，端生或次端生，芽孢膨大不明顯；能耐受7%NaCl的培養(yǎng)，接觸酶陽(yáng)性、葡萄糖發(fā)酵陽(yáng)性、淀粉水解陽(yáng)性、硝酸鹽還原陽(yáng)性、明膠液 化陽(yáng)性、麥芽糖發(fā)酵陽(yáng)性、半固體穿刺試驗(yàn)陽(yáng)性、酪素水解陽(yáng)性、VP試驗(yàn)陰性、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陰性、吲哚實(shí)驗(yàn)陰性、蔗糖發(fā)酵陰性、乳糖發(fā)酵陰性、甘露醇水解陰性。參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)、《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《芽抱桿囷屬》，初步鑒定為牙抱桿囷屬。
將1205菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0g, NaCl5.0gjJClL，pH7.2)*，160rpm 28°C培養(yǎng)12h，離心收集菌體。采用上海生工Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(細(xì)菌)提取基因組DNA。以提取到的DNA為模板，用正向引物
16SF(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)
和反向引物16SR(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)對(duì)菌株的16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 條件為:94°C 3min ；94°C 45s，54°C 30s, 72°C lmin，25 個(gè)循環(huán)；72°C終延伸 5min，4°C停止。PCR產(chǎn)物送由上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，長(zhǎng)度為1468bp。測(cè)序結(jié)果在GenBank中與cerews相似性為97%。因此,綜合菌落形態(tài)、生理生化及分子鑒定，將這一菌株記為臘樣芽抱桿菌cereus 1205)。通過(guò)對(duì)抑菌試驗(yàn)來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的臘樣芽孢桿菌(ifeci77i/5.cereus 1205)的抑制煙草疫霉的用途:
(I)發(fā)酵液的制備:
將活化蠟樣芽孢桿菌(Mcillus cereus 1205 )菌株挑一環(huán)接入NYBD培養(yǎng)液(牛肉膏8g，酵母膏 5g，葡萄糖 10g, 7jC lL，pH7.2，121°C，滅菌 45min)中，160rpm 28°C培養(yǎng) 12h，作為種子液。按3%接種量將1205種子液接入裝有50ml NYBD發(fā)酵培養(yǎng)液的250ml培養(yǎng)瓶中，280C，160rpm,搖瓶培養(yǎng)48h，得拮抗菌發(fā)酵液。(2)用無(wú)菌的圓濾紙片(直徑5_)，吸取發(fā)酵液在酒精燈前略微干燥，輕輕放在接種煙草疫霉的燕麥平板(燕麥片30g，加入IL蒸餾水，100°C水浴約lh，8層紗布過(guò)濾去渣，再加蒸餾水補(bǔ)足1L，瓊脂18g，pH自然，121 °C，滅菌30min)上，倒置于28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，1205對(duì)煙草疫霉的抑菌圈直徑達(dá)到20.5 mm。
權(quán)利要求
1.一種臘樣芽孢桿菌1205 {Bacillus cereus 1205),其特征在于所述菌種的保藏號(hào)為 CCTCC NO: M2012382。
2.按權(quán)利要求1所述的蠟 樣芽孢桿菌1205在抑制煙草疫霉方面的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種蠟樣芽孢桿菌菌株(Bacilluscereus1205)及其用途，其形態(tài)特征1205菌株在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃，培養(yǎng)36h，菌落近圓形，灰白色，不透明，菌落大，3-7mm，邊緣不整齊呈擴(kuò)展?fàn)睿砻娲植陬w粒狀似毛玻璃狀或蠟狀，不分泌色素；為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，桿狀，1.0～1.3×3.0～5.0μm，成鏈，運(yùn)動(dòng)性，芽孢橢圓形，端生或次端生，芽孢膨大不明顯；能耐受7%NaCl的培養(yǎng)。本發(fā)明具有抗逆性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、較穩(wěn)定、易于定殖，對(duì)光和紫外穩(wěn)定，易產(chǎn)業(yè)化、成本較低、儲(chǔ)存期長(zhǎng)、易于施用等特點(diǎn)，且對(duì)煙草有一定的促生長(zhǎng)作用。
文檔編號(hào)C12N1/20GK103087944SQ201210521818
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2012年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月7日
發(fā)明者張傳萍, 李祝, 葛永怡, 黃化剛, 申燕, 胡瑋, 高冬冬, 張龍林 申請(qǐng)人:貴州省煙草公司畢節(jié)市公司, 貴州大學(xué)