本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中，柯薩奇病毒a6型毒株wf057r及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

柯薩奇病毒(coxsackievirus，cv)為單股正鏈rna病毒，屬于小rna病毒科，腸道病毒屬。柯薩奇病毒顆粒為二十面體立體對稱，呈球形，直徑約23～33nm，核衣殼裸露，無包膜和突起；柯薩奇病毒基因組只包含一個(gè)開放閱讀框架(orf)，編碼一個(gè)較長的多聚蛋白前體。該orf依次分為p1、p2和p33個(gè)區(qū)，其中p1區(qū)編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白vp1～vp4，組成病毒衣殼。p2和p3區(qū)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白。

柯薩奇病毒是引起兒童手足口病(hfmd)的主要病原體，尤其是3歲以內(nèi)的嬰幼兒，能夠?qū)е缕鋰?yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。引起hfmd的腸道病毒(evs)主要包括四種類型：ev-a、ev-b、ev-c和ev-d?？滤_奇病毒a6型(cva6)屬于腸道病毒a組，共16個(gè)亞型，其中亞型a組11個(gè)和b組5個(gè)。根據(jù)基因型的不同，cva6劃分為a～e五個(gè)分支，e基因型又分為e1和e2基因亞型。自2008年cva6首次爆發(fā)于芬蘭以來，e2亞型成為世界范圍內(nèi)流行的主要基因型。臨床數(shù)據(jù)表明，相比經(jīng)典的hfmd病例，e2亞型cva6感染人后往往會導(dǎo)致更嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。更重要的是，該病毒感染會導(dǎo)致嚴(yán)重的皰疹性咽峽炎，甚至引起新生兒的死亡。同時(shí)，該亞型病毒在流行季節(jié)很容易跟其它型腸道病毒混合感染，給疾病的治療和診斷帶來很多困難。

在2010年之前，hfmd主要由ev71和ca16兩種類型腸道病毒引起，關(guān)于cva6的報(bào)道非常少。近幾年，cva6在全世界范圍內(nèi)流行，尤其是泛太平洋地區(qū)，包括中國臺灣、新加坡、日本和泰國等，很多地區(qū)cva6已取代ev71和ca16成為導(dǎo)致hfmd的主要流行株。自2011至2015年，歐洲和北美等其它國家和地區(qū)流行的腸道病毒也是cva6。目前，在中國大陸的很多城市cva6呈現(xiàn)爆發(fā)式流行，比如深圳、上海和青島等地，其發(fā)病率和死亡率逐年升高。所以，e2型cva6已逐漸成為在全世界范圍內(nèi)流行且能導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥的hfmd病原體。

由于其它型腸道病毒(非ev71和非ca16)所引起的臨床表現(xiàn)輕微，致病性較弱，并未引起人們對cva6的關(guān)注。最近的報(bào)告表明，近期流行的e2型cva6感染會導(dǎo)致嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)急性并發(fā)癥，如無菌性腦膜炎、腦干腦炎、和急性弛緩性麻痹等。目前關(guān)于手足口病的發(fā)病機(jī)制還不清楚，特別是cva6的致病機(jī)理尚未報(bào)道，篩選抗cva6藥物和疫苗缺乏穩(wěn)定的動物感染模型，抗cva6藥物和疫苗的開發(fā)也受到制約，究其原因缺乏一合適的cva6感染動物模型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何治療和/或預(yù)防柯薩奇病毒a6型所致疾病。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種柯薩奇病毒a6型毒株。

本發(fā)明所提供的柯薩奇病毒a6型毒株，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為cgmccno.13393，該毒株的名稱為wf057r。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了與所述柯薩奇病毒a6型毒株基因組rna相關(guān)的生物材料，所述生物材料為下述b1)至b5)中的任一種：

b1)編碼所述柯薩奇病毒a6型毒株基因組rna的核酸分子；

b2)含有b1)所述核酸分子的表達(dá)盒；

b3)含有b1)所述核酸分子的重組載體、或含有b2)所述表達(dá)盒的重組載體；

b4)含有b1)所述核酸分子的重組微生物、或含有b2)所述表達(dá)盒的重組微生物、或含有b3)所述重組載體的重組微生物；

b5)含有b1)所述核酸分子的細(xì)胞系、或含有b2)所述表達(dá)盒的細(xì)胞系。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了預(yù)防和/或治療柯薩奇病毒所致疾病的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品含有含有a1)或a2)：

a1)所述柯薩奇病毒a6型毒株的抗血清；

a2)所述生物材料。

所述產(chǎn)品可僅以上述a1)或a2)作為活性成分，還可以將a1)或a2)與其他具有相同功能的物質(zhì)組合在一起作為活性成分。

上述產(chǎn)品可為疫苗或藥物。

上述產(chǎn)品中，所述抗血清按照包括如下步驟的抗血清制備方法制備：對動物注射滅活的所述柯薩奇病毒a6型毒株，收集血清得到所述抗血清。

所述抗血清制備方法中，所述柯薩奇病毒a6型毒株的注射量以及收集血清的時(shí)間均可根據(jù)具體情況進(jìn)行調(diào)整，只要實(shí)現(xiàn)所述動物體內(nèi)出現(xiàn)免疫反應(yīng)即可。

上述產(chǎn)品中，所述抗血清均可為抗所述柯薩奇病毒a6型毒株的抗血清。

上述產(chǎn)品中，所述動物可為哺乳動物。所述哺乳動物具體可為小鼠(如icr小鼠)。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述的抗血清制備方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述柯薩奇病毒a6型毒株，或所述生物材料，或所述產(chǎn)品的下述任一應(yīng)用：

x1)在制備預(yù)防和/或治療柯薩奇病毒a6型所致疾病產(chǎn)品中的應(yīng)用；

x2)在預(yù)防和/或治療柯薩奇病毒a6型所致疾病中的應(yīng)用；

x3)在制備柯薩奇病毒a6型感染動物模型中的應(yīng)用。

本發(fā)明篩選了一株具有代表性的cva6毒株wf057r，利用該毒株制備的疫苗和cva6抗血清具有治療和預(yù)防cva6所致疾病的作用，并且cva6毒株wf057r的母傳抗體對新生乳鼠也具有保護(hù)作用；利用本發(fā)明的cva6毒株wf057r還可以構(gòu)建穩(wěn)定且重復(fù)性好的柯薩奇病毒a6型感染動物模型，該模型可為下一步進(jìn)行藥物的抗病毒治療和評估病毒滅活疫苗的免疫保護(hù)效果提供研究工具。

生物材料保藏說明

生物材料的分類命名：柯薩奇病毒a6型(coxsackievirus)

生物材料的菌株編號：wf057r

生物材料的保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心

生物材料的保藏單位簡稱：cgmcc

生物材料的保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101

生物材料的保藏日期：2016年12月26日

生物材料的保藏中心登記入冊編號：cgmccno.13393

附圖說明

圖1為不同感染條件組合下接種cva6毒株wf057r乳鼠的臨床表現(xiàn)、體重變化及生存率變化。a-c分別為5日齡乳鼠不同接種劑量和不同接種途徑組合；d-f為不同劑量經(jīng)im途徑接種3、7、9日齡乳鼠。

圖2為5日齡乳鼠接種cva6后不同組織內(nèi)病毒載量的變化。a-c的接種劑量均為10^5.5tcid50/只，a為5日齡乳鼠經(jīng)肌肉注射感染cva6病毒后各組織病毒載量隨感染天數(shù)變化情況，b為5日齡乳鼠經(jīng)腹腔注射感染cva6病毒后各組織病毒載量隨感染天數(shù)變化情況，c為5日齡乳鼠經(jīng)腦內(nèi)注射感染cva6病毒后各組織病毒載量隨感染天數(shù)變化情況；d-f的接種劑量均為10⁷tcid50/只，d為5日齡乳鼠經(jīng)肌肉注射感染cva6病毒后各組織病毒載量隨感染天數(shù)變化情況，e為5日齡乳鼠經(jīng)腹腔注射感染cva6病毒后各組織病毒載量隨感染天數(shù)變化情況，f為5日齡乳鼠經(jīng)腦內(nèi)注射感染cva6病毒后各組織病毒載量隨感染天數(shù)變化情況。其中，log的底數(shù)均為10。

圖3為5日齡乳鼠感染310ld50劑量cva6后1～5dpi外周血中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)變化。cva6代表接毒組，nc代表未接毒組，縱坐標(biāo)的c表示表達(dá)量。

圖4為新生乳鼠感染cva6毒株wf057r后大腦組織的he染色和ihc結(jié)果。a:5dpi的he染色；b:he陰性對照；c:5dpi的ihc染色；d：ihc陰性對照。a和b放大200x，c和d放大400x。

圖5為新生乳鼠感染cva6毒株wf057r后心臟組織的he染色和ihc結(jié)果。a:5dpi的he染色；b:he陰性對照；c:5dpi的ihc染色；d：ihc陰性對照。a～d放大200x。

圖6為新生乳鼠感染cva6毒株wf057r后肺臟組織的he染色和ihc結(jié)果。a:5dpi的he染色；b:he陰性對照；c:5dpi的ihc染色；d：ihc陰性對照。a～d放大200x。

圖7為新生乳鼠感染cva6毒株wf057r后骨骼肌的he染色和ihc結(jié)果。a:5dpi的he染色；b:he陰性對照；c:5dpi的ihc染色；d：ihc陰性對照。a～d放大200x。

圖8為新生乳鼠感染cva6毒株wf057r后腸道的he染色和ihc結(jié)果。a:5dpi的he染色；b:he陰性對照；c:5dpi的ihc染色；d：ihc陰性對照。a～d放大200x。

圖9為cva6抗血清在體內(nèi)通過被動免疫對乳鼠的保護(hù)作用。

圖10為cva6滅活全病毒免疫雌鼠母傳抗體對乳鼠的保護(hù)作用。

圖11為cva6抗血清體內(nèi)對不同發(fā)病程度乳鼠的治療效果。其中，cva6表示cva6對照組乳鼠。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑、儀器等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

下述實(shí)施例中的rd細(xì)胞(陳國清，王瑤，許曉慶，邵榮標(biāo).腸道病毒ev71和cva6分離效果的影響因素分析[j].江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，2015，26(4):4-5.)為人橫紋肌瘤rd細(xì)胞(rhabdomyomacell)，由山東省疾病預(yù)防與控制中心病毒性傳染病防制所惠贈，經(jīng)山東省疾病預(yù)防與控制中心病毒性傳染病防制所同意后公眾可從申請人處獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

下述實(shí)施例中的mem維持液為gibco產(chǎn)品。

下述實(shí)施例中的乳鼠、雌鼠與成年鼠均為北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司的spf級icr小鼠。其中，5日齡乳鼠的體重為4±0.5g。

下述實(shí)施例中的柯薩奇病毒的不同地方臨床分離株

wh15066/shandong/china/2015、dy003r/shandong/china/2015、dy005r/shandong/china/2015和lw03r/shandong/china/2015均為柯薩奇病毒a6型(cva6)毒株，其中wh15066/shandong/china/2015的基因組序列為將ncbi中的genbank號為ky126092.1的序列中的t替換為u得到的序列，

dy003r/shandong/china/2015的基因組序列為將ncbi中的genbank號為ky126089.1的序列中的t替換為u得到的序列，dy005r/shandong/china/2015的基因組序列為將ncbi中的genbank號為ky126090.1的序列中的t替換為u得到的序列，

lw03r/shandong/china/2015的基因組序列為將ncbi中的genbank號為ky126091.1的序列中的t替換為u得到的序列，公眾可從申請人處獲得這些生物材料，這些生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

實(shí)施例1、柯薩奇病毒a6型(cva6)毒株wf057r的分離與鑒定

發(fā)明人于2015年從山東省一名手足口患兒糞便中分離得到一柯薩奇病毒a6型(coxsackievirus)毒株，將該毒株命名為wf057r?？滤_奇病毒a6型(coxsackievirus)毒株wf057r已于2016年12月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏編號為cgmccno.13393。

實(shí)施例2、利用柯薩奇a6病毒毒株wf057r制備cva6感染動物模型

一、wf057r的培養(yǎng)

將rd細(xì)胞接種于培養(yǎng)基1(培養(yǎng)基1為向mem維持液中添加胎牛血清、青霉素和鏈霉素得到的液體，其中胎牛血清的質(zhì)量百分濃度為10％，青霉素的質(zhì)量百分濃度為1％，鏈霉素的質(zhì)量百分濃度為1％)中，于溫度為37℃、5％濃度co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到rd細(xì)胞培養(yǎng)液。將實(shí)施例1的柯薩奇a6病毒毒株wf057r接種于rd細(xì)胞培養(yǎng)液中的rd細(xì)胞上，至細(xì)胞出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect，cpe)面積超過80％時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，得到cva6毒株wf057r病毒液，于96孔板通過有限稀釋法進(jìn)行病毒定量，測定病毒tcid50后分裝于離心管中，保存于-80℃冰箱。

二、cva6感染動物模型的制備

通過肌肉注射(intramuscularinjection，im)、腹腔注射(intraperitonealinjection，ip)和顱腔注射(intracerebralinjection，ic)三種不同的感染途徑分別與10⁴、10^5.5、10⁷tcid50/只三種不同的感染劑量相組合，探索建立3日齡乳鼠cva6感染模型最佳的接種途徑和感染劑量。確定最佳接種途徑后，再經(jīng)此途徑分別與10^5.5和10⁷tcid50/只兩種感染劑量組合探索cva6對大日齡(5、7、9日齡)乳鼠的致病情況，最終確定建立cva6模型的最佳日齡、接種途徑和感染劑量，感染條件組合見表1。利用文獻(xiàn)(maoq,wangy,gaor,shaoj,yaox,langs,wangc,maop,liangz,wangj.aneonatalmousemodelofcoxsackievirusa16forvaccineevaluation.jvirol.2012；86(22):11967-76.)中的方法，依據(jù)reed&muench公式計(jì)算5日齡乳鼠的半數(shù)致死量ld50(reedlj,muenchh.asimplemethodofestimating50percentend-points.am.j.hyg.1938,27:493-497.)。乳鼠感染cva6毒株wf057r后1天(1daypostinfection，1dpi)～12dpi連續(xù)觀察感染乳鼠的臨床表現(xiàn)、體重變化及生存率變化。每組均設(shè)置陰性對照組(ns)，即以相同的接種途徑注射等體積的生理鹽水。

注:肌肉接種，im；腹腔接種，ip；顱腔接種，ic；生理鹽水，ns。

臨床評分標(biāo)準(zhǔn)：為評價(jià)病毒株對乳鼠致病的嚴(yán)重程度，對不同的臨床表現(xiàn)賦予不同的分值，本研究采用常用的臨床評分標(biāo)準(zhǔn)(表2)。

表2、臨床標(biāo)準(zhǔn)評分

結(jié)果顯示，對照組相同日齡各小鼠的體重、生存率及臨床得分均無顯著差異。5日齡乳鼠經(jīng)im、ip和ic感染劑量為10⁴tcid50cva6毒株wf057r的實(shí)驗(yàn)組平均體重相對陰性對照組未表現(xiàn)出體重下降(圖1中a)，平均臨床評分均呈現(xiàn)出一過性癥狀(圖1中b，三種接種方式在10-12dpi的臨床得分均為0)，最終生存率分別為30％、50％和100％(圖1中c)，這表明不適合用10⁴tcid50劑量感染5日齡乳鼠來建立cva6動物模型。5日齡乳鼠經(jīng)im、ip感染劑量為10^5.5tcid50的實(shí)驗(yàn)組平均體重相對陰性對照組表現(xiàn)出顯著下降，9dpi10^5.5tcid50-im組和10^5.5tcid50-ip組體重相對于陰性對照組體重分別下降了51.47％和22.42％(圖1中a)；10^5.5tcid50-im組和10^5.5tcid50-ip組約4dpi表現(xiàn)出后肌無力，隨著感染天數(shù)增加依次出現(xiàn)單后肢癱瘓、雙后肢肌癱瘓、瀕死及極小部分乳鼠逐漸恢復(fù)健康等癥狀，而10^5.5tcid50-ic組平均臨床評分僅表現(xiàn)出一過性后肌無力癥狀(圖1中b)；10^5.5tcid50-im組、10^5.5tcid50-ip組和10^5.5tcid50-ic組最終生存率分別為0、10％和40％(圖1中c)，這表明經(jīng)im感染10^5.5tcid50劑量cva6毒株wf057r較為適合建立5日齡cva6感染模型。5日齡乳鼠經(jīng)im、ip和ic感染劑量為10⁷tcid50的實(shí)驗(yàn)組平均體重相對陰性對照組出現(xiàn)體重顯著下降，于感染后6dpi～7dpi全部死亡，存活時(shí)間較短，不利于感染模型的建立(圖1中c)。10^5.5tcid50(相當(dāng)于310ld50)經(jīng)im途徑接種不同日齡(3、7、9)乳鼠后，3日齡乳鼠接種后癥狀明顯，平均臨床評分5(圖1中e)，存活時(shí)間短，感染后7天全部死亡(圖1中f)；7和9日齡乳鼠由于日齡大的緣故，相比對照組體重變化小(圖1中d)，死亡率低(圖1中f)，均不適合模型的建立。因此，選擇經(jīng)im途徑接種5日齡乳鼠、劑量為10^5.5tcid50/只(310ld50)作為建立乳鼠感染模型的條件。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)證明在該劑量、該途徑條件下接種5日齡乳鼠后臨床癥狀典型，平均臨床得分為5，乳鼠感染后9天全部死亡，個(gè)體的發(fā)病時(shí)間和死亡率穩(wěn)定，有非常高的可重復(fù)性。

三、核酸提取、病毒載量檢測及病毒變異檢測

對于5日齡乳鼠分別接種10^5.5tcid50和10⁷tcid50劑量的乳鼠，感染后1dpi、3dpi、5dpi各組分別處死3只，取腦、心臟、肺臟、脾臟、后肢肌、腸道和血液，充分研磨后取0.01g上述各組織研磨物分別置于1.5ml無菌離心管中，加0.01mpbs至1ml，9000rpm4℃離心10min，取離心后上清液用trizol法提取病毒核酸，檢測各組織中病毒載量隨時(shí)間的變化，初步判斷cva6毒株wf057r在體內(nèi)的組織嗜性和載量變化。

trizol法提取病毒rna后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲取cdna，反轉(zhuǎn)錄在abisimpliamp^tmthermalcyclerpcr儀上進(jìn)行，使用takaraprimescript^tmrtreagentkit(perfectrealtime)，總體積為10μl，其中：5×primescriptbuffer(forrealtime)2μl，primescriptrtenzymemixi0.5μl，random6mers1μl以及待測樣本rna6.5μl。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42℃，45min(×1)；85℃，5s(×1)；4℃，∞。通過熒光定量pcr進(jìn)行病毒載量的定量，于abi7500fast熒光定量pcr儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系總體積為25μl，其中：goldstartaqmanmixture(cw2625m，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)12.5μl；cva6熒光定量特異性上游引物cva6-f(25μm)0.625μl；特異性下游引物cva6-r(25μm)0.625μl；cva6特異性探針(25μm)0.625μl；rnase-freewater8.625μl；待測cdna模板量2μl。熒光定量pcr反應(yīng)條件：95℃，10min(×1)；95℃，15s(×40)；60℃，1min(×40)，于每個(gè)循環(huán)60℃，1min結(jié)束后檢測熒光。其中上游引物cva6-f序列：cctgaatgcggctaatcc；下游引物cva6-r序列：ttgtcaccatwagcagyca；探針序列：5’fam-ccgactactttgggwgtccgtgt-3’bhq1。將利用cva6-f與cva6-r對cva6毒株wf057r核酸進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到的pcr產(chǎn)物(dsdna)與t載體構(gòu)建質(zhì)粒，檢測質(zhì)粒濃度作為標(biāo)準(zhǔn)品，10倍倍比稀釋后備用。每次進(jìn)行熒光定量pcr時(shí)載體標(biāo)準(zhǔn)品每個(gè)稀釋度均設(shè)三個(gè)重復(fù)孔，取三個(gè)重復(fù)孔ct值的平均值作為對應(yīng)稀釋度的最終ct值。

為研究病毒在感染后不同感染階段和在乳鼠體內(nèi)不同器官內(nèi)的載量分布，采用310ld50劑量(10^5.5tcid50/只)、經(jīng)im途徑感染5日齡乳鼠，1、3和5dpi檢測病毒載量，發(fā)現(xiàn)感染后病毒載量在各組織中變化幅度較大?？傮w上呈現(xiàn)1～3dpi時(shí)間段內(nèi)各組織病毒含量迅速升高而5dpi后病毒含量上升速度下降的趨勢。1dpi血液中病毒核酸含量非常低，但3dpi很快達(dá)到峰值6log(拷貝數(shù)/ml血液)，這一病毒血癥的出現(xiàn)時(shí)間，與乳鼠的臨床表現(xiàn)(包括行為、體重下降等)出現(xiàn)的時(shí)間是相對應(yīng)的。5dpi心臟和肺臟中病毒含量高達(dá)7～8log(拷貝數(shù)/mg組織)，病毒的高含量導(dǎo)致肺臟出現(xiàn)嚴(yán)重的病毒性肺炎。骨骼肌(后肢肌)中病毒含量最高達(dá)到10log(拷貝數(shù)/mg組織)，是各時(shí)間點(diǎn)其它組織器官中病毒含量的10²～10⁴倍，表明骨骼肌是乳鼠體內(nèi)病毒復(fù)制最為活躍的部位，也表明病毒經(jīng)肌肉途徑進(jìn)入血液系統(tǒng)，通過血液流動迅速遍布全身。不同接種途徑后肢肌中病毒含量最高，說明wf057r株有強(qiáng)烈的肌肉組織嗜性，也說明肌肉是病毒主要復(fù)制的場所(圖2中a～c)。在均經(jīng)im途徑感染10⁴ld50劑量(10⁷tcid50/只)后，1～5dpi病毒在各組織中含量變化趨勢與感染劑量310ld50劑量(10^5.5tcid50/只)變化趨勢相似，但高劑量病毒接種后腦、血液、肺臟、脾臟中病毒載量顯著升高(p<0.05)，而ip和ic感染途徑病毒載量與低劑量接種變化不顯著(圖2)。圖2中，log的底數(shù)均為10；當(dāng)樣本為血液時(shí)，log(拷貝數(shù)/ml)表示log(拷貝數(shù)/ml血液)；當(dāng)樣本為其他組織時(shí)，log(拷貝數(shù)/ml)表示log(拷貝數(shù)/mg組織)。

另外，為檢測病毒感染5日齡乳鼠后在其體內(nèi)是否會發(fā)生基因突變，pcr擴(kuò)增cva6毒株wf057r感染乳鼠1、3和5dpi各組織中cva6病毒完整vp1片段，產(chǎn)物回收后測序，通過mega5.05軟件進(jìn)行序列比對，檢測核苷酸及氨基酸序列是否發(fā)生突變。擴(kuò)增vp1基因上游引物vp1-f為：5’-ggagatagggtggcagatgt-3’；下游引物vp1-r為：5’-aagggtggtgatcgatgtgc-3’。結(jié)果顯示，各組織中病毒的序列均未發(fā)生變化。

四、感染模型血漿細(xì)胞因子表達(dá)水平變化情況

5日齡乳鼠經(jīng)im感染310ld50(10^5.5tcid50/只)cva6毒株wf057r后采集1～5dpi外周血漿，通過細(xì)胞因子elisa檢測試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)檢測不同感染階段乳鼠模型血漿中ifn-γ、tnf-α、il-1β、il-4、il-6、il-10、il-13和il-18表達(dá)量的變化，以了解上述炎性細(xì)胞因子在重癥cva6感染階段發(fā)揮免疫病理損傷的作用。各細(xì)胞因子的檢測下限分別為：ifn-γ(1.74pg/ml)、tnf-α(1.63pg/ml)、il-1β(1.03pg/ml)、il-4(0.22pg/ml)、il-6(1.17pg/ml),il-10(1.17pg/ml),il-13(1.17pg/ml),il-18(0.21pg/ml)。

研究表明，cva6毒株wf057r感染初期外周血中細(xì)胞因子ifn-γ、tnf-α、il-6、il-10、il-13和il-18(2dpi和3dpi除外)表達(dá)量相對于陰性對照組均有不同程度的高表達(dá)(圖3)。其中，細(xì)胞因子ifn-γ和il-6表現(xiàn)出與人類相似的表達(dá)趨勢(hanj,wangy,ganx,songj,sunp,dongxp.serumcytokineprofilesofchildrenwithhumanenterovirus71-associatedhand,foot,andmouthdisease.jmedvirol.2014.；linty,changly,huangyc,etal.differentproinflammatoryreactionsinfatalandnon-fatalenterovirus71infections:implicationsforearlyrecognitionandtherapy.actapaediatr.2002；91:632-5.)，呈現(xiàn)爆發(fā)性增高，峰值超過2000pg/ml，且均呈現(xiàn)隨感染天數(shù)的增加先升高后降低的現(xiàn)象。il-10表達(dá)量在感染初期(2dpi)即上升到最高40.13pg/ml，繼而呈現(xiàn)平穩(wěn)降低的趨勢；同樣，il-13表達(dá)量在感染初期高水平表達(dá)，但隨著感染天數(shù)增加表達(dá)量快速降低。感染后期(5dpi)，tnf-α表達(dá)量逐漸增高，達(dá)到102pg/ml；il-18在整個(gè)感染階段表達(dá)量相對于陰性對照無顯著差異(p>0.05)；il-1β和il-4自始至終均無可檢測的含量表達(dá)。以上數(shù)據(jù)說明，cva6毒株wf057r感染乳鼠后誘導(dǎo)了細(xì)胞因子——ifn-γ、il-6、tnf-α、il-10和il-13的表達(dá)，誘發(fā)乳鼠的免疫反應(yīng)與炎癥反應(yīng)，ifn-γ和il-6可能是cva6乳鼠實(shí)驗(yàn)感染早期炎癥反應(yīng)的主要誘發(fā)因素，并且細(xì)胞因子tnf-α、il-10和il-13可能也在cva6毒株wf057r感染的免疫病理損傷中發(fā)揮重要作用。

五、病理學(xué)檢查(he)及免疫組織化學(xué)檢查(ihc)

在最終確定建立cva6感染模型最佳組合條件后，以此條件(im途徑接種5日齡乳鼠、劑量為10^5.5tcid50/只(310ld50))建立乳鼠cva6感染模型，1～5dpi內(nèi)每天處死3只wf057r感染乳鼠，取其腦、心臟、肺臟、脾臟、后肢肌、腸道和血液；血液常溫10,000rpm離心10min后，取上層血漿保存于-20℃；其余臟器10％中性福爾馬林固定48h后經(jīng)石蠟包埋制作石蠟切片用以進(jìn)行he染色和免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,ihc)檢測。對于免疫組化檢測，石蠟切片經(jīng)過60℃烤片1h、酒精梯度脫蠟、edta抗原修復(fù)、脫水，一抗cva6多克隆抗體(1：200稀釋)4℃孵育過夜，加二抗(1：1000稀釋，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)室溫孵育30min后滴加dab顯色，蘇木素反藍(lán)。陰性對照組切片一抗采用陰性血清。顯微鏡下檢測結(jié)果。其中，一抗cva6多克隆抗體為利用cva6的vp1蛋白兩次免疫8周齡icr成年鼠得到的多克隆抗體。

通過he染色對經(jīng)肌肉注射感染cva6毒株wf057r的5日齡乳鼠的腦、心、肺臟、后肢肌和腸道進(jìn)行病理學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)感染晚期，出現(xiàn)了全身多臟器的損傷和炎癥反應(yīng)。

1)腦：病理學(xué)檢查顯示腦局部發(fā)生明顯的病理變化，腦在3dpi開始出現(xiàn)局部腦膜及腦實(shí)質(zhì)水腫(圖1中a箭頭所示)。腦免疫組化發(fā)現(xiàn)自3dpi開始腦皮質(zhì)出現(xiàn)大量病毒抗原，隨著感染天數(shù)的增長病毒抗原彌漫分布于腦皮質(zhì)(圖4中c)，陰性對照組腦組織切片并未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化(圖4中b)和抗原染色(圖4中d)。

2)心臟：he染色發(fā)現(xiàn)乳鼠感染cva65dpi心臟局部便出現(xiàn)血管擴(kuò)張充血，局部淋巴浸潤，心臟局部出現(xiàn)間質(zhì)水腫，心肌纖維溶解，局部伴脂肪變性及毛細(xì)血管滲漏，并可見紅細(xì)胞缺氧表現(xiàn)(圖5中a箭頭所示)。而免疫組化檢查發(fā)現(xiàn)cva6抗原于心臟呈彌漫性分布(圖5中c)，陰性對照組心臟切片并未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化(圖5中b)和特異性抗原染色(圖5中d)。

3)肺臟：he染色發(fā)現(xiàn)cva6感染會導(dǎo)致乳鼠發(fā)生病毒性肺炎，表現(xiàn)為彌漫性肺實(shí)質(zhì)、肺泡和間質(zhì)纖維化及大量淋巴細(xì)胞浸潤和肺泡萎縮、塌陷(圖6中a箭頭所示)。免疫組化發(fā)現(xiàn)cva6抗原彌漫性分布與整個(gè)肺臟(圖6中c)，陰性對照組肺臟切片并未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化(圖6中b)和特異性抗原染色(圖6中d)。

4)骨骼?。篽e染色顯示乳鼠感染cva63dpi骨骼肌出現(xiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤、局部間質(zhì)水腫和少量纖維組織增生，隨著感染天數(shù)增加后肢肌出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤、間質(zhì)水腫及纖維組織增生范圍擴(kuò)大，并且開始出現(xiàn)局部壞死和肌束斷裂(圖7中a箭頭所示)。免疫組化顯示相對于陰性對照組(圖7中d)cva6感染后3dpi后肢肌病毒開始增多且以點(diǎn)狀分布為主，隨感染天數(shù)的增加cva6在后肢肌程彌漫性分布(圖7中c)，陰性對照組后肢肌切片并未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化(圖7中b)。

5)腸道：he染色發(fā)現(xiàn)乳鼠經(jīng)肌肉注射感染cva63dpi腸道開始出現(xiàn)間質(zhì)水腫，隨著感染天數(shù)的增加出現(xiàn)充血和淋巴細(xì)胞浸潤(圖8中a箭頭所示)，但未發(fā)現(xiàn)腸道壞死。免疫組化檢查發(fā)現(xiàn)，經(jīng)肌肉注射cva6在感染后期彌漫性分布于腸粘膜及腸絨毛(圖8中c)，陰性對照組腸道切片并未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化(圖8中b)和特異性抗原染色(圖8中d)。

六、其他毒株的致病性

按照步驟一的方法，將柯薩奇a6病毒毒株wf057r與原始毒株km114057病毒、kp144344病毒和kj541157病毒分別接種rd細(xì)胞，接種量均為500tcid50，制備cva6不同毒株的病毒液。

其中，km114057病毒為含有序列a所示rna的柯薩奇病毒a6型，序列a為將ncbi中km114057.1(genebank號)中的t替換為u得到的序列；kp144344病毒為含有序列b所示rna的柯薩奇病毒a6型，序列b為將ncbi中kp144344.1(genebank號)中的t替換為u得到的序列；kj541157病毒為含有序列c所示rna的柯薩奇病毒a6型，序列c為將ncbi中kj541157.1(genebank號)中的t替換為u得到的序列。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分別感染這km114057、kp144344和kj541157病毒(500tcid50)后產(chǎn)生cpe的時(shí)間要長于毒株wf057r，感染后48小時(shí)細(xì)胞上清中病毒滴度分別為8.2×10⁷、2.7×10⁸和3.6×10⁸tcid50/ml，低于同時(shí)期毒株wf057r病毒滴度1.8×10⁹tcid50/ml，所以該三毒株對細(xì)胞的適應(yīng)性低于毒株wf057r。

按照步驟二中cva6感染動物模型的制備方法，將柯薩奇a6病毒毒株wf057r分別替換為原始毒株km114057病毒、kp144344病毒和kj541157病毒，通過im途徑注射10^5.5tcid50劑量的毒株制備cva6感染動物模型。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過im途徑分別將10^5.5tcid50劑量的三株病毒感染5日齡乳鼠，感染后9天乳鼠的死亡率分別為80％、80％和100％。綜合比較病毒的致病性，毒株wf057r在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中要優(yōu)于km114057、kp144344和kj541157病毒。

實(shí)施例3、以滅活wf057r作為活性的cva6疫苗所產(chǎn)生抗血清可以保護(hù)小鼠和治療cva6所致疾病

1、滅活cva6疫苗的制備

將實(shí)施例2的稀釋后的cva6毒株wf057r病毒液(10⁵tcid50/ml)按1:4000(v/v)的比例利用福爾馬林稀釋后得到病毒稀釋液，將病毒稀釋液于37℃孵育滅活病毒72小時(shí)，得到滅活病毒液；將滅活病毒液與完全弗氏佐劑等體積混合，制成完全乳化液，即為cva6疫苗，cva6疫苗中滅活病毒的含量為5×10⁴tcid50/ml。采用微量滴定法檢測cva6疫苗感染性滴度以觀察其滅活效果。

病毒微量滴定法：每孔按1×10⁴細(xì)胞/100μl培養(yǎng)液(該培養(yǎng)液中的細(xì)胞為rd細(xì)胞，培養(yǎng)基為實(shí)施例2的培養(yǎng)基1)將rd細(xì)胞接種于96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞長至每孔的90％以上，將上述cva6疫苗用含2％胎牛血清的mem培養(yǎng)基按10倍體積梯度稀釋后(稀釋倍數(shù)分別為10倍、10²倍、10³倍和10⁴倍)，以100μl/孔接種于rd細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種8孔，每天觀察記錄細(xì)胞病變。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種不同稀釋度cva6疫苗的rd細(xì)胞均未發(fā)生細(xì)胞病變，表明，上述cva6疫苗中的wf057r均已滅活。

2、cva6疫苗菌檢

將步驟1的cva6疫苗在無菌條件下分別接種營養(yǎng)肉湯和營養(yǎng)瓊脂平板，37℃溫箱培養(yǎng)2天后觀察，發(fā)現(xiàn)均無細(xì)菌生長，菌檢均為陰性。

3、cva6疫苗安全性試驗(yàn)

3.1成年鼠安全性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)試驗(yàn)的具體步驟如下：

取8周齡健康成年鼠(雌雄隨機(jī))20只，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組乳鼠經(jīng)皮下注射步驟1的cva6疫苗，共注射三次，每兩次注射間隔時(shí)間均為1周，三次接種量均為200μl/只；對照組注射完全弗氏佐劑與pbs等體積混合得到的混合液，共注射三次，每兩次注射間隔時(shí)間均為1周，三次接種量均為200μl/只。連續(xù)觀察14天，觀察成年鼠有無發(fā)病、死亡和體重變化。

經(jīng)8周齡成年鼠安全性試驗(yàn)結(jié)果可見，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組成年鼠分別經(jīng)皮下1、2和3次不同免疫次數(shù)注射cva6疫苗，與對照組成年鼠體重?zé)o差異，均無發(fā)病、死亡，處死后均無肉眼可見病變。

3.2乳鼠安全性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)試驗(yàn)的具體步驟如下：

取5日齡齡健康乳鼠(雌雄隨機(jī))20只，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組乳鼠經(jīng)皮下注射步驟1的cva6疫苗，共注射三次，每兩次注射間隔時(shí)間均為1周，三次接種量均為50μl/只；對照組注射完全弗氏佐劑與pbs等體積混合得到的混合液(請核實(shí)對照組注射的液體)，共注射三次，每兩次注射間隔時(shí)間均為1周，三次接種量均為50μl/只。連續(xù)觀察14天，觀察乳鼠有無發(fā)病、死亡和體重變化。

經(jīng)5日齡乳鼠安全性試驗(yàn)結(jié)果可見，3個(gè)組實(shí)驗(yàn)組新生乳鼠分別經(jīng)皮下1、2和3次不同免疫次數(shù)注射cva6疫苗，與對照組乳鼠體重?zé)o差異，均無發(fā)病、死亡，處死后均無肉眼可見病變。

4、抗病毒血清的制備及效價(jià)測定

4.1cva6抗血清的制備

取8周齡健康成年鼠(雌雄隨機(jī))，經(jīng)皮下注射步驟1的cva6疫苗，注射量為200μl/只；cva6疫苗注射35天后采集血液，10,000rpm/min離心后取上清，即為cva6抗血清，無菌條件下分裝，凍存于-80℃?zhèn)溆?。采用微量中和?shí)驗(yàn)測定抗血清的抗體滴度。

4.2微量細(xì)胞中和試驗(yàn)

將步驟4.1的cva6抗血清利用含2％胎牛血清的mem培養(yǎng)基從1:100起開始進(jìn)行2倍梯度體積稀釋，共10個(gè)稀釋度，稀釋比例分別為1:10²、1:2×10²、1:2²×10²、1:2³×10²、1:2⁴×10²、1:2⁵×10²、1:2⁶×10²、1:2⁷×10²、1:2⁸×10²和1:2⁹×10²，得到不同稀釋度的cva6抗血清稀釋液。

將實(shí)施例2的cva6毒株wf057r病毒液(500tcid50/ml)加至96孔板，50μl/孔，再分別加入上述不同稀釋度的cva6抗血清稀釋液，50μl/孔，每孔一個(gè)稀釋度的稀釋液，每種稀釋度的稀釋液三個(gè)復(fù)孔，37℃孵育1h；向每孔中接種rd細(xì)胞培養(yǎng)液(濃度為2×10⁵個(gè)/ml)，100μl/孔，37℃培養(yǎng)7d，觀察細(xì)胞病變情況(cpe)，采用reed-muench法計(jì)算中和抗體效價(jià)。

按照上述微量細(xì)胞中和試驗(yàn)方法對cva6抗血清的中和效價(jià)連續(xù)檢測6次，計(jì)算平均提取方差值ave及變異系數(shù)cv，驗(yàn)證該方法的重復(fù)性。

在體外培養(yǎng)的rd細(xì)胞上對cva6抗血清進(jìn)行2倍連續(xù)稀釋，加入cva6毒株wf057r，通過rd細(xì)胞的病變計(jì)算得到cva6抗血清的抗體效價(jià)為1,024(ave>0.5，cv≤8％)。

5、cva6抗血清通過被動免疫對乳鼠的保護(hù)

為研究cva6抗血清在乳鼠的被動免疫保護(hù)作用，將步驟4.1的cva6抗血清利用生理鹽水進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋(1:10,1:100,1:1,000和1:10,000)，將得到的不同cva6抗血清稀釋液通過靜脈注射的方式接種到4個(gè)實(shí)驗(yàn)組5日齡乳鼠(每組10只)體內(nèi)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組注射一種稀釋梯度的cva6抗血清稀釋液，1個(gè)陰性對照組乳鼠(cva6，10只)注射等體積的分離自未接種cva6健康成年鼠的陰性對照血清，注射體積均為50μl，1h后將致死劑量310ld50(10^5.5tcid50)的cva6病毒毒株wf057r通過肌肉途徑感染各組乳鼠，感染后1天(1dayspostinfection，1dpi)至12dpi連續(xù)觀察感染乳鼠的臨床表現(xiàn)、體重變化及生存率變化情況，采用表2的臨床評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，將正常健康的5日齡乳鼠作為對照(nc)。依據(jù)實(shí)驗(yàn)組乳鼠的生存率，計(jì)算cva6抗血清在乳鼠體內(nèi)的50％有效稀釋度ed50i。

4個(gè)實(shí)驗(yàn)組先接種不同稀釋度的抗體后再感染致死劑量的wf057r，發(fā)現(xiàn)1:10稀釋的cva6抗血清能提供完全的保護(hù)能力，部分乳鼠出現(xiàn)輕微臨床癥狀，評分為1(圖9，四舍五入)，很快恢復(fù)健康；注射1:100稀釋的cva6抗血清的實(shí)驗(yàn)組乳鼠臨床評分最高為3，最終生存率為60％；注射1:1000稀釋的cva6抗血清的實(shí)驗(yàn)組乳鼠在接種病毒后3天開始出現(xiàn)臨床癥狀，感染后10天評分為5，第11天全部死亡；與陰性對照組(圖9中cva6曲線)相比，1:10,000稀釋的cva6抗血清幾乎無保護(hù)作用，乳鼠接種病毒后第10天全部死亡(圖9)。1:10稀釋的cva6抗血清能提供乳鼠100％的保護(hù)力，根據(jù)reed&muench公式(reedandmuench,1938)計(jì)算得到163倍稀釋的cva6抗血清能提供50％的保護(hù)率，所以cva6抗血清在乳鼠體內(nèi)預(yù)防作用的ed50i為1.63。

6、母源抗體對乳鼠的保護(hù)作用

為研究母傳抗體對新生乳鼠的免疫保護(hù)作用，對8周齡雌鼠皮下多點(diǎn)、多次注射步驟1的cva6疫苗200μl進(jìn)行第一次免疫，間隔2周后同樣的方式注射步驟1的滅活病毒液與不完全弗氏佐劑等體積混合得到的完全乳化液200μl以加強(qiáng)免疫。第一次免疫后將雌乳鼠和雄乳鼠交配，第二次免疫后5～10天幼鼠出生。選取5日齡乳鼠分5個(gè)實(shí)驗(yàn)組(10只/組)。

另選取8周齡雌鼠，按照上述方法，將cva6疫苗與完全乳化液均替換為生理鹽水，對雌鼠注射生理鹽水，將其孕育的5日齡乳鼠分5個(gè)對照組(10只/組)。

將各組乳鼠分別經(jīng)im途徑注射致死劑量的310ld50(10^5.5tcid50)的cva6病毒毒株wf057r和不同地方臨床cva6分離株wh15066/shandong/china/2015(300ld50)、dy003r/shandong/china/2015(300ld50)、dy005r/shandong/china/2015(300ld50)和lw03r/shandong/china/2015(300ld50)，每個(gè)毒株的注射劑量均為310ld50，連續(xù)觀察12d并記錄其體重變化、臨床評分(采用表2的臨床評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分)、生存率，以評價(jià)cva6母傳抗體對新生乳鼠感染cva6的保護(hù)作用。采用mantel-coxlog-rank法比較實(shí)驗(yàn)組和對照組乳鼠的生存率。

未免疫母鼠組孕育的乳鼠在接種病毒后體重幾乎沒有增加，臨床癥狀明顯，第6天開始死亡，第9～10天全部死亡。免疫wf057r滅活疫苗的實(shí)驗(yàn)組母鼠孕育的乳鼠接種不同的臨床分離株cva6(wf057r、wh15066、dy003r、dy005r和lw03r)后均無臨床癥狀出現(xiàn)(圖10中左圖)，其體重變化與未接毒組乳鼠無差異(p>0.05)，最終生存率均為100％(圖10中右圖)。數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明利用wf057r毒株制備的cva6疫苗的母傳抗體能提供乳鼠對致死劑量不同地方分離毒株cva6的完全保護(hù)能力。

7、抗血清對發(fā)病乳鼠的臨床治療效果

為研究cva6抗血清對不同發(fā)病程度乳鼠的臨床治療效果，首先采用im途徑對5日齡乳鼠接種致死劑量310ld50(10^5.5tcid50)的cva6病毒毒株wf057r，隔離飼養(yǎng)，具體操作同實(shí)施例2中cva6感染動物模型的制備。于感染后4天開始對感染乳鼠進(jìn)行篩選，選擇臨床得分別為1～2和≥3的乳鼠分別作為發(fā)病早期和晚期2個(gè)實(shí)驗(yàn)組(n＝10只/組)。采用靜脈注射的方式將利用生理鹽水按照1:1、1:10和1:50的體積比稀釋的步驟4.1的cva6抗血清分別注射到3個(gè)不同發(fā)病程度的實(shí)驗(yàn)組乳鼠體內(nèi)，注射體積均為50μl，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均注射不同稀釋度的cva6抗血清，每組中一種稀釋度的cva6抗血清注射10只乳鼠，1個(gè)cva6對照組乳鼠(僅接種cva6，未注射抗血清，10只)注射等體積的陰性對照血清(分離自未接種cva6健康成年鼠)作為對照，連續(xù)觀察12d并記錄其體重變化、臨床癥狀和生存率，以評價(jià)cva6抗血清對發(fā)病乳鼠的臨床治療效果。將正常健康的5日齡乳鼠注射等體積的生理鹽水(ns)作為對照。依據(jù)實(shí)驗(yàn)組乳鼠的生存率，計(jì)算步驟4.1的cva6抗血清在乳鼠體內(nèi)治療作用的50％有效稀釋度ed50ii。采用mantel-coxlog-rank法比較實(shí)驗(yàn)組和對照組乳鼠的生存率。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臨床得分1～2的乳鼠(發(fā)病早期)緊急注射抗體后臨床癥狀逐漸消失，評分降為0(圖11)，體重增加，1:1、1:10和1:50稀釋度的實(shí)驗(yàn)組最終生存率為分別為100％、100％和40％(圖11)。但臨床得分超過3(發(fā)病晚期，即出現(xiàn)單后肢或雙后肢癱瘓甚至瀕死)的乳鼠各稀釋度的cva6抗血清對其都沒有任何保護(hù)作用，和發(fā)病后注射陰性血清組(cva6組)差異不顯著(p>0.05)，死亡率均為100％(圖11)。根據(jù)reed&muench公式計(jì)算得到43倍稀釋的cva6抗血清能提供50％的治愈率，所以cva6抗血清在乳鼠體內(nèi)治療作用的半數(shù)有效量ed50ii為23.81。數(shù)據(jù)表明，出現(xiàn)神經(jīng)癥狀即后肢(單、雙后肢)癱瘓的乳鼠各稀釋度的cva6抗血清對其均沒有任何保護(hù)作用。結(jié)合上面建立的乳鼠感染模型，評分超過3的乳鼠呈現(xiàn)全身多臟器的嚴(yán)重?fù)p傷和炎癥反應(yīng)，神經(jīng)系統(tǒng)已經(jīng)被破壞，大量神經(jīng)元壞死，被吞噬細(xì)胞吞噬；后肢肌中病毒的含量高達(dá)10log，開始出現(xiàn)骨骼肌纖維壞死和肌束斷裂。所以，此時(shí)cva6抗血清中的cva6抗體很難逆轉(zhuǎn)乳鼠的重癥發(fā)展，而對于發(fā)病初期的乳鼠，相比注射陰性血清組抗體的治療效果非常顯著(p<0.005)，治療后逐漸恢復(fù)健康。

8、其他cva6病毒疫苗的效果

按照步驟1滅活cva6疫苗的制備方法，將柯薩奇a6病毒毒株wf057r分別替換為實(shí)施例1的km114057病毒、kp144344病毒和kj541157病毒，其他步驟均不變，制備cva6疫苗，即km114057病毒疫苗、kp144344病毒疫苗和kj541157病毒疫苗。

將km114057病毒疫苗、kp144344病毒疫苗和kj541157病毒疫苗三種疫苗分別按照步驟4的方法經(jīng)皮下接種8周齡成年鼠后35天采集血清，通過微量中和實(shí)驗(yàn)檢測其抗體滴度分別為256、512和512(連續(xù)檢測6次)，低于毒株wf057r抗體滴度(1024)。

按扎偶步驟6的方法，分別利用km114057病毒疫苗、kp144344病毒疫苗和kj541157病毒疫苗三種疫苗免疫8周齡雌鼠，將其生產(chǎn)的5日齡乳鼠經(jīng)im途徑注射致死劑量的310ld50(10^5.5tcid50)的cva6病毒毒株wf057r，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種疫苗誘導(dǎo)母傳抗體對乳鼠致死劑量(310ld50)wf057r的保護(hù)率為70～80％(死亡率為20％～30％)，不能提供完全的保護(hù)。

基于前面工作基礎(chǔ)，發(fā)明人在本次實(shí)驗(yàn)中對疫苗免疫組的乳鼠做了全面的病理學(xué)檢查，尤其注意是否存在疫苗免疫動物在病毒攻擊后所出現(xiàn)的免疫病理損傷。觀察結(jié)果表明，疫苗免疫成年鼠和乳鼠在病毒感染后的不同時(shí)間點(diǎn)處，均未發(fā)現(xiàn)主要臟器病理組織學(xué)的明顯改變，僅在后肢肌見到極個(gè)別的炎性細(xì)胞浸潤點(diǎn)。這些極少量的炎性細(xì)胞浸潤點(diǎn)的病理學(xué)現(xiàn)象經(jīng)多重分析后，可以認(rèn)為其是非特異的病理現(xiàn)象。同時(shí)，在神經(jīng)系統(tǒng)和主要組織中均未見到特征性的病理改變，各組織中也幾乎檢測不到病毒核酸的存在?？梢源_認(rèn)，在疫苗免疫母鼠后所形成的免疫保護(hù)效應(yīng)，是可以完全抑制病毒在動物體內(nèi)的增殖，并最終可以完全保護(hù)機(jī)體免受病毒感染所引起的病理損害。