本發(fā)明涉及一種合成左旋肉堿的方法，尤其是采用高效的生物酶催化和現(xiàn)代化的分離技術的左旋肉堿合成方法，具體是一種催化合成左旋肉堿的生物酶及其制備方法。

背景技術：

左旋肉堿(l-carnitine)，又稱l-肉堿或音譯卡尼丁，是一種促使脂肪轉化為能量的類氨基酸，紅色肉類是左旋肉堿的主要來源，對人體無毒副作用。左旋肉堿是脂肪代謝過程中的一種關鍵的物質，能夠促進脂肪酸進入線粒體氧化分解。左旋肉堿的主要生理功能是促進脂肪轉化成能量，服用左旋肉堿能夠在減少身體脂肪、降低體重的同時，不減少水分和肌肉，在2003年被國際肥胖健康組織認定為最安全無副作用的減肥營養(yǎng)補充品。

左旋肉堿的制取方法

1.直接提取法

由以上表可以看出．在動物肌肉中左旋肉堿的含量相對較豐富，早期的左旋肉堿往往是從肉浸汁中分離出來但由于左旋肉堿的絕對含量較少，且有結構類似物(肉浸汁中的膽堿)存在，難以分離，因而提取純化的步驟較多，收率低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

2．消旋體拆分法

化學拆分

美國專利3151149報道了使用d-(+)-樟腦-10-磺酸進行拆分，但此方法要使用agno3以除去cl^-，因而成本高，收率低(小于50％)，純度低，生產(chǎn)條件苛刻。左旋肉堿比較經(jīng)典的化學拆分法是先合成肉堿消旋體然后再進行拆分。以環(huán)氧氯丙烷為起始原料，經(jīng)胺化、腈化、水解而得到肉堿消旋體。此法的優(yōu)點是避開了有毒的氰化物等有毒物質，且無需離子交換樹脂，操作簡單安全，但合成步驟多、收率不高。

生物拆分

利用微生物專一降解右旋肉堿的能力生產(chǎn)左旋肉堿。charles在此方面作了很多工作．選育出降解右旋肉堿有特效的菌株，經(jīng)過25℃，44h的培養(yǎng)，右旋肉堿全部消失，左旋肉堿剩下38%，由此可見，盡管純度很高，但收率太低。

3．不對稱催化合成法

用催化劑的不對稱中心來誘導產(chǎn)生物的手性。這是指只合成光學異構體中的一個方法。kitamura等人通過不對稱催化氫化γ一氯一乙酰乙酸酯合成出制各左旋肉堿的重要中間體γ-氯-β-羥基丁酸酯。反應得到中間體的光學純度為97%，這種方法簡便?？旖荩兌雀?，但反應條件苛刻。mccarthy發(fā)明了一種簡單的方法，就是以(s)-3-羥基丁酸內酯為原料，經(jīng)過兩步反應，直接得到左旋肉堿，光學純度高達95%。

4．生物化學法。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：為了解決以上問題，本發(fā)明的第一個目的在于提供一種催化合成l-左旋肉堿的生物酶。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種編碼所述催化合成左旋肉堿的生物酶的核苷酸序列。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種催化合成左旋肉堿的生物酶的發(fā)酵方法。

本發(fā)明的第四個目的是提供從發(fā)酵液中制備催化合成l-左旋肉堿的生物酶的提取方法。

技術方案：本發(fā)明的技術方案如下：

一種催化合成左旋肉堿的生物酶，所述生物酶為seqidno：2所示的氨基酸序列。

根據(jù)本發(fā)明所述催化合成左旋肉堿的生物酶，所述生物酶來源于體外重組構建的基因工程菌株。

根據(jù)本發(fā)明所述催化合成左旋肉堿的生物酶，所述基因工程菌株為大腸桿菌、畢氏酵母、枯草芽孢桿菌。

本發(fā)明還提供一種編碼所述的催化合成左旋肉堿的生物酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列如seqidno：1所示。

本發(fā)明還提供一種所述的催化合成左旋肉堿的生物酶的制備方法，包括如下步驟：

（1）首先構建l-左旋肉堿的基因工程菌株，將權利要求3所述的核苷酸序列經(jīng)酶切重組到表達載體，轉化到宿主細胞中；

（2）將陽性克隆挑入lb液體培養(yǎng)基活化后轉接入lb液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，經(jīng)發(fā)酵，得到含有催化合成l-左旋肉堿的生物酶。

本發(fā)明所述的催化合成左旋肉堿的生物酶提取方法，包括如下步驟：

（1）取原種菌種在斜面培養(yǎng)基劃線，37℃，倒置培養(yǎng)16h。

（2）在斜面上挑取2環(huán)菌種至5ml種子培養(yǎng)基（50ml試管）中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)14小時，制備一級種子液。

（3）試管菌種轉接至200ml培養(yǎng)基（500酶量三角瓶）中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)8小時，制備二級種子液。

（4）以5%的接種量接種到30l發(fā)酵培養(yǎng)基中（50l發(fā)酵罐），ph7.0±02，溫度37±0.5℃，通氣、攪拌、補糖、培養(yǎng)，通過iptg誘導16-18h，高速離心，收集菌體細胞。

（5）發(fā)酵液降溫至0-4℃，管式離心機高速離心，收集菌泥。

（6）菌泥凍干制酶制劑凍干粉。

有益的效果：本發(fā)明提供的l-左旋肉堿的生物合成采用生物酶法催化兩步合成l-左旋肉堿；本發(fā)明提供的酶同時包含催化合成使用的輔酶（nad和nadh，而且形成內循環(huán)），無需另外補加，大大降低生產(chǎn)成本，并采用現(xiàn)代化的先進分離技術，使l-左旋肉堿的工業(yè)化生產(chǎn)確實有效實行。

具體實施方式

以下結合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明所應用：

lb培養(yǎng)基配方：10g蛋白胨，5g酵母粉，10gnacl，；加蒸餾水完全溶解后定容至1000ml，高壓滅菌；

lb固體培養(yǎng)基：lb培養(yǎng)基補充加入0.8%瓊脂，高壓滅菌；

m9培養(yǎng)基：12.8gna2po4·7h2o、3.0gkh2po4、0.5gnacl、1.0gnh4cl加雙蒸水1000ml溶解，121度滅菌15分鐘，

m9調整培養(yǎng)基：1000mlm9培養(yǎng)基補充加入1m的mgso42ml，20%的葡萄糖溶液20ml，1m的cacl20.1ml，蛋白胨10g，酵母粉5g。

氨芐青霉素母液：5g氨芐青霉素溶于雙蒸水，定容至1000ml，用0.22μ過濾器除菌；

iptg母液：20giptg溶于雙蒸水，定容至1000ml，用0.22μ過濾器除菌；

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母浸出物0.5%，氯化鈉1%，瓊脂2%，淀粉1%，ph自然。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母浸出物0.5%，氯化鈉1%，ph值自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：調整后的m9培養(yǎng)基。

補料培養(yǎng)基：60%葡萄糖，ph值自然

實施例1：生物酶的基因工程菌株構建

將全基因合成的生物酶片段（序列如seqidno：1所示），經(jīng)限制性內切酶，在雙酶切位點ndei和hindiii，重組到pet21a（＋）（購于navogen公司），并轉入bl21(de3)感受態(tài)細胞(購于天根生化科技(北京)有限公司)，獲得表達蛋白酶及輔酶的基因工程菌，該菌株命名為dhkr-pet21a。

實施例2：生物酶的發(fā)酵

取原種菌種dhkr-pet21a在斜面培養(yǎng)基劃線，37℃，倒置培養(yǎng)16h。在斜面上挑取2環(huán)菌種至5ml種子培養(yǎng)基（50ml試管）中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)14小時，試管菌種轉接至200ml培養(yǎng)基（500酶量三角瓶）中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)8小時，制備二級種子液，od600=3-4制備種子液。將發(fā)酵培養(yǎng)基按每升料配置好后，轉移至50l發(fā)酵罐中，121℃滅菌30min；降溫后控制溫度為37℃，加入50mg/ml的氨芐青霉素母液12-120ml。以5%的接種量，將培養(yǎng)好的二級菌種接種至30l發(fā)酵培養(yǎng)基中（50l發(fā)酵罐），溫度37±0.5℃，ph7.0±0.5，轉速200-500rpm/min，通氣量30-60l/min，以210-600ml/h的速度補加60%的葡萄糖溶液，培養(yǎng)至發(fā)酵液od至達到34-37，補加15-75mliptg母液，1h時間降溫至32±05℃，誘導16-18h，得到含左旋肉堿合成酶及輔酶的發(fā)酵液。

實施例3：生物酶的提取

發(fā)酵液降溫至0-4℃，使用管式離心機高速離心，將液體全部清除，收集沒有流動態(tài)的菌泥，真空冷凍干燥獲得酶制劑。

實施例4：生物酶催化合成左旋肉堿

工藝以4-氯乙酰乙酸乙酯為原料，經(jīng)過生物酶催化合成

向水中添加4-氯乙酰乙酸乙酯和異丙醇，調節(jié)反應體系ph至7.0±0.5，溫度25-30℃，加入生物酶制劑催化合成反應24h，反應液通過減壓蒸餾，收集冷凝液獲得不含無法后處理雜質的4-氯-3羥基-丁酸乙酯，添加三甲胺和naoh反應生成左旋肉堿

本說明書描述了一些實施方式，然而應理解，本領域技術人員通過閱讀本說明書可獲知不背離本發(fā)明的構思和范圍的各種改進。因此，這些其他實施方式也應當包括在所附權利要求書范圍內。

序列表

seqidno：1

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seqidno：2

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