專利名稱：一株產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生有機(jī)酸、各種消化酶及乳酸菌素，畜禽飼料中添加乳酸菌類益生素能有效降低胃腸道內(nèi)的PH，抑制病原菌的生長，提高飼料報(bào)酬，增強(qiáng)畜禽免疫力。近年來乳酸菌類益生素的研究越來越深入。但是，一般乳酸菌的營養(yǎng)要求較高，對(duì)不良環(huán)境的抵抗力差，特別是抗干燥、抗高溫、抗胃酸和膽汁的能力較弱，因此，能活著進(jìn)入腸道的乳酸菌種類和數(shù)量為數(shù)不多。普通的乳酸菌對(duì)環(huán)境耐受性差影響了乳酸菌的應(yīng)用，它不耐高溫，在高溫制粒的過程中存活率極低，因此在飼喂顆粒料的生產(chǎn)應(yīng)用中受到了很大的限制。產(chǎn)酸芽孢桿菌是優(yōu)選出能產(chǎn)乳酸的芽孢菌，兼具乳酸菌和芽孢菌的優(yōu)勢(shì)，可作為一種新型的微生物添加劑開發(fā)和應(yīng)用。國內(nèi)最早報(bào)道的產(chǎn)酸芽孢菌是1996年王艷萍等篩選的一株名為TQ33的菌株，后來鑒定TQ33為凝結(jié)芽孢桿菌，隨后對(duì)產(chǎn)酸芽孢菌的研究慢慢展開。蘇勇等O006)研究表明產(chǎn)酸芽孢菌Sl能提高斷奶后仔豬空腸和結(jié)腸食糜中乳酸菌與大腸桿菌的數(shù)量比值，而乳酸菌所占比例的提高能夠預(yù)防仔豬腹瀉；研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酸芽孢菌對(duì)哺乳仔豬黃白痢有良好的預(yù)防效果，連續(xù)灌服3d產(chǎn)酸芽孢菌制劑對(duì)乳豬黃白痢的預(yù)防率可達(dá)到99. 5% ；在仔豬出生時(shí)即投喂產(chǎn)酸芽孢菌TPY-211 口服液，對(duì)防治7日齡內(nèi)仔豬腹瀉有明顯效果(P < 0. 01)。另外，產(chǎn)酸芽孢菌在肉雞上的試驗(yàn)也取得了良好的效果，產(chǎn)酸芽孢菌制劑能提高AA肉雞生產(chǎn)性能，顯著提高21 42日齡黃羽肉雞平均日采食量、平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，同時(shí)可增強(qiáng)試驗(yàn)組肉雞的免疫性能。不僅如此，產(chǎn)酸芽孢菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用越來越受歡迎，魚蝦顆粒料對(duì)制粒條件的要求更加嚴(yán)格，普通的乳酸菌制劑根本不可能成活，因此開發(fā)可以產(chǎn)乳酸的芽孢菌不僅能承受高溫高壓的制粒過程，發(fā)揮芽孢菌的優(yōu)勢(shì)，并且被魚蝦采食后，可以發(fā)揮乳酸菌的優(yōu)勢(shì)，起到調(diào)節(jié)胃腸PH，提高飼料報(bào)酬， 增強(qiáng)免疫力的作用。由上可見，篩選具有產(chǎn)酸能力的芽孢菌不僅具有乳酸菌的優(yōu)勢(shì)，而且在發(fā)酵后期可以產(chǎn)生芽孢，可以很好地耐受高溫、高壓的制粒過程，提高存活率。目前所報(bào)道的產(chǎn)酸芽孢菌多為凝結(jié)芽孢桿菌，尚未見到有產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明經(jīng)篩選得到了一株產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌及其應(yīng)用，為開發(fā)肉禽及水產(chǎn)專用益生素提供了平臺(tái)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一株產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌，該菌株命名為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，已于 2011年10月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC M 2011352。所述菌株的菌學(xué)特征為菌落為圓形或近似圓形，呈無色素的白色，菌體細(xì)胞桿狀，成短或長鏈，培養(yǎng)48h，菌落不透明，直徑可達(dá)10mm，表面粗糙，邊緣不整齊，平鋪似毛玻璃狀。產(chǎn)芽孢，中生，革蘭氏陽性，無莢膜。所述菌株的最適培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基酵母膏0.5%，蛋白胨0.6%，葡萄糖1.0%， 磷酸氫二鉀0.5%，硫酸鎂0.02%，硫酸錳0.08% (按質(zhì)量百分?jǐn)?shù))，調(diào)pH至7. 5。最適溫度35°C，好氧。本發(fā)明還對(duì)產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌的液體工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的工藝及培養(yǎng)基做了摸索研究，經(jīng)研究，其最佳培養(yǎng)基配方如下 種子培養(yǎng)基酵母膏0. 5 %，蛋白胨0. 6 %，葡萄糖1.0%，磷酸氫二鉀0. 5 %，硫酸鎂0.02%，硫酸錳0.08% (按質(zhì)量百分?jǐn)?shù))。液體發(fā)酵培養(yǎng)基玉米粉3. 0 %，豆粉3. 2 %，麩皮2. 5 %，硫酸銨0. 8 %，硫酸鎂0. 01%，磷酸氫二鈉1%，磷酸二氫鈉0. 075%，檸檬三鈉0. 1% (按質(zhì)量百分?jǐn)?shù))。其最佳生產(chǎn)工藝流程如下(1) 一級(jí)種子斜面接種，500mL三角瓶裝量lOOmL，35°C，220rpm搖床培養(yǎng)10 16h ；接入二級(jí)種子液擴(kuò)大培養(yǎng)。(2) 二級(jí)種子5L三角瓶裝量1L，接種量6% (ν/ν)，35°C，220rpm搖床培養(yǎng)12 18h ；接入三級(jí)種子液擴(kuò)大培養(yǎng)。(3)三級(jí)種子100L 發(fā)酵罐裝量 60L，4% (ν/ν)接種，35°C，220rpm 培養(yǎng) 10 16h ； 接入發(fā)酵罐進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)條件2%接種(v/v)，35°C，220rpm培養(yǎng)沈 32h，鏡檢形成芽孢 90 %左右，放罐，噴干，獲得芽孢菌粉。所述產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌菌粉可以用于制備微生態(tài)制劑，應(yīng)用時(shí)，產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌菌粉可以單獨(dú)作為有效成分與玉米淀粉混合制成微生態(tài)制劑，或產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌菌粉與其它至少一種有效成分或菌粉以及玉米淀粉混合制成復(fù)合微生態(tài)制劑。優(yōu)選的，產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌菌粉與枯草芽孢桿菌N9-1-35菌粉、丁酸梭菌Cb-2菌粉和玉米淀粉混合制成復(fù)合微生態(tài)制劑。本發(fā)明還提供了一種復(fù)合微生態(tài)制劑M3，其是以三大耐高溫菌種枯草芽孢桿菌 N9-1-35 (已于2011年08月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為=CCTCC M2011301)、丁酸梭菌Cb-2 (已于2011年11月09日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC M 2011384)以及本發(fā)明的產(chǎn)酸芽孢菌GFl (10X 108cfu/g)及玉米淀粉混合制成，三種菌粉及玉米淀粉的質(zhì)量比為1 :2:2: 5，各菌粉的活菌數(shù)分別大于或者等于 1. OX 109cfu/g、5. OX 108cfu/g、5. OX 108cfu/g。其功能及效果如下1、可以提高飼料報(bào)酬，降低料肉比，從而降低養(yǎng)殖成本。2、可以增強(qiáng)機(jī)體的總抗氧化水平，降低各種氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的副作用。3、可以提高脾臟、法氏囊器官指數(shù)。4、可以增加免疫器官指數(shù)，提高機(jī)體內(nèi)IgG水平，增強(qiáng)機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力，從而增強(qiáng)抵抗力。具體應(yīng)用時(shí)，可以按照0. 5%。 2. 0%o (質(zhì)量比)的比例添加于飼料中。本發(fā)明的產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌，不僅具有良好的生長性能，而且在發(fā)酵終點(diǎn)能夠有效地形成芽孢。不僅具備乳酸菌的特點(diǎn)可以代謝產(chǎn)生有機(jī)酸，主要為乙酸和乳酸及少量丙酸和丁酸，而且可以形成芽孢，增強(qiáng)了其抗應(yīng)激性，能夠耐熱、耐酸、耐膽鹽，可以耐受高溫制粒、低PH和高膽鹽環(huán)境，順利通過胃和十二指腸，進(jìn)入腸道內(nèi)發(fā)揮其益生菌的作用，因此，可以用于制備復(fù)合微生態(tài)制劑M3。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，可以與部分抗生素同時(shí)使用，但為了保證本發(fā)明的菌能夠充分發(fā)揮益生素的作用，應(yīng)盡量避免與抗生素同時(shí)使用或使用時(shí)先做抑菌試驗(yàn)。另外，通過小鼠的急性毒性試驗(yàn)表明，本發(fā)明的產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌安全無毒副作用，可以放心地作為益生素在飼料中添加使用。


本發(fā)明提供的菌株命名為蠟樣芽孢桿菌GF-IBacillus cereus GF-1，已于2011年 10月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC NO =M 2011352，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。菌株枯草芽孢桿菌N9-l-35Bacillus subtilis N9-1-35，已于 2011 年 08 月 31 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC NO =M 2011301，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。菌株丁酸梭菌Cb-2Clostridium butyricum Cb_2，已于 2011 年 11 月 09 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC NO =M 2011384，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。圖1為GFl菌落融鈣圖，圖中菌落周圍透明的部分即為融鈣圈，表示產(chǎn)酸。圖2為16srDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其中，M代表marker，1禾Π 2為16S rDNA 序列的兩個(gè)重復(fù)。圖 3 為 GFl 與 GU056812. 1，GU250444. 1，F(xiàn)J665379. 1 序列對(duì)比結(jié)果示意圖。圖4為LYN3發(fā)酵液pH變化曲線圖。圖5為GFl抗生素藥敏圖，圖中，數(shù)字代表1、鹽酸林可霉素；2、硫酸粘桿菌素；3、 鹽酸土霉素；4、酒石酸泰樂菌素；5、多西環(huán)素。圖6為GFl生長曲線。圖7為各試驗(yàn)組料重比對(duì)照?qǐng)D。圖8為血清總抗氧化能力T-AOC測定結(jié)果示意圖。圖9為各試驗(yàn)組IgG水平比較。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例一產(chǎn)酸芽孢桿菌的篩選及其它研究一、產(chǎn)酸芽孢桿菌的篩選1試驗(yàn)材料1. 1分離源雞腸道、雞糞便、豬糞便、牛糞便1. 2 培養(yǎng)基1. 2. 1菌種分離用培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基酵母膏0. 5 %，蛋白胨0. 5 %，葡萄糖0.5%，磷酸氫二鉀0. 5 %，硫酸鎂0. 02%,硫酸錳0. 08%,碳酸鈣1. 5%，瓊脂1. 5%。
1. 2. 2菌種培養(yǎng)用培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基酵母膏0. 1%，蛋白胨0. 1%，葡萄糖0. 1%，磷酸二氫鉀0. 1%，硫酸鎂 0.02%，硫酸錳 0.02%，pH 7.0 7. 5。發(fā)酵培養(yǎng)基(基礎(chǔ))酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，葡萄糖0.5%，磷酸氫二鉀 0.5%，硫酸鎂0.02%，硫酸錳0. 08 %。2菌種篩選2. 1產(chǎn)酸芽孢菌分離純化方法采用菌種分離培養(yǎng)基，涂布分離，40°C培養(yǎng)48h，挑選生長速度快、周圍產(chǎn)生融鈣圈的單個(gè)菌落作為分離菌株，取一環(huán)分離菌使其分散于生理鹽水中，90°C水浴15min，再按上述方法進(jìn)行分離，選取單一菌落劃線培養(yǎng)。2. 2鑒定方法菌種鑒定采用16S rDNA保守序列的PCR鑒定法和常規(guī)生理生化檢測試驗(yàn)，16S rDNA保守序列的PCR鑒定法具體方法如下細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增的引物序列為上游5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，，下游5’ -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，， 序列由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為dNTP Mixture 4yL, 5XPrimeSTARBuffer 10 μ L，上下游引物各 0. 6 μ L，基因組模板 0. 8 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0. 6 μ L，用無菌去離子水補(bǔ)充至50 μ L。PCR循環(huán)參數(shù)為95 °C 5min ； 94°C lmin，58°C 15s，72°C 2min，30個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0將PCR反應(yīng)產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司測序，測序結(jié)果應(yīng)用DNAMar軟件下的MegAlign子軟件進(jìn)行分析。3產(chǎn)酸蠟樣芽孢菌的性能檢測3. 1菌株芽孢形成率測定發(fā)酵液中芽孢百分?jǐn)?shù)的測定將篩選得到的菌株GFl在發(fā)酵培養(yǎng)基中37°C， 220rpm培養(yǎng)48h。處理一取ImL菌液梯度稀釋法計(jì)發(fā)酵液中活菌總數(shù)；處理二 取部分菌液在沸水中加熱lOmin，然后取ImL菌液梯度稀釋法計(jì)熱處理后活菌數(shù)。計(jì)算芽孢形成率。 芽孢形成率=熱處理后活菌數(shù)/發(fā)酵液中活菌總數(shù)X 100%。3. 2菌株代謝產(chǎn)物(有機(jī)酸)分析菌株經(jīng)搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)，每隔池取發(fā)酵液5mL，直至發(fā)酵培養(yǎng)48h，繪制pH變化曲線，根據(jù)檢測結(jié)果選取發(fā)酵初期PH迅速下降的6 12h，發(fā)酵液5000rpm離心lOmin，所得上清進(jìn)行液相色譜分析有機(jī)酸的含量及組成成分。3. 3菌株應(yīng)用穩(wěn)定性的研究菌株的耐酸、耐膽鹽和耐熱性能檢測分別將GFl菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)48h，鏡檢至大部分菌體形成芽孢，未形成芽孢的菌體80°C水浴15min滅活，平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)，作為待測菌株耐受性試驗(yàn)的起始濃度，經(jīng)熱處理(80°C水浴15min)的發(fā)酵液作為待測液，備用。3. 3. 1酸耐受試驗(yàn)將液體發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH分別調(diào)節(jié)為2. 0,3. 0,4. 0,5. 0，接種lh、2h、;3h后取樣，平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)。3. 3. 2膽鹽耐受試驗(yàn)液體發(fā)酵培養(yǎng)基高壓滅菌后，加入膽鹽母液(10% )，使其膽鹽濃度分別為0. 2%, 0. 3%,0. 4%，接種0. 5h、l. 5h,2h后取樣，平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)。3. 3. 3熱穩(wěn)定性試驗(yàn)菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)48h，殘留菌體80°C水浴15min滅活處理后，設(shè)定溫度梯度為85°C、90°C、95°C，水浴15min后取樣，平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)。3. 3. 4產(chǎn)酶性能檢測分別取不同生長階段對(duì)數(shù)生長前期他、中期16h、后期24h和^h以及發(fā)酵終點(diǎn) 48h的發(fā)酵液，進(jìn)行酶活檢測。采用Folin福林酚法測定中性蛋白酶和酸性蛋白酶，采用 CMC糖化力法測定發(fā)酵液纖維素酶活力。3. 4對(duì)抗生素的敏感性試驗(yàn)選取鹽酸林可霉素、硫酸粘桿菌素、鹽酸土霉素、酒石酸泰樂菌素、多西環(huán)素五種抗生素，按推薦用量配成不同梯度溶液，管碟法測定抑菌圈直徑，其中指示菌為所分離菌株，濃度為 1. 8X108cfu/mL。4產(chǎn)酸芽孢菌液體發(fā)酵條件優(yōu)化研究產(chǎn)酸芽孢菌液體發(fā)酵中的發(fā)酵溫度、初始pH值、通風(fēng)量、發(fā)酵時(shí)間和接種量等各項(xiàng)因素對(duì)菌體產(chǎn)量和芽孢形成的影響。4.1發(fā)酵溫度的確定溫度通過影響微生物膜液晶結(jié)構(gòu)、酶和蛋白質(zhì)的合成和活性，以及RNA的結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄等影響微生物的生理活動(dòng)，對(duì)微生物的生長直接產(chǎn)生影響。分別在^°C、30°C、33°C、 35°C、37°C、40°C不同溫度下，對(duì)所篩選的菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)48h，于不同時(shí)段測定活菌數(shù)。4. 2發(fā)酵最佳初始pH測定微生物需要在一定的酸堿度的環(huán)境中才能正常的生長繁殖，pH過高或過低都會(huì)抑制微生物的生長。本試驗(yàn)分別在PH為6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0下培養(yǎng)至發(fā)酵終點(diǎn)48h，于不同時(shí)段測定活菌數(shù)。4. 3通風(fēng)量的確定供氧量的多少會(huì)直接影響菌株的生長或代謝作用。因此發(fā)酵過程中通風(fēng)量的大小直接影響菌體的生成，試驗(yàn)以裝樣量和搖床轉(zhuǎn)速為通風(fēng)量大小的代表，研究了芽孢菌在不同裝樣量(500mL三角瓶裝樣50mL、100mL、150mL、200mL)和搖床轉(zhuǎn)速(160rpm、180rpm、 200rpm、220rpm)下菌體生成量的變化。分別在35°C培養(yǎng)3 后測定菌體含量。4. 4培養(yǎng)基碳源和氮源組成配比優(yōu)化將發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源和氮源的含量上下適當(dāng)調(diào)整，將作為主要碳源的葡萄糖含量為別設(shè)為0. 75 %、1. 0 %、1. 25 %，氮源蛋白胨的含量分別設(shè)為0. 4 %、0. 6 %、0. 8 %，進(jìn)行兩因素三水平的正交試驗(yàn)，在發(fā)酵20h取發(fā)酵液測定發(fā)酵4 平板計(jì)數(shù)法記錄活菌數(shù)，同時(shí) 95°C煮15min滅活菌體，計(jì)芽孢數(shù)，確定碳源和氮源的最佳配比。5生長曲線的繪制按照發(fā)酵優(yōu)化結(jié)果，將GFl經(jīng)500mL搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)，每隔池取發(fā)酵液lmL，平板梯度稀釋法，35°C培養(yǎng)24h計(jì)菌落總數(shù)，繪制生長曲線。6動(dòng)物安全性試驗(yàn)6. 1試驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，動(dòng)物級(jí)別二級(jí)，雌雄各半共50只，體重18 22g。6. 2試驗(yàn)動(dòng)物分組與飼喂基礎(chǔ)日糧預(yù)飼1周后隨機(jī)分為5組，其中1組為對(duì)照組，其余4組為試驗(yàn)組。根據(jù)人每天大約需要5 X IO8個(gè)活菌，設(shè)定試驗(yàn)組小鼠每天服用活菌數(shù)為人每天需要量的1/5倍、1倍、5倍和10倍。將噴干菌粉稀釋后拌料、重新制粒，連續(xù)飼喂30天。試驗(yàn)區(qū)封閉、清潔級(jí)，試驗(yàn)期間觀察小鼠體態(tài)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)解剖小鼠心臟、肝臟、腎臟和脾臟，觀察有無病變。二、結(jié)果與分析2. 1菌株的分離與鑒定2. 1. 1產(chǎn)酸芽孢菌的分離從雞腸道內(nèi)容物以及雞、豬和牛新鮮糞便中分離得到25株目標(biāo)菌株，使得平板內(nèi)菌落周圍的培養(yǎng)基顏色由白色不透明變?yōu)橥该鞯S色，說明所選菌株產(chǎn)酸并將培養(yǎng)基中的碳酸鈣融解，其中菌株GFl較其它菌株發(fā)酵液生物量高，融鈣圈大(如圖1所示)，因此選擇 GFl為試驗(yàn)備選菌株。2. 1. 2產(chǎn)酸芽孢菌的分子生物學(xué)和生理生化鑒定產(chǎn)酸芽孢菌的分子生物學(xué)檢測取GFl發(fā)酵液lmL，提取總DNA，PCR擴(kuò)增16S rDNA 序列，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，在分子量大小為1400bp左右得到一條特異性好的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(如圖2所示)。將GFl菌株的16S rDNA目的片段切膠回收(TAKARA膠回收試劑盒)，送TAKARA測序，將序列測定結(jié)果(如序列表1所示)輸入GeneBank中與已知序列進(jìn)行比較，測定結(jié)果表明GFl與編號(hào)為GU056812. 1,GU250444. 1,FJ665379. 1菌株同源性為99. 4% (如圖3所示)°GFl生理生化檢測結(jié)果(如表1所示)在選擇性培養(yǎng)基上，35°C，培養(yǎng)Mh，可形成圓形或近似圓形、無色素的白色菌落，菌體細(xì)胞桿狀，成短或長鏈，培養(yǎng)48h，菌落不透明， 直徑可達(dá)10mm，表面粗糙，邊緣不整齊，平鋪似毛玻璃狀。產(chǎn)芽孢，中生，革蘭氏陽性，無莢膜。表1分離菌株的生理生化特征
權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌，其特征在于該菌株命名為蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus,已于2011年10月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC M 2011352。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌，其特征在于所述菌株的特征為菌落為圓形或近似圓形，呈無色素的白色，菌體細(xì)胞桿狀，成短或長鏈，培養(yǎng)48h，菌落不透明，直徑可達(dá)10mm，表面粗糙，邊緣不整齊，平鋪似毛玻璃狀。產(chǎn)芽孢，中生，革蘭氏陽性，無莢膜。
3.權(quán)利要求1所述的產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌在制備微生態(tài)制劑中的應(yīng)用。
4.一株產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌菌粉，其特征在于是通過培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌制備得到的。
5.權(quán)利要求4所述的產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌菌粉的制備方法，其特征在于，步驟如下(1)一級(jí)種子斜面接種，500mL三角瓶裝量100mL，35°C，220rpm搖床培養(yǎng)10 16h ； 接入二級(jí)種子液擴(kuò)大培養(yǎng)；(2)二級(jí)種子5L三角瓶裝量1L，接種量6%，35°C，220rpm搖床培養(yǎng)12 18h ；接入三級(jí)種子液擴(kuò)大培養(yǎng)；(3)三級(jí)種子100L發(fā)酵罐裝量60L，4%接種，35°C，220rpm培養(yǎng)10 16h；接入發(fā)酵罐進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)；(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)條件2%接種，351，220印111培養(yǎng)沈 3211，鏡檢形成芽孢90(%，放罐， 噴干，獲得芽孢桿菌菌粉。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中種子培養(yǎng)基的配方為酵母膏0. 5 %，蛋白胨0. 6 %，葡萄糖1.0%，磷酸氫二鉀0.5%，硫酸鎂0.02%，硫酸錳 0. 08% ；所述步驟( (3) (4)中液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為玉米粉3.0%，豆粉3.2%，麩皮2. 5 %，硫酸銨0. 8 %，硫酸鎂0. 01 %，磷酸氫二鈉1 %，磷酸二氫鈉0. 075 %，檸檬三鈉0. 1%ο
7.權(quán)利要求4所述的產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌菌粉在制備微生態(tài)制劑中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用時(shí)，產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌菌粉單獨(dú)作為有效成分與玉米淀粉混合制成微生態(tài)制劑，或產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌菌粉與其它至少一種有效成分或菌粉以及玉米淀粉混合制成復(fù)合微生態(tài)制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用時(shí)，產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌菌粉與枯草芽孢桿菌N9-1-35菌粉、丁酸梭菌Cb-2菌粉和玉米淀粉混合制成復(fù)合微生態(tài)制劑。
10.一種復(fù)合微生態(tài)制劑，其特征在于由產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌菌粉、枯草芽孢桿菌 N9-1-35菌粉、丁酸梭菌Cb-2菌粉及玉米淀粉混合制成，其中，三種菌粉及玉米淀粉的質(zhì)量比為1 2 2 5，各菌粉的活菌數(shù)分別大于或者等于1.0X109CfU/g、5.0X108CfU/g、 5. 0X108cfu/g。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌，該菌株命名為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，已于2011年10月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC M 2011352。本發(fā)明的菌株可以用于制備微生態(tài)制劑，應(yīng)用時(shí)，產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌菌粉可以單獨(dú)作為有效成分與玉米淀粉混合制成微生態(tài)制劑，或產(chǎn)酸蠟樣芽孢桿菌菌粉與其它至少一種有效成分或菌粉以及玉米淀粉混合制成復(fù)合微生態(tài)制劑。本發(fā)明還提供了一種復(fù)合微生態(tài)制劑M3，其是以三大耐高溫菌種枯草芽孢桿菌N9-1-35、丁酸梭菌Cb-2以及本發(fā)明的產(chǎn)酸芽孢菌GF1及玉米淀粉混合制成，三種菌粉及玉米淀粉的質(zhì)量比為1∶2∶2∶5，各菌粉的活菌數(shù)分別大于或者等于1.0×109cfu/g、5.0×108cfu/g、5.0×108cfu/g。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102517238SQ20111045528
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者劉巧利, 單寶龍, 張建梅, 穆熙軍, 翟延慶, 胡順珍, 謝全喜, 谷巍 申請(qǐng)人:山東寶來利來生物工程股份有限公司