專利名稱：鹽酸阿比朵爾在制備抗腸道病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗病毒藥物，具體鹽酸阿比多爾在制備治療手足口病藥物中的用途。
背景技術(shù)：
手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)是由多種腸道病毒引起的常見傳染病，以腸道病毒71型(EV71)及柯薩奇病毒16型(CoxAie)最常見，以嬰幼兒和兒童發(fā)病為主。大多數(shù)患者癥狀輕微，以發(fā)熱和手、足、口腔、臀等部位出現(xiàn)皮疹或皰疹為主要特征。少數(shù)患者可發(fā)生腦炎、腦膜炎、脊髓炎、周圍神經(jīng)炎、急性弛緩性麻痹、心肌炎等，個別重癥患兒病情進(jìn)展快，可因神經(jīng)源性肺水腫、心肺功能衰竭而死亡。手足口病流行期間，可發(fā)生幼兒園、托兒所、學(xué)校集體感染和家庭聚集發(fā)病現(xiàn)象。其傳染性強(qiáng)、隱性感染比例大、傳播途徑復(fù)雜、傳播速度快，短期即可造成較大范圍的流行，疫情控制難度大。帶毒者和輕型散發(fā)病例是流行間歇和流行期的主要傳染源。手足口病是全球性傳染病，世界大部分地區(qū)均有此病流行的報道。近年來，東南亞地區(qū)手足口病發(fā)病率升高，并呈現(xiàn)季節(jié)性流行和全年散發(fā)趨勢。我國于1981年上海首次報道本病，此后，北京、河北、天津、福建、吉林、山東、湖北、青海和廣東等10幾個省(市)均有報道。2006年，全國共報告手足口病13 637例。2009 年，中國多地爆發(fā)手足口病疫情，并有353名嬰幼兒死亡。發(fā)病率較2008年遞增135. 13%， 死亡率增加180%。2010年時下，河南、山東、北京、云南、內(nèi)蒙古等地又出現(xiàn)手足口病疫情， 且已有數(shù)例患兒死亡。衛(wèi)生部公布2010年3月全國法定傳染病疫情，手足口病發(fā)病數(shù)共報道77756例，死亡數(shù)為40例，占丙類傳染病的90. 91%。報告病例仍以5歲及以下兒童為主 (占93. 96%);在實驗室確診的病例中，EV71型占75. 0%。根據(jù)手足口病病原學(xué)特點、2009年和2010年全國手足口病疫情數(shù)據(jù)分析認(rèn)為，我國手足口病防控形勢比較嚴(yán)峻。手足口病疫情主要流行于農(nóng)村地區(qū)，表現(xiàn)為分布廣、疫點多，幼兒比例大、持續(xù)時間長。手足口病傳染性強(qiáng)，傳播速度快，短時間內(nèi)可在托幼機(jī)構(gòu)、學(xué)校等人口密集的地區(qū)引起大流行，至今尚無疫苗預(yù)防也沒有特效藥物治療。因此，尋找抗該病病毒的藥物是開展手足口病防治研究的有效干預(yù)措施。鹽酸阿比朵爾(Arbidol Hydrochloride)，其化學(xué)名為6-溴-4- (二甲氨甲基)-5_羥基-1-甲基-2-(苯硫甲基)-1Η-吲哚-3-羥酸乙酯鹽酸鹽-水合物，結(jié)構(gòu)式為
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鹽酸阿比朵爾是非核苷類抗病毒藥物，可用于防治流行性感冒和其它急性呼吸道病毒感染，它對甲、乙型流感病毒的抗病毒活性最為顯著，該藥能抑制甲、乙型流感病毒復(fù)制的早期階段，能抑制病毒細(xì)胞漿膜的融合以及病毒與內(nèi)吞囊泡之間的膜融合。同時阿比朵爾在體內(nèi)還可誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素，對巨噬細(xì)胞的吞噬功能有顯著的活化作用，具有免疫調(diào)節(jié)作用。然而到目前為止，還沒有將鹽酸阿比多爾應(yīng)用于手足口病的防治。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供鹽酸阿比多爾在制備抗腸道病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸阿比多爾對腸道病毒具有明顯的抗病毒活性，尤其是引起手足口病的腸道病毒71型。進(jìn)而本發(fā)明提供一種抗病毒藥物，其包括上述鹽酸阿比朵爾以及藥學(xué)上可接受的載體，其劑型可以是丸劑、片劑、膠囊或者是口服液等形式。鹽酸阿比朵爾在體外具有明顯抑制腸道病毒71型的作用。具體體現(xiàn)在在對病毒直接殺滅作用、抗病毒吸附作用和抑制病毒增殖作用上，其治療指數(shù)(treatment index, Tl)分別為3. 08 (直接殺傷病毒)、23.55 (阻斷病毒侵入)和2. 5 (抑制病毒增殖)。


圖1為鹽酸阿比朵爾對RD細(xì)胞的毒性實驗，左正常RD細(xì)胞；右阿比朵爾對細(xì)胞的毒性作用(lOyg/ml)。
具體實施例方式以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。若未特別指明，實施例中所用的生化試劑為市售試劑，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1鹽酸阿比朵爾對RD細(xì)胞的毒性作用
(1)根據(jù)Mosmarm建立MTT法檢測藥物的細(xì)胞毒性作用。用含有0.02% EDTA的胰酶將生長良好的細(xì)胞分散成單個細(xì)胞懸液，后用含10%小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞調(diào)整至1 Xio5Ail的濃度分種于96孔板，每孔0.加1。置37°C， 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh。待細(xì)胞長成單層后，棄培養(yǎng)液上清，換含不同濃度的含藥維持液， 每孔200 μ 1。藥物的終濃度分別為62. 50、31. 25、15. 63、7. 81、3. 91 μ g/ml。每種濃度重復(fù) 4孔，實驗同時設(shè)正常細(xì)胞對照組。繼續(xù)培養(yǎng)4 后，用MTT法檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果鹽酸阿比朵爾對RD細(xì)胞的毒性作用表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，胞內(nèi)顆粒增多，折光性變差，部分產(chǎn)生空泡(圖1右)等。正常RD細(xì)胞沒有這些特征(圖1左)。由于細(xì)胞代謝活性降低或死亡，MTT 法檢測到的活細(xì)胞數(shù)減少，故A值下降。且藥物對細(xì)胞的毒性作用在一定范圍內(nèi)隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率降低。通過顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和MTT法測定A值，確定鹽酸阿比朵爾的 TC5tl 為 25. 86 μ g/ml。實施例2鹽酸阿比朵爾抗腸道病毒71型藥效學(xué)研究 1、鹽酸阿比朵爾對腸道病毒71型的直接殺傷作用
分別將50TCID5Q EV71與鹽酸阿比朵爾藥液不同濃度混合，終濃度分別為8、4、2、1、0. 5 μ g/ml，4 °C作用6h后加至已長成單層的RD細(xì)胞上，吸附2h后，棄去上清，加入細(xì)胞維持液，37°C、5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每日觀察CPE，當(dāng)病毒對照病變達(dá)+++ ++++時， 用MTT法檢測病毒抑制率。采用治療指數(shù)作為評價指標(biāo)來衡量藥物對病毒的抑制效力。同時設(shè)病毒對照和細(xì)胞對照。以TI作為藥物對EV71抑制效力的評價指標(biāo)，TI=TC50/IC50, TI 值越大，藥物抑制EV71的作用越強(qiáng)。結(jié)果病毒對照組EV71所致RD細(xì)胞的CPE表現(xiàn)為 細(xì)胞形態(tài)皺縮，變圓，折光性減弱，胞核圓縮和破裂，細(xì)胞最終脫落壞死。與病毒對照組相比，細(xì)胞對照組細(xì)胞形態(tài)較為正常，呈扁圓形，排列整齊且緊密。光鏡下觀察阿比朵爾抑制 EV71的CPE情況與病毒對照組相比，鹽酸阿比朵爾作用孔細(xì)胞病變隨藥物濃度大小呈梯度變化，藥物濃度最大孔CPE : +。經(jīng)Probit線性回歸分析，鹽酸阿比朵爾類似物的EC 50為 12. 55士2.52 μ g/ml，治療指數(shù)TI為19. 40士2. 04 μ g/ml，TI為3. 08，表明其也具有直接滅活EV71作用。(2)鹽酸阿比朵爾對腸道病毒71型侵入阻斷作用
根據(jù)細(xì)胞毒性實驗結(jié)果，在藥物無毒范圍內(nèi)，將已長成單層的RD細(xì)胞預(yù)先用100μ 1不同濃度藥液處理。藥液濃度分別為16、8、4、2、1μ g/ml，37°C，5%C02孵育2h后棄去藥液，每孔加入50μ1 IOOTCID5ci的RV，吸附2h，棄病毒上清，加細(xì)胞維持液，同上法培養(yǎng)與觀察。光鏡下觀察，藥物作用孔細(xì)胞病變效應(yīng)與病毒對照組相比較輕，多數(shù)的細(xì)胞形態(tài)較為正常，阿比朵爾在一定程度上抑制了 EV71病毒感染細(xì)胞所致CPE，提示該藥對EV71感染有一定的預(yù)防作用。阿比朵爾在不同藥物濃度(μ g/ml)和病毒抑制率呈一定的劑量依賴關(guān)系，阿比朵爾EC50為16. 97士2. 4，TI為23. 55，說明阿比朵爾能夠阻斷腸道病毒71型入侵細(xì)胞。(3)鹽酸阿比朵爾對腸道病毒71型生物合成抑制作用
于已長成單層細(xì)胞的96孔板上，每孔接種50 μ 1 IOOTCID5ci的EV71，吸附2h，棄病毒上清，根據(jù)細(xì)胞毒性實驗的結(jié)果，在藥物無毒濃度范圍內(nèi)，依次加入同上5個濃度梯度的含藥維持液每孔0. 2mL,同上法培養(yǎng)與檢查。通過光鏡下觀察，藥物作用孔細(xì)胞病變效應(yīng)與病毒對照組相比很輕，多數(shù)的細(xì)胞形態(tài)正常，阿比朵爾在一定程度上抑制了 EV71病毒感染細(xì)胞所致CPE，藥物最高濃度的CPE :+，最低濃度CPE :+++。阿比朵爾類似物的EC50為 18. 28 士 1. 70，TI為2. 5。這些結(jié)果提示該藥對EV71感染細(xì)胞有抑制作用。實施例3 阿比朵爾體內(nèi)抗EV71的實驗研究
40只雌性BALB/c小鼠(7-9 g)隨機(jī)分成4組①正常動物對照組，灌服生理鹽水 ’② 病毒感染模型組，病毒感染后，灌服生理鹽水；③高劑量治療組(0. Ig · kg—1 · Cf1);④低劑量治療組(0. 05g · kg—1 · cf1)。小鼠經(jīng)乙醚麻醉，以15LD5Q病毒液口服感染，每只0. 05mL,正常動物對照組用生理鹽水代替病毒液口服感染。感染后2h開始灌胃給藥，每天給藥2次，每次0. lmL，連續(xù)給藥 5d。觀察15天。小鼠處死前禁食8h，摘除眼球放血脫頸椎處死動物，取腸組織置勻漿器中， 加生理鹽水，在冰浴中研磨制成勻漿，反復(fù)凍融兩次釋放病毒，離心后取上清按常規(guī)方法進(jìn)行病毒滴定。觀察動物的一般表現(xiàn)，正常對照動物未見死亡，病毒對照動物在感染后5天開始死亡，死亡率80%，高、低劑量組動物死亡率分別為25%和50%。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示該藥對 EV-71感染小鼠有保護(hù)作用。
權(quán)利要求
1.鹽酸阿比多爾在制備抗腸道病毒藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腸道病毒為腸道病毒71型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物鹽酸阿比多爾和藥學(xué)上可接受的載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物的劑型為丸劑、片劑、膠囊劑或口服液。
全文摘要
本發(fā)明公開了鹽酸阿比朵爾在制備抗腸道病毒藥物中的新用途。本發(fā)明研究表明鹽酸阿比朵爾在細(xì)胞內(nèi)和動物體內(nèi)具有抗手足口病病毒(即腸道病毒71型)的作用，且其在病毒感染前、感染后的給藥方式抗病毒均有效。由該化合物作為抗病毒藥物在對病毒直接殺傷作用和對病毒感染細(xì)胞的阻斷預(yù)防作用上，其治療指數(shù)(treatmentindex，TI)分別為3.08(直接殺傷病毒)、23.55(阻斷病毒侵入)和2.5(抑制病毒增殖)。本發(fā)明為治療手足口病病毒感染提供了新的有效途徑，具有實際應(yīng)用價值。
文檔編號A61K31/4045GK102440988SQ20111044516
公開日2012年5月9日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者侯煒, 凌佳馨, 劉媛媛, 劉強(qiáng), 楊占秋, 熊海蓉, 王雨, 羅凡, 肖紅 申請人:武漢大學(xué)