本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,具體是涉及基于磁珠的蠟樣芽孢桿菌分離方法。
背景技術(shù):
蠟樣芽孢桿菌是一種產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性菌,廣泛分布于土壤、灰塵和水中,因此很容易污染各類食品,是常見(jiàn)的食品污染菌和條件致病菌。食品在20℃以上的條件下放至?xí)r,蠟樣芽孢桿菌能迅速繁殖并產(chǎn)生腸毒素,同時(shí),由于本菌不分解蛋白質(zhì),因此,食品在感官上無(wú)明顯變化,無(wú)異味,很容易誤食而發(fā)生食物中毒。因蠟樣芽孢桿菌污染引起食物中毒事件顯示,多數(shù)是由剩米飯、米粉、剩菜、甜點(diǎn)、肉類制品等富含碳水化合物的食物造成,最常見(jiàn)可導(dǎo)致兩種不同類型的食物中毒:腹瀉型和嘔吐型。鑒于需要建立一種高效,快速的檢測(cè)方法,基于功能化的磁性納米粒子的分離技術(shù)在致病菌監(jiān)測(cè)中得到了迅速發(fā)展。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷,本發(fā)明的目的是提供一種捕獲效率高、簡(jiǎn)便、分離時(shí)間短,低梯度磁場(chǎng)下從復(fù)雜基質(zhì)中快速、特異分離目的菌蠟樣芽孢桿菌的方法。
蠟樣芽孢桿菌的快速分離方法,包括以下步驟:(1)吸取2ml的磁珠,加入到8mlph=7.4的滅菌的pbs溶液中,然后在外加磁場(chǎng)的作用下,將對(duì)磁珠進(jìn)行洗滌,重復(fù)3次,將洗滌好的磁珠重懸于10ml滅菌的pbs溶液中;(2)5.8mgedc,溶于290μl滅菌的pbs中,6.5mgnhss,溶于325μl滅菌的pbs中,然后將溶解后的edc和nhss加入到洗滌過(guò)的磁珠中,活化1h;(3)將活化后磁珠用滅菌的pbs洗滌3次,重懸于8ml滅菌的pbs溶液中;(4)稱取牛血清白蛋白24mg,溶解到3ml滅菌的pbs溶液中,然后加入到活化后的磁珠溶液中,反應(yīng)3h,然后用滅菌的pbs洗滌3次,重懸于8ml滅菌的pbs溶液中,得到牛血清白蛋白修飾的磁珠;(5)稱取200mg萬(wàn)古霉素,169.31mgedc和47.98mgnhss,分別溶于滅菌的pbs溶液中,然后混合通過(guò)碳化二亞胺法,活化萬(wàn)古霉素表面羧基,活化10min;(6)將活化后的萬(wàn)古霉素加入到牛血清白蛋白修飾的磁珠中,孵育6h;(7)反應(yīng)完畢后,用滅菌的pbs洗滌3次,重懸于10ml滅菌的pbs溶液中,得到濃度為2mg/ml的萬(wàn)古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物,用于富集蠟樣芽孢桿菌。(8)取10ml待測(cè)樣品溶液,加入0.7mg萬(wàn)古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物,置于培養(yǎng)箱上,以200rpm的轉(zhuǎn)速37℃孵育45min;插入磁力架分離3min;(9)磁分離后,無(wú)菌pbs溶液清洗后,用無(wú)菌的pbs緩沖液混重懸即得富集有蠟樣芽孢桿菌-萬(wàn)古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物。
所述牛血清白蛋白,其分子量為66000da。
所述磁珠粒徑為180nm,表面羧基。
由于牛血清白蛋白表面有多個(gè)氨基,故萬(wàn)古霉素通過(guò)羧基與牛血清白蛋白的氨基相連,也可以牛血清白蛋白的氨基與磁珠表面的羧基相連,然后萬(wàn)古霉素通過(guò)五個(gè)氫鍵與蠟樣芽孢桿菌表面的d-丙氨酰-d-丙氨酸(d-ala-d-ala)分子相連。
具體原理見(jiàn)圖1。
本方法適用于從樣品基質(zhì)中的分離目的菌,特別適用從復(fù)雜基質(zhì)中分離目的菌。食品樣品包括各類新鮮或冷凍加工后的食品材質(zhì),如新鮮蔬菜、肉類、海鮮類和奶類等產(chǎn)品。樣品處理按照常規(guī)處理方法即可,如將樣品粉碎后制成待測(cè)溶液。
采用本發(fā)明技術(shù)方案具有如下有益效果:
1、本發(fā)明采用的是180nm的磁性納米粒子,主要用于基質(zhì)中目標(biāo)菌的快速富集,而采用30nm或者50nm納米磁珠結(jié)合樹(shù)狀分子的富集方法是用于磁信號(hào)的放大。
2、本發(fā)明采用的萬(wàn)古霉素是傳統(tǒng)的商業(yè)藥物,相比于抗體,具有穩(wěn)定好,成本低,質(zhì)量可控等優(yōu)點(diǎn)?;谏鲜鰞?yōu)點(diǎn),在單次分離過(guò)程中,本發(fā)明構(gòu)建的分離萬(wàn)古霉素-牛血清白蛋白-磁性納米粒子復(fù)合物在成本上比免疫磁分離陳本降低了195倍;在材料保存方面比免疫磁珠保質(zhì)期也更長(zhǎng)。
3、在食品基質(zhì)或者血液中,是多種致病菌共存的環(huán)境。本發(fā)明采用的萬(wàn)古霉素是廣譜的識(shí)別革蘭氏陽(yáng)性菌的分子識(shí)別劑,用于分離基質(zhì)中的革蘭氏陽(yáng)性菌是一種通用的分離策略,可以將基質(zhì)中的大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌都分離出來(lái),然后通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)或者選擇性培養(yǎng)進(jìn)行鑒別。相比之下,抗體因其只能專一的識(shí)別,從而分離出對(duì)應(yīng)的目標(biāo)菌,其他存在于機(jī)制中的致病菌無(wú)法鑒別。
4、本發(fā)明合成的萬(wàn)古霉素-牛血清白蛋白-磁性納米粒子復(fù)合物是先將牛血清白蛋白偶聯(lián)到磁性納米粒子的表面,然后再將萬(wàn)古霉素修飾到牛血清白蛋白-磁性納米粒子表面,相比于萬(wàn)古霉素先與牛血清白蛋白偶聯(lián)后,再與結(jié)合多聚賴氨酸(pll)修飾磁性納米粒子的方法,本發(fā)明的萬(wàn)古霉素-牛血清白蛋白-磁性納米粒子復(fù)合物不僅可以達(dá)更好的分離效率,而且在材料合成中耗時(shí)更短時(shí)間和成本更低。
5、本發(fā)明將牛血清白蛋白分子先偶聯(lián)在磁性納米粒子表面,然后再將萬(wàn)古霉素分子偶聯(lián)于牛血清白蛋白包被的磁性納米粒子上,避免了常規(guī)方法中將萬(wàn)古霉素分子偶聯(lián)于磁珠表面或者直接將萬(wàn)古霉素分子直接接在磁性納米粒子表面,導(dǎo)致萬(wàn)古霉素或者萬(wàn)古霉素分子活性降低和空間位阻大的缺點(diǎn)。同時(shí)牛血清白蛋白作為分子臂具有很好的靈活性,有利于萬(wàn)古霉素分子與蠟樣芽孢桿菌表面的d-丙氨酰-d-丙氨酸(d-ala-d-ala)分子相連,提高了捕獲效率。相比于直接偶聯(lián)或者借助萬(wàn)古霉素分子中氨基作為反應(yīng)基團(tuán)的方法,該方法分離蠟樣芽孢桿菌能力更強(qiáng),特別適用于復(fù)雜樣品蠟樣芽孢桿菌的分離,如食品樣品、全血樣品等。
6、磁性納米粒子偶聯(lián)萬(wàn)古霉素時(shí),一般采用疏水吸附或化學(xué)偶聯(lián)方式將具有活性的萬(wàn)古霉素聯(lián)接在磁性納米粒子表面。萬(wàn)古霉素與磁性納米粒子表面距離太近,磁性納米粒子本身性質(zhì)及其表面殘留的疏水或強(qiáng)親水基團(tuán)容易引起萬(wàn)古霉素空間構(gòu)象發(fā)生改變,導(dǎo)致萬(wàn)古霉素生物活性下降。然而本實(shí)驗(yàn)方案在偶聯(lián)過(guò)程中引入牛血清白蛋白分子,其具有一定的空間長(zhǎng)度,從而使萬(wàn)古霉素分子遠(yuǎn)離磁性納米粒子和磁性納米粒子表面,避免了磁性納米粒子本身性質(zhì)及表面對(duì)萬(wàn)古霉素分子的影響。同時(shí),引入牛血清白蛋白卻不會(huì)影響萬(wàn)古霉素分子的空間構(gòu)象,從而起到了保護(hù)萬(wàn)古霉素分子生物活性的作用。
7、本發(fā)明采用牛血清白蛋白分子,提高磁性納米粒子在溶液的穩(wěn)定性,避免發(fā)生沉淀,增加復(fù)合物的水溶性和生物相容性。
附圖說(shuō)明
圖1本發(fā)明所涉及的磁分離技術(shù)的操作流程圖;
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明更加清楚明白,以下結(jié)合實(shí)施例,對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解,此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明,并不用于限定本發(fā)明。
磁珠(180nm)購(gòu)買(mǎi)于上海奧潤(rùn)有限公司。
牛血清白蛋白66000da,購(gòu)自于威海晨源化工新材料有限公司。
萬(wàn)古霉素分子購(gòu)自于上海阿拉丁有限公司。
n-羥基丁二酰亞胺nhss,乙基3-(3-二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽edc等均為常規(guī)試劑,不再贅述。
0.01mpbs配制方法:8.0gnacl、0.2gkcl、0.24gkh2po4、1.44gna2hpo4溶解于800ml蒸餾水中,用5mnaoh調(diào)整ph至7.4,再定容至1000ml即得0.01mpbs。
實(shí)施例1
1.萬(wàn)古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物,按照如下步驟制備:
(1)取2mg磁珠,懸浮于8ml磷酸緩沖液(pbs,0.01mol/l,ph7.4)中,洗滌3次,加5.8mgedc,溶于290μl滅菌的pbs中,6.5mgnhss,溶于325μl滅菌的pbs中,然后將溶解后的edc和nhss加入到洗滌過(guò)的磁珠中,活化1h;;
(2)稱取牛血清白蛋白24mg,溶解到3ml滅菌的pbs溶液中,然后加入到活化后的磁珠溶液中,反應(yīng)2h,然后用滅菌的pbs洗滌3次,重懸于8ml滅菌的pbs溶液中,得到牛血清白蛋白修飾的磁珠;
(3)稱取200mg萬(wàn)古霉素,169.31mgedc和47.98mgnhss,分別溶于滅菌的pbs溶液中,然后混合通過(guò)碳化二亞胺法,活化萬(wàn)古霉素表面羧基,活化10min;將活化后的萬(wàn)古霉素加入到牛血清白蛋白修飾的磁珠中,孵育6h;
(4)反應(yīng)完畢后,用滅菌的pbs洗滌3次,重懸于10ml滅菌的pbs溶液中,得到濃度為2mg/ml的萬(wàn)古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物,用于富集蠟樣芽孢桿菌。
2.富集捕獲:取待測(cè)樣品溶液10ml,加入0.7mg萬(wàn)古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物,置于混勻儀上,以200rpm的轉(zhuǎn)速室溫孵育45min形成蠟樣芽孢桿菌-萬(wàn)古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物復(fù)合物;將離心管插入常規(guī)磁力架分離3min;
3.去離子水輕輕清洗后,用pbs緩沖液混重懸即得富集有蠟樣芽孢桿菌的蠟樣芽孢桿菌-萬(wàn)古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物。
實(shí)施例2富集效果實(shí)驗(yàn)
(1)取1ml濃度為105cfu/ml的蠟樣芽孢桿菌菌于1.5ml無(wú)菌離心管中,12000rpm離心5min,棄上清,用等體積無(wú)菌pbs溶液重懸。
(2)富集捕獲:分別設(shè)置本發(fā)明技術(shù)方案組:牛血清白蛋白-磁珠組、萬(wàn)古霉素-磁珠、萬(wàn)古霉素-牛血清白蛋白-磁珠組富集目的菌。
(3)磁分離后,將上清液倒入無(wú)菌離心管中,而分離出來(lái)捕獲有蠟樣芽孢桿菌的萬(wàn)古霉素-牛血清白蛋白-磁珠則用pbs清洗兩次,混合均勻,并用1ml無(wú)菌pbs溶液重懸蠟樣芽孢桿菌-萬(wàn)古霉素-牛血清白蛋白-磁珠。
(4)捕獲率計(jì)算:將各組富集的目的菌重懸液進(jìn)行梯度稀釋后,用平板對(duì)每個(gè)梯度計(jì)數(shù),通過(guò)捕獲效率公式計(jì)算目標(biāo)菌的捕獲效率,每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。各組捕獲效率的計(jì)算公式如下:[被富集吸附的菌落總數(shù)/(上清液中菌落總數(shù)+被富集吸附的菌落總數(shù))]×100%。
所述各組富集捕獲目的菌的方案如下:
a.本發(fā)明技術(shù)方案組(萬(wàn)古霉素-牛血清白蛋白-磁珠組)富集捕獲目的菌方案如實(shí)施例2,具體如下:
將0.7mg萬(wàn)古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物加入到含目標(biāo)菌離心管中,置于混勻儀上,以200rpm的轉(zhuǎn)速室溫孵育45min。將離心管插入常規(guī)磁力架分離3min。
b.萬(wàn)古霉素-磁珠組富集捕獲目的菌方案具體如下:
將0.7mg制備好的萬(wàn)古霉素-磁珠加入到含目標(biāo)菌離心管中,置于混勻儀上,以200rpm的轉(zhuǎn)速室溫孵育45min。最后,將離心管插入常規(guī)磁力架分離3min。
所述萬(wàn)古霉素修飾的磁珠制備:(1)取2ml的磁珠,加入到8mlph=7.4的無(wú)菌的pbs溶液中,然后在外加磁場(chǎng)的作用下,將對(duì)磁珠進(jìn)行洗滌,重復(fù)3次,將洗滌好的磁珠重懸于10ml無(wú)菌的pbs溶液;(2)5.8mgedc,溶于290μl無(wú)菌的pbs中,6.5mgnhss,溶于325μl無(wú)菌的pbs中,然后將溶解后的edc和nhss加入到洗滌過(guò)的磁珠中,活化1h;(3)將活化后磁珠用無(wú)菌的pbs洗滌3次,重懸于8ml無(wú)菌的pbs溶液中;(4)稱取200mg萬(wàn)古霉素溶于無(wú)菌的pbs溶液中,然后活化好的磁珠孵育2h;(7)反應(yīng)完畢后,用無(wú)菌的pbs洗滌3次,重懸于10ml無(wú)菌的pbs溶液中,得到濃度為2mg/ml的萬(wàn)古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物,用于富集蠟樣芽孢桿菌。
c.牛血清白蛋白-磁珠組
(1)取2ml磁珠,懸浮于8ml磷酸緩沖液(pbs,0.01mol/l,ph7.4)中,洗滌3次,加5.8mgedc,溶于290μl滅菌的pbs中,6.5mgnhss,溶于325μl滅菌的pbs中,然后將溶解后的edc和nhss加入到洗滌過(guò)的磁珠中,活化1h;
(2)稱取牛血清白蛋白24mg,溶解到3ml滅菌的pbs溶液中,然后加入到活化后的磁珠溶液中,反應(yīng)2h,然后用滅菌的pbs洗滌3次,重懸于8ml滅菌的pbs溶液中,得到牛血清白蛋白修飾的磁珠;
(3)磁架回收牛血清白蛋白-磁珠,pbs洗滌三次,10mlpbs(ph=7.4),得到濃度為2mg/ml的萬(wàn)古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物,用于富集蠟樣芽孢桿菌。
各組捕獲率如下:
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,萬(wàn)古霉素-牛血清白蛋白-磁珠組的捕獲效率明顯高于萬(wàn)古霉素修飾的磁珠組捕獲效率,這說(shuō)明牛血清白蛋白作為載體分子增加了萬(wàn)古霉素與目標(biāo)菌的結(jié)合機(jī)會(huì),使得目標(biāo)菌的表面結(jié)合了更多的納米粒子,因此,在短時(shí)間內(nèi)就能分離富集較多的目標(biāo)菌。牛血清白蛋白-磁珠組的捕獲效率很低,說(shuō)明牛血清白蛋白同時(shí)也能很好的降低非特異性吸附。通過(guò)以上三組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),說(shuō)明以牛血清白蛋白作為分子,不僅可以提高分離效率,同時(shí)也能很好的降低非特異性吸附。說(shuō)明用萬(wàn)古霉素分子來(lái)捕獲目標(biāo)菌具有良好的效果。
實(shí)施例3
無(wú)菌果汁為樣品待測(cè)樣品溶液,加入蠟樣芽孢桿菌調(diào)節(jié)菌落濃度至105cfu/ml備用。
將制備好萬(wàn)古霉素-牛血清白蛋白-磁珠(0.7mg)分別加入到樣品溶液中,置于混勻儀上,以200rpm的轉(zhuǎn)速室溫孵育45min。然后常規(guī)磁力架分離3min。磁分離后,將上清液倒入無(wú)菌離心管中,而分離出來(lái)捕獲有蠟樣芽孢桿菌-古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物則用無(wú)菌pbs清洗兩次,混合均勻,并用1ml無(wú)菌pbs溶液重懸蠟樣芽孢桿菌-萬(wàn)古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物。捕獲率如實(shí)施例2方法獲得,其余同實(shí)施例2。結(jié)果見(jiàn)表1,表明本方案能高效富集分離樣品中的蠟樣芽孢桿菌。
實(shí)施例4
無(wú)菌牛奶為樣品待測(cè)樣品溶液,加入蠟樣芽孢桿菌調(diào)節(jié)菌落濃度至105cfu/ml。其余同實(shí)施例3。
實(shí)施例5
無(wú)菌飲用水為樣品待測(cè)樣品溶液,加入蠟樣芽孢桿菌調(diào)節(jié)菌落濃度至105cfu/ml。
實(shí)施例6
待測(cè)樣品為無(wú)菌全血,加入蠟樣芽孢桿菌調(diào)節(jié)菌落濃度至105cfu/ml。其余同實(shí)施例3。
表1不同實(shí)際樣品中蠟樣芽孢桿菌分離效果的比較
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例,并不用以限制本發(fā)明,凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等,均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。