本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及基于磁性納米粒子的蠟樣芽孢桿菌分離方法。

背景技術(shù)：

蠟樣芽孢桿菌是一種產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性菌，廣泛分布于土壤、灰塵和水中，因此很容易污染各類食品，是常見的食品污染菌和條件致病菌。食品在20℃以上的條件下放置時(shí)，蠟樣芽孢桿菌能迅速繁殖并產(chǎn)生毒素，同時(shí)，由于菌體本身不分解蛋白質(zhì)，因此，食品在感官上無明顯變化，無異味，很容易誤食而發(fā)生食物中毒。因蠟樣芽孢桿菌污染引起食物中毒事件顯示，多數(shù)是由剩米飯、米粉、剩菜、甜點(diǎn)、肉類制品等食物造成，最常見可導(dǎo)致兩種不同類型的食物中毒：腹瀉型和嘔吐型。鑒于需要建立一種高效，快速的檢測(cè)方法，基于功能化的磁性納米粒子的分離技術(shù)在致病菌監(jiān)測(cè)中得到了迅速發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種捕獲效率高、簡便、分離時(shí)間短、低梯度磁場(chǎng)下從復(fù)雜基質(zhì)中快速、特異分離目的菌蠟樣芽孢桿菌的方法。

蠟樣芽孢桿菌的快速分離方法，包括以下步驟：(1)吸取2ml的磁性納米粒子，加入到8mlph＝7.4的無菌的pbs溶液中，然后在外加磁場(chǎng)的作用下，將對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行洗滌，重復(fù)3次，將洗滌好的磁性納米粒子重懸于10ml無菌的pbs溶液中；(2)5.8mgedc，溶于290μl無菌的pbs溶液中，6.5mgnhss，溶于325μl無菌的pbs溶液中，然后將溶解后的edc和nhss加入到洗滌過的磁性納米粒子中，活化1h；(3)將活化后磁性納米粒子用無菌的pbs溶液洗滌3次，重懸于8ml無菌的pbs溶液中；(4)稱取聚乙二醇90mg，溶解到1.8ml無菌的pbs溶液中，然后加入到活化后的磁性納米粒子溶液中，反應(yīng)3h，然后用無菌的pbs洗滌3次，重懸于8ml無菌的pbs溶液中，得到聚乙二醇修飾的磁性納米粒子；(5)稱取91.3mg萬古霉素，48.3mgedc和54.8mgnhss,分別溶于無菌的pbs溶液中，混合均勻后通過碳化二亞胺法，活化萬古霉素表面羧基，活化10min；(6)將活化后的萬古霉素加入到聚乙二醇修飾的磁性納米粒子中，孵育6h；(7)反應(yīng)完畢后，用無菌的pbs溶液洗滌3次，重懸于10ml無菌的pbs溶液中，得到終濃度為2mg/ml的萬古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物，用于富集蠟樣芽孢桿菌。(8)取10ml待測(cè)樣品溶液，加入1mg萬古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物，置于培養(yǎng)箱內(nèi)，以200rpm/min的轉(zhuǎn)速37℃孵育45min；插入磁力架分離6min；(9)磁分離后，無菌pbs溶液清洗后，再用無菌的pbs緩沖液混合重懸即得富集有蠟樣芽孢桿菌的蠟樣芽孢桿菌-萬古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物。

所述兩端接有氨基的聚乙二醇，其分子量為2000da，其結(jié)構(gòu)如圖1。

所述磁性納米粒子粒徑為180nm，表面連有羧基。

首先萬古霉素通過羧基與聚乙二醇的氨基相連，然后聚乙二醇的另一端氨基與磁珠表面的羧基相連，最后萬古霉素通過五個(gè)氫鍵與蠟樣芽孢桿菌表面的d-丙氨酰-d-丙氨酸(d-ala-d-ala)分子相連。具體原理見圖2。

本方法適用于從樣品基質(zhì)分離目的菌，特別適用從復(fù)雜基質(zhì)中分離目的菌。食品樣品包括各類新鮮或冷凍加工后的食品材質(zhì)，如新鮮蔬菜、肉類、海鮮類和奶類等產(chǎn)品。樣品處理按照常規(guī)處理方法即可，如將樣品粉碎溶解后制成待測(cè)溶液。

采用本發(fā)明技術(shù)方案具有如下有益效果：

1、本發(fā)明采用的是180nm的磁性納米粒子，主要用于基質(zhì)中目標(biāo)菌的快速富集，而現(xiàn)有技術(shù)采用30nm或者50nm納米磁珠結(jié)合樹狀分子的富集方法是用于磁信號(hào)的放大。

2、本發(fā)明采用的萬古霉素是傳統(tǒng)的商業(yè)藥物，相比于抗體，具有穩(wěn)定好，成本低，質(zhì)量可控等優(yōu)點(diǎn)?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，在單次分離過程中，本發(fā)明構(gòu)建的分離萬古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物在成本上比免疫磁分離陳本降低了195倍；在材料保存方面比免疫磁珠保質(zhì)期也更長。

3、在食品基質(zhì)或者血液中，是多種致病菌共存的環(huán)境。本發(fā)明采用的萬古霉素是廣譜的識(shí)別革蘭氏陽性菌的分子識(shí)別劑，用于分離基質(zhì)中的革蘭氏陽性菌是一種通用的分離策略，可以將基質(zhì)中的大多數(shù)革蘭氏陽性菌都分離出來，然后通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)或者選擇性培養(yǎng)進(jìn)行鑒別。相比之下，抗體因其只能專一的識(shí)別，從而分離出對(duì)應(yīng)的目標(biāo)菌，其他存在于機(jī)制中的致病菌無法鑒別。

4、本發(fā)明合成的萬古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物是先將聚乙二醇偶聯(lián)到磁性納米粒子的表面，然后再將萬古霉素修飾到聚乙二醇-磁性納米粒子表面，相比于萬古霉素先與聚乙二醇偶聯(lián)后，再與結(jié)合多聚賴氨酸(pll)修飾磁性納米粒子的方法，本發(fā)明的萬古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物不僅可以達(dá)更好的分離效率，而且在材料合成中耗時(shí)更短時(shí)間和成本更低。

5、本發(fā)明將聚乙二醇分子先偶聯(lián)在磁性納米粒子表面，然后再將萬古霉素分子偶聯(lián)于聚乙二醇包被的磁性納米粒子上，避免了常規(guī)方法中將萬古霉素分子偶聯(lián)于磁珠表面或者直接將萬古霉素分子直接接在磁性納米粒子表面，導(dǎo)致萬古霉素或者萬古霉素分子活性降低和空間位阻大的缺點(diǎn)。同時(shí)聚乙二醇作為分子臂具有很好的靈活性，有利于萬古霉素分子與單增李斯特菌表面的d-丙氨酰-d-丙氨酸(d-ala-d-ala)分子相連，提高了捕獲效率。相比于直接偶聯(lián)或者借助萬古霉素分子中氨基作為反應(yīng)基團(tuán)的方法，該方法分離單增李斯特菌能力更強(qiáng)，特別適用于復(fù)雜樣品單增李斯特的分離，如食品樣品、全血樣品等。

6、磁性納米粒子偶聯(lián)萬古霉素時(shí)，一般采用疏水吸附或化學(xué)偶聯(lián)方式將具有活性的萬古霉素聯(lián)接在磁性納米粒子表面。萬古霉素與磁性納米粒子表面距離太近，磁性納米粒子本身性質(zhì)及其表面殘留的疏水或強(qiáng)親水基團(tuán)容易引起萬古霉素空間構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致萬古霉素生物活性下降。然而本實(shí)驗(yàn)方案在偶聯(lián)過程中引入聚乙二醇分子，其具有一定的空間長度，從而使萬古霉素分子遠(yuǎn)離磁性納米粒子和磁性納米粒子表面，避免了磁性納米粒子本身性質(zhì)及表面對(duì)萬古霉素分子的影響。同時(shí)，引入聚乙二醇卻不會(huì)影響萬古霉素分子的空間構(gòu)象，從而起到了保護(hù)萬古霉素分子生物活性的作用。

7、本發(fā)明采用聚乙二醇分子，提高磁性納米粒子在溶液的穩(wěn)定性，避免發(fā)生沉淀，增加復(fù)合物的水溶性和生物相容性。

附圖說明

圖1兩端氨基的聚乙二醇聚合物結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2本發(fā)明所涉及的磁分離技術(shù)操作流程圖；

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

磁性納米粒子(180nm)購買于上海奧潤有限公司。

兩端氨基的聚乙二醇2000da，購自于威海晨源化工新材料有限公司。

萬古霉素分子購自于上海阿拉丁有限公司。

n-羥基丁二酰亞胺nhss,乙基3-(3-二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽edc等均為常規(guī)試劑，不再贅述。

0.01mpbs溶液配制方法：8.0gnacl、0.2gkcl、0.24gkh2po4、1.44gna2hpo4溶解于800ml蒸餾水中，用5mnaoh調(diào)節(jié)ph至7.4，再定容至1000ml即得0.01mpbs溶液。

實(shí)施例1

1.萬古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物，按照如下步驟制備:

(1)取2ml的磁性納米粒子，加入到8mlph＝7.4的無菌的pbs溶液中，然后在外加磁場(chǎng)的作用下，對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行洗滌，重復(fù)3次，將洗滌好的磁性納米粒子重懸于10ml無菌的pbs溶液中；

(2)5.8mgedc，溶于290μl無菌的pbs中，6.5mgnhss，溶于325μl無菌的pbs中，然后將溶解后的edc和nhss加入到洗滌過的磁性納米粒子溶液中，活化1h；

(3)將活化后磁性納米粒子用無菌的pbs洗滌3次，重懸于8ml無菌的pbs溶液中；

(4)稱取聚乙二醇90mg，溶解于1.8ml無菌的pbs溶液中，然后加入到活化后的磁性納米粒子溶液中，反應(yīng)3h，然后無菌的pbs洗滌3次，重懸于8ml無菌的pbs溶液中，得到聚乙二醇修飾的磁性納米粒子；

(5)稱取91.3mg萬古霉素，48.3mgedc和54.8mgnhss,分別溶于無菌的pbs溶液中，然后混合通過碳化二亞胺法，活化萬古霉素表面羧基，活化10min；

(6)將活化后的萬古霉素加入到聚乙二醇修飾的磁性納米粒子中，孵育6h；

(7)反應(yīng)完畢后，用無菌的pbs洗滌3次，重懸于10ml無菌的pbs溶液中，得到濃度為2mg/ml的萬古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物，用于富集蠟樣芽孢桿菌。

2.富集捕獲：取待測(cè)樣品溶液10ml，加入1mg萬古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物，置于混勻儀上，以200rpm/min的轉(zhuǎn)速室溫孵育45min形成蠟樣芽孢桿菌-萬古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物復(fù)合物；將離心管插入常規(guī)磁力架分離6min；

3.去離子水輕輕清洗后，用pbs緩沖液混合重懸即得富集有蠟樣芽孢桿菌的蠟樣芽孢桿菌-萬古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物。

實(shí)施例2富集效果實(shí)驗(yàn)

(1)取1ml濃度為10⁵cfu/ml的蠟樣芽孢桿菌于1.5ml無菌離心管中，12000rpm離心5min，棄上清，用等體積無菌pbs溶液重懸。

(2)富集捕獲：分別設(shè)置本發(fā)明技術(shù)方案組：聚乙二醇-磁性納米粒子組、萬古霉素-磁性納米粒子、萬古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子組富集目的菌。

(3)磁分離后，將上清液移入無菌離心管中，而分離出來捕獲有蠟樣芽孢桿菌的萬古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子則用pbs溶液清洗兩次，混合均勻，并用1ml無菌pbs溶液重懸蠟樣芽孢桿菌-萬古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子。

(4)捕獲率計(jì)算：將各組富集的目的菌重懸液進(jìn)行梯度稀釋后，用平板對(duì)每個(gè)梯度計(jì)數(shù)，通過捕獲效率公式計(jì)算目標(biāo)菌的捕獲效率，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。各組捕獲效率的計(jì)算公式如下：[被富集吸附的菌落總數(shù)/(上清液中菌落總數(shù)+被富集吸附的菌落總數(shù))]×100％。

所述各組富集捕獲目的菌的方案如下：

a.本發(fā)明技術(shù)方案組(蠟樣芽孢桿菌-萬古霉素和萬古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子組)富集捕獲目的菌方案如實(shí)施例1，具體如下：將1mg萬古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物加入到含目標(biāo)菌離心管中，置于混勻儀上，以200rpm/min的轉(zhuǎn)速室溫孵育45min。將離心管插入常規(guī)磁力架分離6min。

b.萬古霉素-磁性納米粒子組富集捕獲目的菌方案具體如下：

將1mg制備好的萬古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子加入到含目標(biāo)菌離心管中，置于混勻儀上，以200rpm/min的轉(zhuǎn)速室溫孵育45min。最后，將離心管插入常規(guī)磁力架分離6min。

所述萬古霉素修飾的磁性納米粒子制備：(1)取2ml磁性納米粒子(1)取2ml的磁性納米粒子，加入到8mlph＝7.4的無菌的pbs溶液中，然后在外加磁場(chǎng)的作用下，對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行洗滌，重復(fù)3次，將洗滌好的磁性納米粒子重懸于10ml無菌的pbs溶液中；(2)5.8mgedc，溶于290μl無菌的pbs中，6.5mgnhss，溶于325μl無菌的pbs中，然后將溶解后的edc和nhss加入到洗滌過的磁性納米粒子溶液中，活化1h；(3)將活化后磁性納米粒子用無菌的pbs洗滌3次，重懸于8ml無菌的pbs溶液中；(4)稱取91.3mg萬古霉素，48.3mgedc和54.8mgnhss,分別溶于無菌的pbs溶液中，然后混合通過碳化二亞胺法，活化萬古霉素表面羧基，活化10min；(5)將活化后的萬古霉素加入到聚乙二醇修飾的磁性納米粒子中，孵育6h；(6)反應(yīng)完畢后，用無菌的pbs洗滌3次，重懸于10ml無菌的pbs溶液中，得到濃度為2mg/ml萬古霉素修飾的磁性納米粒子。

c.聚乙二醇-磁性納米粒子組

將1mg制備好的聚乙二醇-磁性納米粒子加入到含蠟樣芽孢桿菌離心管中，置于混勻儀上，以200rpm的轉(zhuǎn)速室溫孵育45min。最后，將離心管插入常規(guī)磁力架分離6min。

所述萬古霉素修飾的磁性納米粒子制備：取2ml的磁性納米粒子，加入到8mlph＝7.4的無菌的pbs溶液中，然后在外加磁場(chǎng)的作用下，對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行洗滌，重復(fù)3次，將洗滌好的磁性納米粒子重懸于10ml無菌的pbs溶液中；(2)5.8mgedc，溶于290μl無菌的pbs中，6.5mgnhss，溶于325μl無菌的pbs中，然后將溶解后的edc和nhss加入到洗滌過的磁性納米粒子溶液中，活化1h；(3)將活化后磁性納米粒子用無菌的pbs洗滌3次，重懸于8ml無菌的pbs溶液中；(4)稱取聚乙二醇90mg，溶解于1.8ml無菌的pbs溶液中，然后加入到活化后的磁性納米粒子溶液中，反應(yīng)3h，然后無菌的pbs洗滌3次，重懸于10ml無菌的pbs溶液中，得到聚乙二醇修飾的磁性納米粒子，得到濃度為2mg/ml的聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物，用于富集蠟樣芽孢桿菌。

各組捕獲率如下：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，萬古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子組的捕獲效率明顯高于萬古霉素修飾的磁性納米粒子組捕獲效率，這說明聚乙二醇作為分子臂增加了萬古霉素與目標(biāo)菌的結(jié)合機(jī)會(huì)，使得目標(biāo)菌的表面結(jié)合了更多的納米粒子，因此，在短時(shí)間內(nèi)就能分離富集較多的目標(biāo)菌。聚乙二醇-磁性納米粒子組的捕獲效率很低，說明其對(duì)目標(biāo)菌的非特異性很低，從而說明用萬古霉素分子來捕獲目標(biāo)菌具有良好的效果。

實(shí)施例3

將無菌肉類粉碎，按常規(guī)方式制成待測(cè)樣品溶液，加入蠟樣芽孢桿菌調(diào)節(jié)菌液濃度至10⁵cfu/ml備用。

將制備好萬古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子(1mg)分別加入到樣品溶液中，置于混勻儀上，以200rpm/min的轉(zhuǎn)速室溫孵育45min。然后常規(guī)磁力架分離6min。磁分離后，將上清液倒入無菌離心管中，而分離出來捕獲有蠟樣芽孢桿菌-萬古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物則用無菌pbs溶液清洗兩次，混合均勻，并用1ml無菌pbs溶液重懸蠟樣芽孢桿菌-萬古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物。捕獲率如實(shí)施例2方法獲得，其余同實(shí)施例2。結(jié)果見表1，表明本方案能高效富集分離樣品中的蠟樣芽孢桿菌。

實(shí)施例4

無菌牛奶為樣品待測(cè)樣品溶液，加入蠟樣芽孢桿菌調(diào)節(jié)菌液濃度至10⁵cfu/ml。其余同實(shí)施例3。

實(shí)施例5

無菌蔬菜粉碎，按常規(guī)方式制成待測(cè)樣品溶液，加入蠟樣芽孢桿菌調(diào)節(jié)菌液濃度至10⁵cfu/ml。

實(shí)施例6

待測(cè)樣品為無菌全血，加入蠟樣芽孢桿菌調(diào)節(jié)菌落濃度至10⁵cfu/ml。其余同實(shí)施例4。

表1不同實(shí)際樣品中蠟樣芽孢桿菌分離效果的比較

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。