一種蠟樣芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蠟樣芽孢桿菌及其應(yīng)用，而提供一種能夠同時(shí)分泌兩種分子量類型的膠原酶的蠟樣芽孢桿菌及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的蠟樣芽孢桿菌為Bacillus?cereus，保藏編號為CGMCC?NO.8614，所產(chǎn)生的酶液中包含兩種分子量不同的膠原酶，即分子量為106kDa的膠原酶Ⅰ和分子量為95kDa的膠原酶Ⅱ。本發(fā)明的蠟樣芽孢桿菌能夠分泌兩種分子量類型的膠原酶，能夠高效降解魚鱗、魚皮、魚骨、牛骨、豬皮中的膠原蛋白或明膠，有利于農(nóng)副產(chǎn)品的開發(fā)利用、水產(chǎn)品加工、環(huán)境污染治理、醫(yī)療以及食品工業(yè)開發(fā)。同時(shí)，有利于作為復(fù)合酶制劑應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，可大大提高原料的利用率，擴(kuò)大了微生物膠原酶的應(yīng)用領(lǐng)域。
【專利說明】一種蠟樣芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地說是涉及一種蠟樣芽孢桿菌及其在降解膠原蛋白或明膠方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]膠原酶的化學(xué)名為膠原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理pH和溫度條件下特異性地降解天然膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)，而不損傷其它蛋白質(zhì)和組織。
[0003]膠原酶廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)以及工業(yè)生產(chǎn)上。例如，目前臨床上應(yīng)用最廣泛的藥用膠原酶是指從溶組織梭狀芽孢桿菌的發(fā)酵液中提取、純化并精制而得的白色或類白色無菌凍干粉針生物制劑。膠原酶可使創(chuàng)口邊緣膠原纖維降解，具有較好的清創(chuàng)作用，繼而促使肉芽生長，上皮化，加快傷口愈合且對正常血管和神經(jīng)組織無損傷作用。在臨床上主要用于嚴(yán)重(I1-1II度)燒傷的清創(chuàng)、脫痂和植皮，亦可用于皮膚潰瘍、褥瘡等，治療確切，安全可靠。此外，在工業(yè)方面，膠原酶也被廣泛的應(yīng)用于皮革工業(yè)的脫毛及軟化過程，代替了傳統(tǒng)的浸灰方法，既節(jié)省時(shí)間，又改善勞動衛(wèi)生條件，且對環(huán)境危害小。同時(shí)，膠原酶還被廣泛應(yīng)用于蠶絲脫膠，肉類嫩化及酒類澄清等過程。
[0004]目前已研究的膠原酶以動物基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)為主，細(xì)菌來源的膠原酶較少，最早研究的微生物來源膠原酶是溶組織梭狀芽孢桿菌膠原酶，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床。細(xì)菌來源膠原酶與動物膠原酶不同之處主要在于:(I)底物種類不同:微生物膠原酶底物范圍更為廣泛，對動物膠原酶不能降解的IV、V型膠原也能輕易降解；(2)裂解方式不同:一般微生物膠原酶可作用于膠原的多個(gè)位點(diǎn)，產(chǎn)生小分子短肽或氨基酸，而動物膠原酶只作用于膠原N端3/4處Gly-Lue或Gly-1le肽鍵，產(chǎn)生一個(gè)3/4片段和1/4片段，分別命名為TCA(Tropocollagen “A，，fragment)和 TCB(Tropocollagen “B，，fragment) ； (3)獲得的難易不同:微生物膠原酶絕大多數(shù)可分泌到胞外，通過發(fā)酵培養(yǎng)可大量獲得，而動物膠原酶需要進(jìn)行組織培養(yǎng)和提取，較難獲得；(4)潛在的降解膠原能力不同:微生物膠原酶具有更高的降解活性。因而，微生物來源的膠原酶具有更廣的應(yīng)用價(jià)值。
[0005]目前，利用生物技術(shù)途徑篩選具有膠原酶活性的微生物已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前已發(fā)現(xiàn)的分泌膠原酶的微生物具有多樣性的特點(diǎn)，比如從深海到土壤，從需氧到厭氧，從細(xì)菌到真菌等等。
[0006]我國在微生物膠原酶方面的研究與應(yīng)用還處于剛起步階段，國內(nèi)市場依賴大量高價(jià)進(jìn)口膠原酶產(chǎn)品，限制了微生物膠原酶的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，提供一種能夠同時(shí)分泌兩種分子量類型的膠原酶的蠟樣芽孢桿菌。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種蠟樣芽孢桿菌在生產(chǎn)膠原酶及降解膠原蛋白或明膠方面的應(yīng)用。[0009]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用蠟樣芽孢桿菌降解膠原蛋白或明膠的方法。
[0010]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案是:
[0011]—種臘樣芽孢桿菌，拉丁文名稱為Bacillus cereus,其保藏編號為:CGMCCN0.8614。
[0012]一種所述蠟樣芽孢桿菌在生產(chǎn)含有膠原酶的酶液方面的應(yīng)用，所得含有膠原酶的酶液中包含兩種分子量不同的膠原酶，即分子量為106kDa的膠原酶I和分子量為95kDa的膠原酶II。
[0013]一種所產(chǎn)含有膠原酶的酶液在降解膠原蛋白和明膠方面的應(yīng)用。
[0014]一種利用蠟樣芽孢桿菌降解膠原蛋白或明膠的方法，包括下述步驟:
[0015](I)將權(quán)利要求1所述的蠟樣芽孢桿菌使用LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，然后離心除去菌體，得到粗酶液；在冰浴條件下向粗酶液中加入硫酸銨粉末，沉淀所得粗酶液中的蛋白，得到沉淀物；所得沉淀物用PH值為7.5的Tris-HCl緩沖液復(fù)溶，所得復(fù)溶溶液用pH值為7.5的Tris-HCl緩沖液在4°C條件下透析，透析后得到濃縮酶液；
[0016](2)將含膠原蛋白和/或明膠的溶液與步驟(1)所得濃縮酶液混合后于37°C水浴條件下降解膠原蛋白和/或明膠。
[0017]所述含有膠原蛋白和/或明膠的溶液為魚鱗或魚皮或魚骨或牛骨或豬皮的提取液。 [0018]所述魚鱗的提取液通過下述方法得到:
[0019](I)將干燥的魚鱗浸于HCl溶液中在室溫下攪拌脫鈣；再將脫鈣后的魚鱗浸于Na2CO3溶液中，在室溫條件下攪拌，使膠原蛋白中的膠原纖維的致密結(jié)構(gòu)變疏松；最后，用蒸餾水將魚鱗反復(fù)漂洗至中性；
[0020](2)將漂洗至中性的魚鱗與蒸餾水混合，在壓力為102.9kPa，溫度為121°C條件下提取15-20min ;待提取液冷卻至室溫后，在室溫下離心去除提取液中的雜質(zhì)，所得上清液即為魚鱗的提取液。
[0021]所述魚鱗的脫鈣的方法為:將清洗后干燥的魚鱗浸于0.5mol/L的HCl溶液中在室溫條件下攪拌脫鈣2-4h。
[0022]含有膠原蛋白或明膠的提取液與濃縮酶液等體積混合。
[0023]所述魚皮、魚骨、牛骨或豬皮的提取液的制備方法為:將魚皮、魚骨、牛骨或豬皮作為原材料除去雜質(zhì)后用電熱鼓風(fēng)干燥箱充分干燥；將每4g干燥后的原材料與IOOmL超純水混合，在壓力為102.9kPa，溫度為121°C條件下提取15_20min ;待提取體系冷卻至室溫后，在室溫下離心去除原材料提取液中的雜質(zhì)，所得上清液即分別為魚皮、魚骨、牛骨或豬皮的提取液。
[0024]蠟樣芽孢桿菌在LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)時(shí)間為24h ；Tris-HCl緩沖液濃度為50mmol/L，按照每Img沉淀用5mL Tris-HCl緩沖液的比例復(fù)溶沉淀。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0026]1、本發(fā)明的蠟樣芽孢桿菌為一種新的膠原酶產(chǎn)生菌，能夠分泌產(chǎn)生包含兩種分子量類型的膠原酶，即膠原酶I和膠原酶II。一株細(xì)菌同時(shí)分泌兩種具有膠原蛋白以及明膠降解能力的膠原酶，有利于作為復(fù)合酶制劑應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，可大大提高原料的利用率，減少了生產(chǎn)工序，從而降低了生產(chǎn)成本，擴(kuò)大了微生物膠原酶的應(yīng)用領(lǐng)域。[0027]2、本發(fā)明的蠟樣芽孢桿菌能夠分泌兩種分子量類型的膠原酶，能夠高效降解魚鱗、魚皮、魚骨、牛骨、豬皮中的膠原蛋白或明膠，有利于農(nóng)副產(chǎn)品的開發(fā)利用、水產(chǎn)品加工、環(huán)境污染治理、醫(yī)療以及食品工業(yè)開發(fā)。
[0028]3、本發(fā)明的利用蠟樣芽孢桿菌降解魚鱗、魚皮、魚骨、牛骨、豬皮中膠原蛋白的方法工藝過程簡單，效果明顯，實(shí)用性強(qiáng)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1所示為本發(fā)明菌株蠟樣芽孢桿菌R75E在5% (W/V)脫脂奶粉平板培養(yǎng)后的結(jié)果圖；
[0030]圖2所示為本發(fā)明菌株蠟樣芽孢桿菌R75E16SrDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖；圖中:M為DNA標(biāo)準(zhǔn)；1為16S rDNA擴(kuò)增片段；
[0031]圖3所示為本發(fā)明菌株蠟樣芽孢桿菌R75E粗酶液的膠原蛋白酶譜圖；圖中-M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1為粗酶液；
[0032]圖4所示為本發(fā)明菌株蠟樣芽孢桿菌R75E粗酶液明膠酶譜圖；圖中:M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1為粗酶液；
[0033]圖5所示為本發(fā)明菌株蠟樣芽孢桿菌R75E粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀復(fù)溶后所得濃縮酶液的銀染結(jié)果，圖中:M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1、2均為濃縮酶液；
[0034]圖6為本發(fā)明菌株蠟樣芽孢桿菌R75E濃縮酶液對草魚魚鱗中I型膠原蛋白的降解的SDS-PAGE電泳圖；圖 中:M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1為未經(jīng)濃縮酶液處理的草魚魚鱗膠原蛋白；2為濃縮酶液與草魚魚鱗中I型膠原蛋白的反應(yīng)產(chǎn)物；3_10分別為濃縮酶液稀釋2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍后與草魚魚鱗中I型膠原蛋白的反應(yīng)產(chǎn)物；
[0035]圖7所示為本發(fā)明菌株蠟樣芽孢桿菌R75E濃縮酶液對草魚魚鱗中總膠原蛋白的降解的SDS-PAGE電泳圖；圖中:M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1為未經(jīng)濃縮酶液處理的草魚魚鱗膠原蛋白；2為經(jīng)濃縮酶液降解后草魚魚鱗膠原蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0036]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0037]本發(fā)明的實(shí)施例中所用培養(yǎng)基及溶液的配置如下:
[0038]5%脫脂奶粉平板的配制方法:在90mL TS溶液中加入5g脫脂奶粉、0.5%酵母提取物以及I %瓊脂，用上述TS溶液定容至IOOmL,于115°C高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌15min后倒平板，冷卻后備用。所述TS溶液中含50mmol/L Tris-HCl緩沖液，150mmol/L NaCl，pH值為 8.0。
[0039]LB液體培養(yǎng)基的配制方法:在90mL去離子水中加入胰蛋白胨lg、酵母提取物0.5g、NaCllg,用5mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0,用去離子水定容至IOOmL,于121°C高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20min后冷卻待用。
[0040]LB固體培養(yǎng)平板的配制方法:在90mL去離子水中加入胰蛋白胨lg、酵母提取物0.5g、NaCllg、瓊脂lg，用5mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0，用去離子水定容至IOOmL,于121。。高壓蒸汽鍋中滅菌20min后倒平板，冷卻后備用。
[0041]5 X 上樣緩沖液:250mmol/L Tris-HCl 緩沖液(ρΗ6.8)，內(nèi)含 0.5% (V/V)溴酚蘭，50% (V/V)甘油，10% (W/V)十二烷基硫酸鈉，5% (V/V) β-巰基乙醇組成。
[0042]洗脫液:50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.6)，內(nèi)含2.5% (V/V)聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、5mmol/L CaCl20
[0043]漂洗液:50mmol/LTris-HCl 緩沖液(ρΗ7.6)，內(nèi)含 5mmol/L CaCl20
[0044]孵育液:50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.6)，內(nèi)含0.02 %十二烷基聚乙二醇醚(Brij)、200mmol/L NaCl、5mmol/L CaCl20
[0045]考馬斯亮藍(lán)染色液:考馬斯亮藍(lán)R-2501.0g溶于450mL甲醇與冰醋酸IOOmL的混合溶液后用蒸餾水定容至1L。
[0046]脫色液:IOOmL無水甲醇和IOOmL冰乙酸混合后用蒸懼水定容至1L。
[0047]本發(fā)明所用的分離膠和濃縮膠的濃度是指丙烯酰胺的濃度。
[0048]實(shí)施例1:具有蛋白降解活性的蠟樣芽孢桿菌R75E的分離純化
[0049](I)取ImL采集的人初乳用無菌超純水稀釋100倍后取200 μ L稀釋液均勻涂布于5 %脫脂奶粉平板上，于37 °C培養(yǎng)12h，獲得菌落周圍具有明顯透明圈的菌落。將涂布獲得的菌落用牙簽挑取分離，于5%脫脂奶粉平板上進(jìn)行多次劃線培養(yǎng)，每次培養(yǎng)條件均為37°C、12h，獲得具有最佳蛋白降解效果的菌株，將其命名為R75E。R75E菌株在5%脫脂奶粉平板上37°C培養(yǎng)12h后的結(jié)果如圖1所示，從圖1中可以看出，在5%脫脂奶粉平板上菌株R75E的單菌落周圍出現(xiàn)明顯透明圈，經(jīng)測量發(fā)現(xiàn)菌落直徑大小約為3mm，透明圈直徑約8mm ο
[0050](2)從步驟⑴中的5%脫脂奶粉平板上挑取菌株R75E的單菌落，分別接種至兩管5mL LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37°C，150r/min，培養(yǎng)12h。培養(yǎng)結(jié)束后于1.5mL無菌離心管分別加入0.8mL菌液和0.2mL滅過菌的濃度為80%的甘油溶液，混合均勻后可長期保存于_80°C冰箱中。
[0051 ] 實(shí)施例2蠟樣芽孢桿菌R75E的鑒定
[0052](I)細(xì)菌的形態(tài)特征
[0053]菌落形態(tài):將實(shí)施例1中得到的具有最佳蛋白降解效果的菌株R75E于37°C下在LB固體培養(yǎng)平板上劃線培養(yǎng)生長12h后，菌落為灰白色，不透明，邊緣不整齊、表面較粗糙，似融蠟狀，菌落較大，約3mm。細(xì)菌形態(tài):菌體細(xì)胞呈桿狀，菌體兩端較平整，多數(shù)呈鏈狀排列。芽胞呈橢圓形，多位于菌體中央或稍偏于一端。菌體大小:通過光學(xué)顯微鏡利用其目鏡測微尺與鏡臺測微尺對菌株R75E單個(gè)細(xì)胞的大小進(jìn)行測量，通過測量可知單個(gè)細(xì)胞寬約為1-2 μ m，長約為3-5 μ m。細(xì)菌好氧性觀察:挑取實(shí)施例1中菌株R75E的單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，試管密封，于37°C，培養(yǎng)15h。如果細(xì)菌分布于整個(gè)溶液中，則是兼性厭氧菌；如果主要分布于培養(yǎng)液表面而內(nèi)部幾乎無菌，則是好氧菌。菌株R75E在LB液體培養(yǎng)基中密封培養(yǎng)后，澄清透明的LB液體培養(yǎng)基變渾濁，細(xì)菌分布于整個(gè)溶液，表明R75E菌株為兼性厭氧菌。
[0054](2)菌株R75E的16S rDNA序列分析
[0055]根據(jù)細(xì)菌基因組16S rDNA的保守序列設(shè)計(jì)用于PCR鑒定的引物對，如SEQID No:l 所示的引物 Pl (5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和 SEQ ID No:2 所示的引物P2 (5-CTACGGCTACCTTGTTACGACT-3)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
[0056]用無菌牙簽挑取實(shí)施例1中所得菌株R75E的單菌落于100 μ I無菌水充分混勻，獲得菌懸液即為擴(kuò)增16S rDNA片段的模板。50 μ L菌落PCR反應(yīng)體系中各成分如下:
[0057]
【權(quán)利要求】
1.一種臘樣芽孢桿菌，拉丁文名稱為Bacillus cereus,其保藏編號為:CGMCCN0.8614。
2.—種權(quán)利要求1所述的蠟樣芽孢桿菌在生產(chǎn)含有膠原酶的酶液方面的應(yīng)用，所得含有膠原酶的酶液中包含兩種分子量不同的膠原酶，即分子量為106kDa的膠原酶I和分子量為95kDa的膠原酶II。
3.—種權(quán)利要求2所產(chǎn)含有膠原酶的酶液在降解膠原蛋白和明膠方面的應(yīng)用。
4.一種利用權(quán)利要求1所述的蠟樣芽孢桿菌降解膠原蛋白或明膠的方法，其特征在于，包括下述步驟: (1)將權(quán)利要求1所述的蠟樣芽孢桿菌使用LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，然后離心除去菌體，得到粗酶液；在冰浴條件下向粗酶液中加入硫酸銨粉末，沉淀所得粗酶液中的蛋白，得到沉淀物；所得沉淀物用PH值為7.5的Tris-HCl緩沖液復(fù)溶，所得復(fù)溶溶液用pH值為7.5的Tris-HCl緩沖液在4°C條件下透析，透析后得到濃縮酶液； (2)將含膠原蛋白和/或明膠的溶液與步驟(1)所得濃縮酶液混合后于37°C水浴條件下降解膠原蛋白和/或明膠。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用蠟樣芽孢桿菌降解膠原蛋白或明膠的方法，其特征在于，所述含有膠原蛋白和/或明膠的溶液為魚鱗或魚皮或魚骨或牛骨或豬皮的提取液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用蠟樣芽孢桿菌降解膠原蛋白或明膠的方法，其特征在于，所述魚鱗的提取液通過下述方法得到: (1)將干燥的魚鱗浸于HCl溶液中在室溫下攪拌脫鈣；再將脫鈣后的魚鱗浸于Na2CO3溶液中，在室溫條件下攪拌，使膠原蛋白中的膠原纖維的致密結(jié)構(gòu)變疏松；最后，用蒸餾水將魚鱗反復(fù)漂洗至中性； (2)將漂洗至中性的魚鱗與蒸餾水混合，在壓力為102.9kPa，溫度為121°C條件下提取15-20min;待提取液冷卻至室溫后，在室溫下離心去除提取液中的雜質(zhì)，所得上清液即為魚鱗的提取液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用蠟樣芽孢桿菌降解膠原蛋白或明膠的方法，其特征在于，所述魚鱗的脫鈣的方法為:將清洗后干燥的魚鱗浸于0.5mol/L的HCl溶液中在室溫條件下攪拌脫鈣2-4h。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用蠟樣芽孢桿菌降解膠原蛋白或明膠的方法，其特征在于，含有膠原蛋白或明膠的提取液與濃縮酶液等體積混合。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用蠟樣芽孢桿菌降解膠原蛋白或明膠的方法，其特征在于，所述魚皮、魚骨、牛骨或豬皮的提取液的制備方法為:將魚皮、魚骨、牛骨或豬皮作為原材料除去雜質(zhì)后用電熱鼓風(fēng)干燥箱充分干燥；將每4g干燥后的原材料與IOOmL超純水混合，在壓力為102.9kPa，溫度為121°C條件下提取15_20min ;待提取體系冷卻至室溫后，在室溫下離心去除原材料提取液中的雜質(zhì)，所得上清液即分別為魚皮、魚骨、牛骨或豬皮的提取液。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一項(xiàng)所述的利用蠟樣芽孢桿菌降解膠原蛋白或明膠的方法，其特征在于，蠟樣芽孢桿菌在LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)時(shí)間為24h ；Tris-HCl緩沖液濃度為50mmol/L，按照每Img沉淀用5mL Tris-HCl緩沖液的比例復(fù)溶沉淀。
【文檔編號】C12R1/085GK104017761SQ201410283436
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月23日
【發(fā)明者】阮海華, 張西軒, 王素英, 李曄 申請人:天津商業(yè)大學(xué)