專(zhuān)利名稱(chēng)：防御素及其在制備抗菌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及防御素及其在制備抗革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌藥物中的應(yīng)用。具體地， 涉及利用小球藻生產(chǎn)的防御素mNP-1，及其在制備抗革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
防御素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及分類(lèi)防御素是一類(lèi)廣泛存在于動(dòng)物、植物和人類(lèi)體內(nèi)具有微生物抗性的陽(yáng)離子小肽。 防御素一般由29-54個(gè)氨基酸組成，分子量為3-6KD。在結(jié)構(gòu)上具有以下共同特點(diǎn)(I)帶正電荷，(2)富含精氨酸，(3)具有一定數(shù)目的保守的半胱氨酸，(4)通過(guò)半胱氨酸分子形成分子內(nèi)二硫鍵，使肽環(huán)合形成反向平行的β片層結(jié)構(gòu)。自1985年美國(guó)加利福尼亞大學(xué) Lehrer教授對(duì)其命名以來(lái)(Selsted et al.，1985)，受到國(guó)內(nèi)外科學(xué)家的廣泛關(guān)注。根據(jù)分子大小、結(jié)構(gòu)與功能的差異，可將防御素大致分為四類(lèi)防御素、β防御素、昆蟲(chóng)防御素與植物防御素。基于半胱氨酸殘基的間距和二硫鍵的形式，哺乳動(dòng)物的防御素可分為三類(lèi)α防御素、β防御素和Θ防御素。哺乳動(dòng)物的防御素由18-42個(gè)氨基酸組成，其中6 個(gè)保守的半胱氨酸形成了 3對(duì)二硫鍵，使肽鏈折疊成β片層結(jié)構(gòu)。α防御素由29-36個(gè)氨基酸組成，二硫鍵的連接方式為1-6、2-4、3-5 ； β防御素由38-42個(gè)氨基酸組成，二硫鍵的連接方式為1-5、2-4、3-6，β防御素中還有一個(gè)脯氨酸和甘氨酸；1999年從非人靈長(zhǎng)類(lèi)恒河猴中發(fā)現(xiàn)了新的一類(lèi)防御素一由18個(gè)氨基酸殘基組成的環(huán)狀Θ防御素，它們是由兩個(gè)不同的截短的α防御素類(lèi)肽連接而成。防御素在人體中廣泛分布，人體中α防御素有6種，其中4種即ΗΝΡ1-4主要產(chǎn)生于粒細(xì)胞，2種HD5-6主要產(chǎn)生于潘氏細(xì)胞；人類(lèi)基因組有28個(gè)β -防御素基因，在人類(lèi)和鼠類(lèi)已經(jīng)鑒定出超過(guò)35個(gè)β_防御素基因。防御素的表達(dá)與病源微生物的入侵是緊密相關(guān)的，例如在透析病人的腹腔中同時(shí)發(fā)現(xiàn)有α防御素與β防御素，又如細(xì)菌性腦膜炎患兒的腦脊髓液中防御素的濃度比非細(xì)菌性腦膜炎高150倍。眼內(nèi)防御素的表達(dá)研究表明，防御素在淚液中的含量與感染時(shí)的表達(dá)不同。研究表明防御素在人體防病抗病中起著非常重要的作用。到目前為止,分離到的兔防御素有9個(gè),其中7個(gè)為α防御素ΝΡ_1,ΝΡ-2,NP_3a, NP-3b，NP-4，NP-5和Corticostatin VI，產(chǎn)生于粒細(xì)胞。另外2個(gè)兔防御素:RK_1和RK-2， 來(lái)自于兔腎細(xì)胞。α-防御素NP-I比人防御素HNP-I的抗菌活性強(qiáng)5 10倍，兩者間的這一明顯差異被歸結(jié)為它們的分子凈電荷性質(zhì)在NP-I分子中含有9個(gè)凈正電荷，而在HNP-I 分子中僅含有3個(gè)凈正電荷。目前，從生物體中分離到的防御素已達(dá)30多種，其中兔防御素(Netrophile Peptide-1, NP-1)的抗性譜最廣。兔防御素NP-I由33個(gè)氨基酸組成,屬于α-防御素，有6個(gè)半胱氨酸，它們形成3個(gè)二硫鍵，連接位置分別為l-6，2-4，3-5(Ganz， 1989)。它對(duì)梅毒螺旋體、很多革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、真菌和病毒有顯著的抑制或毒殺效應(yīng)。防御素抗微生物機(jī)理
在動(dòng)植物及人體內(nèi)，防御素含量極其少，卻執(zhí)行著機(jī)體重要的防御功能。與傳統(tǒng)抗生素相比，防御素有其獨(dú)特的抑制機(jī)理。防御素的抗菌作用機(jī)理為它依靠靜電作用，通過(guò)本身所帶的正電荷與帶負(fù)電荷的微生物細(xì)胞膜相互吸附，即防御素與革蘭氏陰性菌的脂多糖(LPS)、革蘭氏陽(yáng)性菌的脂磷壁酸等陰離子分子作用而附著在靶細(xì)胞表面，二聚或多聚的防御素穿膜形成瞬時(shí)的或穩(wěn)定的跨膜離子通道(兔防御素NP-I形成瞬時(shí)的，人防御素 HNP-I形成穩(wěn)定的跨膜離子通道)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶液外滲，從而擾亂了細(xì)胞膜的通透性及細(xì)胞能量狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化，呼吸作用受到抑制以及細(xì)胞內(nèi)ATP含量下降，最終導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡。防御素的抗病毒作用則是通過(guò)與病毒外殼蛋白結(jié)合而導(dǎo)致病毒失去生物活性。 正是由于這種特殊的作用機(jī)理，目的微生物難以產(chǎn)生抗防御素的抗性突變，因此防御素被認(rèn)為是一種新型低耐藥性甚至無(wú)耐藥性的抗感染肽類(lèi)。不同防御素的抗微生物活性由于不同來(lái)源的防御素在結(jié)構(gòu)上有一定的差異，因此它們的抑菌譜亦有很大差別。各種α-防御素對(duì)革蘭氏陰性菌、陽(yáng)性菌，分枝桿菌、真菌、被膜病毒、HIV病毒在不同程度上都有抑制作用，其作用劑量大部分在1-100 μ g/ml之間(Patterson Delafied et al., 1980,1981 ；Lehrer et al.，1983，1985a，1985b，1986，1989 ;Selsted et al.，1984，1985c， 1987，1992 ;Ganz，1985a ;Segal et al.，1985 ;Daher et al. , 1986 ；Levitz et al.，1986 ; Shafer et al. ，1988 ;Eisenhauer et al. ，1989 ;Yamashita and Saito，1989 ;Cullor et al.，1990，1991 ;Miyasaki et al.，1990a，1990b，1990b ;Borenstein et al·，1991a， 1991b ；Kohashi et al.，1992 ;0gata et al.，1992 ;Nakashima，1993)。與其它抗微生物肽相比，防御素具有更廣的抗性譜，尤其是兔防御素ΝΡ-1，ΝΡ-2，不但抗性譜廣，抑菌活性也較強(qiáng)。1984年，Selsted等發(fā)現(xiàn)從兔中性粒細(xì)胞分離獲得的NP-I在濃度為50 μ g/ml時(shí)對(duì)3個(gè)家系的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，月市炎鏈球菌(Staphylococcus pneumoniae)，無(wú)乳鏈球菌(Staphylococcus agalactiae)，李斯特菌(Listeria monocytogenes)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，大腸桿菌(Escherichia coli)，月市炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)， 粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)，流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)和支氣管炎博德氏桿菌(bordetella bronchiseptica)抑制生長(zhǎng)或者殺滅作用(Selsted et al. 1984) ο1985年，Lehrer等首次發(fā)現(xiàn)兔MCP-I和MCP_2(現(xiàn)名分別為，兔防御素NP-I和 NP-2)在體外對(duì)I型單純皰疫病毒(herpes simplex virus typel，HSV-1)具有中和活性作用，而4個(gè)結(jié)構(gòu)同源的肽NP-3a，NP-3b，NP-4和NP-5對(duì)HSV-I無(wú)效。兔防御素NP-I和 NP-2對(duì)單純皰疹病毒的滅活作用依賴(lài)于肽濃度以及肽與HSV-I孵育的時(shí)間，溫度和pH。2 型單純皰疫病毒(herpes simplex virus type 2，HSV-2)，水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)，流感病毒 A/WSN(inf luenza virus A/WSN)也易被 MCP-1 和 MCP-2 直接中和，但MCP-I和MCP_2對(duì)巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus)，?？刹《綢I型(echovirus type 11)，和呼腸孤病毒3型(reovirus type 3)無(wú)效。1986年，Lehrer等也首次報(bào)道HNPl對(duì)包膜病毒單純皰疹病毒I和2(HSV_1和 HSV-2)、水泡性口炎病毒，人流感病毒有直接滅活作用，但對(duì)非被膜病毒埃可病毒和呼腸孤
4病毒沒(méi)有作用。在包膜病毒的研究中，HNPl對(duì)HSV-I和HVS-2有很強(qiáng)的直接抑制作用，對(duì)水泡性口炎病毒和流感病毒(IAV)有溫和的直接抑制作用，對(duì)巨細(xì)胞病毒，僅在高濃度時(shí)， 才有輕微的作用。對(duì)少數(shù)禽類(lèi)的β防御素抗菌活性的研究顯示其具有廣泛地抗革蘭氏陰性菌，革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌作用。在美國(guó)，每年由于感染造成的死亡人數(shù)超過(guò)250萬(wàn)例，因此感染已成為造成死亡的首要原因。而且在美國(guó)，每年有70%感染患者有抗藥性，使耐藥細(xì)菌迅速的增加，已成為世界所面臨的最嚴(yán)重的醫(yī)療問(wèn)題之一。感染耐甲氧西林的金黃色葡萄菌(MRSA)僅4年已增加了 700% ο在美國(guó)，2008年MRSA的住院費(fèi)用超過(guò)了 685，000美元，并預(yù)計(jì)到2013年增至240萬(wàn)美元。MRSA感染直接花費(fèi)美國(guó)醫(yī)療系統(tǒng)的100億美元和每年總花費(fèi)達(dá)180億美
J Li ο抗生素耐藥菌的出現(xiàn)，甚至多重耐藥菌的發(fā)現(xiàn)，以及耐藥菌感染的急劇上升，急需不會(huì)帶來(lái)病原菌耐藥性的新藥物。由于防御素具有強(qiáng)大的抗菌和免疫調(diào)節(jié)作用，防御素對(duì)抗生素耐藥菌及多重耐藥菌也均具有抑殺作用。與傳統(tǒng)的抗生素相比，細(xì)菌從防御素中獲得耐藥性極為困難。因此，廣泛地認(rèn)為防御素是最具有潛力的新一代抗感染生物肽。防御素的殺傷效果可被血清抵消，可能是由于防御素結(jié)合到各種血漿蛋白如特異性補(bǔ)體成分，絲氨酸蛋白酶抑制劑和激活的a2_巨球蛋白(Lichtenstein et al. , 1986 and 1988 ；Okrent et al. , 1990 ；Panyutich et al. , 1991,1994 and 1995)。當(dāng) 1%胎牛血清存在時(shí)，人防御素(HNPs)介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞裂解降低了 30%，而當(dāng)5%胎牛血清存在時(shí)，人防御素(HNPs)介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞裂解降低了 75% (Lichtenstein et al. ,1986)。革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌自然界存在多種多樣的病菌，通過(guò)革蘭氏染色法，能夠把細(xì)菌分成兩大類(lèi)，即革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌。這種染色方法是先用龍膽紫(也稱(chēng)結(jié)晶紫)染色細(xì)菌，所有的細(xì)菌均被染成紫色，然后再用革蘭氏碘液來(lái)加強(qiáng)染料與菌體的結(jié)合，再用95%的乙醇脫水短時(shí)脫水(20-30秒)，在這個(gè)過(guò)程中有些細(xì)菌染色很牢固，染色不被脫去，而仍保留著紫色，有些細(xì)菌染色不牢固，染色被脫去變成為無(wú)色，接著再用番紅或沙黃復(fù)染I分鐘，那么被脫色了的細(xì)菌可以染色，變成紅色，未脫色的細(xì)菌不能再染色了，仍保持著原來(lái)的紫色; 據(jù)此，凡是被染成紫色的細(xì)菌就成為革蘭氏陽(yáng)性菌(G+菌)，被染成紅色的細(xì)菌稱(chēng)為革蘭氏陰性菌(G-菌)。大多數(shù)化膿性球菌都屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，它們能產(chǎn)生外毒素使人致病，常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性菌有葡萄球菌(Staphyloccocus)、鏈球菌(Streptococcus)、肺炎雙球菌 (Diplococcus pneumoniae)、炭疽桿菌(Bacillus anthraci)、白喉?xiàng)U菌(Corynebacterium diphtheriae)、破傷風(fēng)桿菌(Clostridium tetani)等,可以選擇青霉素族,頭孢曲松鈉等； 大多數(shù)腸道菌多屬于革蘭氏陰性菌，它們產(chǎn)生內(nèi)毒素，靠?jī)?nèi)毒素使人致病。常見(jiàn)的革蘭氏陰性菌有痢疾志賀氏桿菌(Shigella dysenteriae)、傷寒桿菌((Salmonella enterica serovar Typhi)、大腸桿菌(Escherichia coli)、變形桿菌(proteusbacillus vulgaris)、 銅綠假單胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)、百日咳桿菌(Bordetella pertussis)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)和腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)等革蘭氏陰性菌則對(duì)青霉素不敏感，可以選擇氟喹諾酮類(lèi)藥物如諾氟沙星，左氧氟沙星等，也可以選擇大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)比如克拉霉素、羅紅霉素等。革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁較厚，約20 80nm。肽聚糖含量豐富，有15 50層，每層厚度Inm,約占細(xì)胞干重的50 80%。此外，尚有大量特殊組分磷壁酸(teichoic acid)。 磷壁酸是由核糖醇(ribitol)或甘油(glyocerol)殘基經(jīng)由磷酸二酯鍵互相連接而成的多聚物。憐壁酸分壁憐壁酸(wall teichoic acid)和膜憐壁酸(membrane teichoic acid) 兩種，前者和細(xì)胞壁中肽聚糖的N-乙酰胞壁酸連結(jié)，膜磷壁酸又稱(chēng)脂磷壁酸(Iipteichoic acid)和細(xì)胞膜連結(jié)，另一端均游離于細(xì)胞壁外。磷壁酸抗原性很強(qiáng)，是革蘭氏陽(yáng)性菌的重要表面抗原；在調(diào)節(jié)離子通過(guò)粘肽層中起作用；也可能與某些酶的活性有關(guān)；某些細(xì)菌的磷壁酸，能粘附在人類(lèi)細(xì)胞表面，其作用類(lèi)似菌毛，可能與致病性有關(guān)。此外，某些革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁表面還有一些特殊的表面蛋白，如a蛋白等，都與致病有關(guān)。臨床上，常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性菌(G+菌)致病菌主要包括7大類(lèi)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、草綠色鏈球菌(Viridans streptococci)、腸球菌屬(Enterococcus其中幾球菌(E. faecalis)更為常見(jiàn))、肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae)、β -溶血鏈球菌(β -haemolytic streptococcus)。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, Sau)是目前床上最常見(jiàn)的致病菌之一，青霉素從20世紀(jì)40年代開(kāi)始應(yīng)用于臨床，但很快出現(xiàn)了耐藥菌株。自從1961年 Jevons首次分離出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-reistant Staphylococcus aureus, MRSA)以來(lái)，MRSA在世界的感染率和分離率不斷增加，已成為目前醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌之一，由金黃色葡萄球菌引起的感染成為臨床棘手的問(wèn)題(Moran et al, 2006)。MRSA自出現(xiàn)以來(lái)，強(qiáng)大的致病毒力因子以及耐藥性便使其成為臨床上的一個(gè)難題，導(dǎo)致MRSA的感染率不斷上升，感染范圍不斷擴(kuò)大，感染的程度愈來(lái)愈嚴(yán)重。MRSA感染的治療目前還是以藥物為主，但其對(duì)抗生素的多重耐藥導(dǎo)致治療上的困難。其臨床感染率和危害性已經(jīng)引起醫(yī)學(xué)界震驚和高度重視，因此人們把MRSA這種菌株形象地稱(chēng)為“超級(jí)細(xì)菌”。自從1968年首次發(fā)現(xiàn)MRSA I引起的感染，40年來(lái)，MRSA造成的院內(nèi)與院外感染均成上升趨勢(shì)，我國(guó)1989年全國(guó)部分城市調(diào)查MRSA平均檢出率為42. 7 %，屬M(fèi)RSA 感染的嚴(yán)重國(guó)家之一。20世紀(jì)90年代以后我國(guó)北京、上海、廣州等地大型醫(yī)院MRSA的分離率都已超過(guò)了 50%，而其他地區(qū)的報(bào)道也大部分在25% -60%之間。上海2004年金黃色葡萄球菌(簡(jiǎn)稱(chēng)金葡菌)中MRSA的分離率已達(dá)到63. 9%，2006年上海各大醫(yī)院 MRSA的檢出率最高達(dá)92. 5%。2006年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)顯示MRSA在金葡菌感染中所占比例平均為76. 3 %，說(shuō)明MRSA感染已經(jīng)達(dá)到了很?chē)?yán)重的程度(汪復(fù)，2008)。 在國(guó)外，近年在南歐部分國(guó)家和英國(guó)MRS A在金葡菌感染中的檢出率在大型醫(yī)院達(dá)到了 30% -50%。在德國(guó)，1996-2006年間MRSA的感染率不斷增長(zhǎng)達(dá)到了 20% -22%，德國(guó)的一所大型教學(xué)醫(yī)院(kath-arinen hospital)MRSA感染的病例在1994-2003年間上升了 277% (Trautmann et al. ,2007) 2004年美國(guó)大部分醫(yī)院MRSA感染率都超過(guò)50%， MRSA在美國(guó)占院內(nèi)感染金葡菌的比率從1975年的2. 4%上升到1997年的39. 9%。2005 年，美國(guó)Uehnert等在全美475所醫(yī)院的調(diào)查顯示，MRSA感染的住院病人相比1995年增長(zhǎng)了 10倍，是2000年的3倍，比2004年增長(zhǎng)了 30 %，而且由于檢測(cè)及培養(yǎng)方面的差別與缺陷，實(shí)際的發(fā)生率可能更高(Jarvis et al.，2007)。近年來(lái)感染菌變遷的總趨勢(shì)是革蘭氏陰性桿菌占主要地位(張秀珍，1999)，臨床上感染的革蘭氏陰性菌菌群主要有 大腸桿菌(Escherichia coli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、不動(dòng)桿菌屬 (Acinetobacter)、腸桿菌屬(Enterobacter)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、幽門(mén)螺旋桿菌(Heliobacterium chlorum)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)。季萍等 (2002)的研究結(jié)果表明，這些致病的革蘭氏陰性菌大部分產(chǎn)生了耐藥性腸桿菌科細(xì)菌對(duì)氨芐西林耐藥率為80 % 100 %，除肺炎克雷伯菌外，對(duì)阿莫西林/棒酸耐藥率為> 60 %。 除大腸桿菌外，對(duì)培氟沙星耐藥率為<50%。除腸桿菌屬外對(duì)奈替米星、頭孢西丁的耐藥率為15% 30%，銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南、慶大霉素、頭孢他啶、妥布霉素耐藥率為10% 25%。不動(dòng)桿菌屬對(duì)亞胺培南、妥布霉素耐藥率2% 29%。產(chǎn)ESBLs菌株高度耐三代頭孢菌素，對(duì)氨基糖苷類(lèi)、復(fù)方新諾明、喹諾酮類(lèi)交叉耐藥率高達(dá)78. 9 % 100 %。兔防御素的生產(chǎn)目前文獻(xiàn)報(bào)道獲取兔防御素的途徑大部分是從兔子中獲得的(Judithet al.，
1980；Selsted et al.，1983，1984，1985 ；Lehrer et al.，1981，1983，1985 ；Sinha et al.， 2003)。中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所以橢圓小球藻硝酸還原酶基因缺失突變體為受體，以NPTII和硝酸還原酶基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，以Ubiquitin啟動(dòng)子控制NP-I，獲得了能夠在硝酸鹽培養(yǎng)基上培養(yǎng)而且具有較強(qiáng)NP-I活性的轉(zhuǎn)基因小球藻(安洋等，2008)。NP-1 的離體抗菌活性已有較多報(bào)道(Patterson-Delaf ield et al. , 1980,
1981；Selsted et al.,1984,1985c ；Lehrer et al, 1983,1985a,986 ；Levitz et al.， 1986 ；Miyasaki et al. , 1990b, Borenstein et al. ,1991a,1991b ；Kohashi et al., 1992)，已報(bào)道的NP-I的抗菌譜有白色念球菌(Candida albicans)，糞腸球菌 (S. faecalis),枯草桿菌(B. subtil is),鼠傷寒沙門(mén)氏菌(S. typhimurium),金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，月市炎鏈球菌(Staphylococcus pneumoniae)，無(wú)乳鏈球菌(Staphylococcus agalactiae)， 李斯特菌(Listeria monocytogenes),銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),大腸桿菌(Escherichia coli),肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae),粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens),流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)和支氣管炎博德氏桿菌(bordetella bronchiseptica),曲霉(Aspergillus fumigatus),米根霉 (Rhizopus oryzae)，伴放線(xiàn)放線(xiàn)桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)，哨蝕艾肯菌Eikenella corrodens), 二氧化碳嗜纖維菌(Capnocytophaga spp.),梅毒螺旋體 (Treponema pallidum)。但其在抗耐藥細(xì)菌方面還未見(jiàn)報(bào)道,在活體抗細(xì)菌方面也未見(jiàn)報(bào)道?？共《痉矫娴膱?bào)道較少(Nakashima et al. , 1993 ；Lehrer et al, 1985b ；Sinha et al. ,2003)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種改造的NP-I (即mNP-1)及其在抗細(xì)菌方面的應(yīng)用，所述的改造的NP-I (即mNP-1)具有34個(gè)氨基酸，第一個(gè)氨基酸為甲硫氨酸，是新加上的，其余的33個(gè)氨基酸來(lái)自兔防御素NP-I的序列，改造后的NP-I的核苷酸序列為SEQ ID N0:15所示，其氨基酸序列為SEQ ID NO :16(簡(jiǎn)稱(chēng)mNP-Ι)。mNP-1具有較強(qiáng)抗革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的能力，在離體水平mNP-Ι濃度為5 μ g/mL以上時(shí)，對(duì)部分革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌有殺滅作用。我們還在活體上證明了 mNP-Ι對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌有顯著殺滅效果，尤其是對(duì)耐藥菌殺滅的效果更為顯著。而前人從兔中獲得的防御素NP-I濃度為50 μ g/ mL以上時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌桿菌，大腸桿菌，肺炎鏈球菌，無(wú)乳鏈球菌，流感嗜血桿菌具有殺滅作用(Selsted et al.，1984)。我們比較了 mNP-Ι與從兔子中分離獲得的天然NP-I抗革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌)及革蘭氏陰性菌(銅綠假單胞菌和大腸桿菌)的效果，結(jié)果表明mNP-Ι比從兔子中分離獲得的天然NP-I的抗菌效果更好。至今未有報(bào)告從兔子中分離獲得的防御素NP-I對(duì)耐藥菌有殺滅作用，也未有報(bào)道在活體水平上對(duì)殺滅革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌有效。1-10% (v/v)濃度的人血清對(duì)mNPl抑菌活性沒(méi)有影響。具體地，在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種短肽mNP-Ι，其氨基酸序列為SEQ ID NO 16所示的序列。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了編碼所述短肽mNP-Ι的核酸。優(yōu)選地，所述核酸的序列為SEQ ID NO 15所不的序列。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種表達(dá)載體，其包含上述之一的核酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體是通過(guò)將Nos終止子(SEQ ID NO: 6)，Ubiquitin 基因啟動(dòng)子(SEQ ID NO :1)，含有編碼上述 mNP-1 (SEQ ID NO 13)的基因以及NR基因表達(dá)框(SEQ ID NO :5)依次連接到載體的多克隆位點(diǎn)中，獲得表達(dá)載體 pGreen-NR-U-mNPlο在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了宿主細(xì)胞，其包含上述的核酸或上述的表達(dá)載體。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了藥物組合物，其包含上述的短肽mNP-Ι或上述的編碼所述短肽mNP-Ι的核酸和任選地藥用載體。優(yōu)選地，所述的藥物組合物為溶液、片劑、 膠囊、霧劑、膏劑、粉劑或注射劑的形式。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了上述的短肽mNP-Ι或上述的編碼所述短肽 mNP-Ι的核酸在制備抗革蘭氏陰性菌和/或革蘭氏陽(yáng)性菌藥物中的應(yīng)用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)菌是奈瑟氏菌屬(Neisseria),葡萄球菌屬(Staphylococcus),李斯特菌屬(Listeria),假單胞菌屬(Psdeuomnoda),埃希氏菌屬(Escherichia),克雷伯氏菌屬(Klebsiella),沙雷氏菌屬(Serratia),嗜血桿菌屬(Haemophilus),博德特氏菌屬(Bordetella),螺旋桿菌屬(Heliobacterium),鏈球菌屬(Streptococcus),不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter),沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)。更優(yōu)選地，所述細(xì)菌為淋病奈瑟氏菌 (Neisseria gonorrhoeae),金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),耐甲氧西林的金黃色葡萄菌(MRSA),銅綠假單胞菌(Pseudomonas Aeruginosa),泛耐藥銅綠假單胞菌， 大腸桿菌(Escherichia coli),幽門(mén)螺旋桿菌(Heliobacterium chlorum),肺炎鏈球菌 (Streptococcus pneumoniae)，沙門(mén)氏菌(Salmonella)，大腸桿菌(Escherichia coli)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述的革蘭氏陰性菌為大腸桿菌(Escherichia coli),銅綠假單胞菌(Pseudomonas Aeruginosa),淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae),幽門(mén)螺旋桿菌(Heliobacterium chlorum)和沙門(mén)氏桿菌(Salmonella)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述的革蘭氏陽(yáng)性菌為金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)，月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)。


圖1. PBI221質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。圖2. pbinUGUS質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。圖3. pGreen0029 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。圖4. pGreen0029nos 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。圖5. pGreen0029-U-nos 質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖。圖6. pGreen0029-U-mNPl-nos 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。圖7pGreen-NR-U_mNPl 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。圖8.電擊方法轉(zhuǎn)化橢圓小球藻硝酸還原酶功能缺失突變體得到的抗G418的藻落。圖9.NPTII基因PCR檢測(cè)結(jié)果。1泳道為陽(yáng)性質(zhì)粒，2泳道為未轉(zhuǎn)化藻株nrm_4 ; 3-11泳道為轉(zhuǎn)化藻株1-9 ；圖10. Ubi-mNP-1-Nos基因PCR檢測(cè)結(jié)果。1泳道為未轉(zhuǎn)化藻株nrm_4 ；2泳道為 陽(yáng)性質(zhì)粒；3-11泳道為轉(zhuǎn)化藻株1-9。圖11. Sephadex G-50的紫外吸收峰圖。圖12. Sephadex C-25的紫外吸收峰圖。圖13.從轉(zhuǎn)基因小球藻中純化mNP-1的電泳圖。1，4 :蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2，3 :純 化的mNP-1 (箭頭所指)。圖14. mNP-1胰蛋白酶解肽段LC-MS分析結(jié)果。圖15. mNP-1對(duì)淋病奈瑟氏菌抑殺結(jié)果。圖16. mNP-1對(duì)金黃色葡萄球菌(藥敏質(zhì)控菌)，耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌 (MRSA)的抑殺結(jié)果。圖16A1為mNP-1對(duì)藥敏質(zhì)控菌的抑菌試驗(yàn)，圖16A2為mNP-1對(duì)MRSA 的抑菌試驗(yàn)，其中試管編號(hào)1為培養(yǎng)基對(duì)照(以NC表示，即陰性對(duì)照)；編號(hào)2-8為不同濃 度(以U g/ml表示)mNP-l ;編號(hào)9為細(xì)菌對(duì)照(以PC表示，陽(yáng)性對(duì)照)。細(xì)菌生長(zhǎng)以“ + ” 表示，不生長(zhǎng)以表示。圖16B頭孢西丁對(duì)金黃色葡萄球菌(藥敏質(zhì)控菌)(上圖)和 MRSA(下圖)的抑菌試驗(yàn)，其中試管編號(hào)1為培養(yǎng)基對(duì)照(以NC表示，即陰性對(duì)照)；編號(hào) 2-8為不同濃度(以y g/ml表示)頭孢西丁 ；編號(hào)9為細(xì)菌陽(yáng)性對(duì)照，以PC表示。細(xì)菌生 長(zhǎng)以“ + ”表示，不生長(zhǎng)以表示。圖17. mNP-1對(duì)銅綠假單胞菌(藥敏質(zhì)控菌)和臨床多重耐藥銅綠假單胞菌的抑 殺結(jié)果。圖17A1為mNP-1對(duì)銅綠假單胞菌(藥敏質(zhì)控菌)的抑菌試驗(yàn)。圖17A2為mNP_l 對(duì)臨床多重耐藥銅綠假單胞菌株的抑菌試驗(yàn)。其中試管編號(hào)1為培養(yǎng)基對(duì)照(以NC表示， 即陰性對(duì)照)；編號(hào)2-8為不同濃度(以y g/ml表示)NP-1 ;編號(hào)9為細(xì)菌陽(yáng)性對(duì)照，以PC 表示。細(xì)菌生長(zhǎng)以“ + ”表示，不生長(zhǎng)以表示。圖17B為頭孢他啶對(duì)銅綠假單胞菌(藥 敏質(zhì)控菌，上圖)和銅綠假單胞菌臨床多重耐藥菌株的抑菌試驗(yàn)(下圖)，其中試管編號(hào)1 為培養(yǎng)基對(duì)照(以NC表示，即陰性對(duì)照)；編號(hào)2-8為不同濃度(以yg/ml表示)NP-1 ;編 號(hào)9為細(xì)菌陽(yáng)性對(duì)照，以PC表示。細(xì)菌生長(zhǎng)以“ + ”表示，不生長(zhǎng)以表示。圖18. mNP-1對(duì)大腸桿菌的抑殺結(jié)果，其中80 y g/ml-5 u g/ml表不mNP-1的濃度， CK表示大腸桿菌對(duì)照。
圖19.轉(zhuǎn)mNP-Ι小球藻提取液對(duì)大腸桿菌的抑殺結(jié)果,其中含50 μ g/ml mNP-1的小球藻提取液以“TC”表示；非轉(zhuǎn)基因小球藻(野生藻)提取液以“CK”表示。圖20. mNP-Ι對(duì)幽門(mén)螺旋桿菌的抑殺結(jié)果。圖21. mNP-Ι對(duì)肺炎鏈球菌的抑殺結(jié)果，CK表示細(xì)菌對(duì)照。圖22. 1-10%的人血清對(duì)mNP-Ι的抑殺大腸桿菌生長(zhǎng)的活性沒(méi)有影響。圖23. mNP-Ι與從兔子中提取的天然NP-1對(duì)金黃色葡萄球菌抗菌效果比較結(jié)果。圖24. mNP-Ι與從兔子中提取的天然NP-I對(duì)肺炎鏈球菌抗菌效果比較結(jié)果。圖25. mNP-Ι與從兔子中提取的天然NP-I對(duì)銅綠假單胞菌抗菌效果比較結(jié)果。圖26. mNP-Ι與從兔子中提取的天然NP-I對(duì)大腸桿菌抗菌效果比較結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面參考實(shí)施例和附圖詳細(xì)描述本發(fā)明。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解的是， 下述實(shí)施例是舉例說(shuō)明的目的，其不應(yīng)以任何方式解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍由后附的權(quán)利要求所限定。各種限制性?xún)?nèi)切酶，DNA上樣緩沖液(6 X Loading Buffer)購(gòu)自TaKaRa公司；普通 Taq酶，plus 2000 Maker，DNA純化回收試劑盒，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；T4DNA 連接酶購(gòu)自NEB公司；葡萄糖及其他無(wú)機(jī)試劑均購(gòu)自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；鮭魚(yú)精DNA購(gòu)自Invitrogen公司；丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，購(gòu)自鼎國(guó)公司；SephadexG_50, Sephadex C-25 購(gòu)自 pharmacia 公司。實(shí)施例I.橢圓小球藻硝酸還原酶突變體的表達(dá)載體構(gòu)建方法根據(jù)Ubiquitin啟動(dòng)子序列(SEQ ID NO 1)設(shè)計(jì)引物，上游引物5’ CCGGAAGCTT GTGCAGCGTGACCCG3’ (SEQ ID NO 2):下游引物5’ GCCCGGATCCCTGCAGAAGT3 ’ (SEQ ID NO:
3)，其中在上游引物中加入Hind III酶切位點(diǎn)(下劃線(xiàn)標(biāo)出部分)，下游引物中加入BamH I酶切位點(diǎn)(下劃線(xiàn)標(biāo)出部分)，用PCR方法從玉米基因組中得到Ubiquitin啟動(dòng)子，測(cè)序結(jié)果顯示為Ubiquitin啟動(dòng)子序列(SEQ ID NO :4，其在SEQ ID NO :1的5’端及3’端分別添加了 Hind III酶切位點(diǎn)和BamH I酶切位點(diǎn))。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min， 94°C變性30s, 55°C退火30s, 72°C延伸2min, 30個(gè)循環(huán)結(jié)束后，72°C延伸IOmin0將PCR產(chǎn)物2007bp大小的片段，用HindIII和BamHI內(nèi)切酶雙酶切，質(zhì)粒pBI221 (Clontech)(圖I) 也經(jīng)HindIII和BamHI內(nèi)切酶雙酶切，然后將兩雙酶切產(chǎn)物16°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，在含有50mg/L氨芐霉素的LB培養(yǎng)基上37 °C倒置培養(yǎng)過(guò)夜，對(duì)長(zhǎng)出的抗性菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行Hind III和BamH I內(nèi)切酶雙酶切鑒定，能夠得到1987bp大小片段(即 Ubiquitin啟動(dòng)子)的質(zhì)粒即命名為pbinUGUS(圖2)。實(shí)施例2.利用pGreen0029框架來(lái)構(gòu)建表達(dá)載體。根據(jù)Nos終止子序列(SEQ ID NO 6)設(shè)計(jì)引物，上游引物:5，ATAAGAATGCGGCCGCTC GAATTTCCCCGATCGTTCAAAC3’ (SEQID NO 7)下游引物5，CGAGCTCGCCCGATCTAGTAACATAGATGA 3’(SEQ ID NO :8)其中在上游引物中加入Not I酶切位點(diǎn)(下劃線(xiàn)標(biāo)出部分)，在下游引物中加入Sac I酶切位點(diǎn)(下劃線(xiàn)標(biāo)出部分)，用PCR的方法從pBI221 (Clontech)中獲得了 Nos終止子，PCR反應(yīng)條件為94 V預(yù)變性3min，94 V變性30s，56 V退火30s，72 °C延伸30s， 30個(gè)循環(huán)結(jié)束后，72°C延伸lOmin。將PCR產(chǎn)物268bp大小的片段，用Not I和Sac I內(nèi)切酶雙酶切，質(zhì)粒pGreen0029(圖3，來(lái)自BBSRC)也經(jīng)Not I和Sac I內(nèi)切酶雙酶切，然后將兩雙酶切產(chǎn)物16°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，在含有50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基上37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜，對(duì)長(zhǎng)出的抗性菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行Not I和Sac I內(nèi)切酶雙酶切鑒定，能夠得到270bp左右大小片段(即Nos終止子)的質(zhì)粒即命名為pGreen0029nos (圖4)。實(shí)施例3.橢圓小球藻硝酸還原酶突變體的表達(dá)載體pGreen-NR-U-mNPl的構(gòu)建.按照常規(guī)技術(shù)，將Ubiquitin啟動(dòng)子(SEQ ID NO :I)從載體pbinUGUS(圖2) 中通過(guò)HindIII和BamHI雙酶切回收后，連接到同樣經(jīng)過(guò)HindIII和BamHI雙酶切的 pGreen0029nos載體上(圖4)獲得pGreen0029-U_nos初級(jí)中間載體(圖5)。通過(guò)化學(xué)合成方法合成帶有目的基因mNP-Ι的序列(其序列如SEQ ID NO 13)，為提高NP-I的抗病毒活性，在合成的過(guò)程中，在NP-I的N端添加了一個(gè)甲硫氨酸，將NP-I改造成了 mNP-1， 因mNP-Ι基因太小，為方便構(gòu)建載體，在該基因的C端添加了 75bp輔助序列，同時(shí)在基因的5’和3’端分別添上兩個(gè)酶切位點(diǎn)BamH I和Notl，最終得到合成的帶有mNP-Ι基因的 201bp序列(SEQ ID NO : 13)，將合成的序列(SEQ ID NO :13)通過(guò)BamH I和NotI雙酶酶切回收189bp的帶有mNP-1基因的片段，然后與經(jīng)同樣經(jīng)過(guò)BamH I和NotI雙酶酶切的載體 pGreen0029-U-N0S 連接(圖 5)，獲得載體 pGreen0029-U-mNPl-nos (圖 6)。最后通過(guò)HindIII酶切pSK-NR質(zhì)粒(含有硝酸還原酶表達(dá)框NR序列，小球藻NR基因序列已提交到GenBank，接收號(hào)為AY275834，NR表達(dá)框序列如SEQ ID NO 5所示，涉及pSK_NR質(zhì)粒及NR表達(dá)框的專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)CN1676597)，回收4518bp NR表達(dá)框片段，單酶切NR表達(dá)框和載體pGreen0029-U-mNPl-N0S，然后將它們相連，則構(gòu)建成橢圓小球藻硝酸還原酶突變體的 mNP-Ι 植物表達(dá)載體 pGreen-NR-U-mNPl (見(jiàn)圖 7)。實(shí)施例4.小球藻電擊轉(zhuǎn)化小球藻E4液體培養(yǎng)基見(jiàn)表4。小球藻固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基+7%瓊脂pH 5. 4 7. O。小球藻篩選培養(yǎng)基小球藻固體培養(yǎng)基的Na2NO2O. 69g/L替換為10mmol/L N03_，并添加抗生素G418至終濃度為15mg/L。取50ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的硝酸還原酶突變體小球藻nrm-4(公開(kāi)號(hào)CN 1676597A), 50 X g,離心 IOmin 離心收集藻細(xì)胞(Refrigerated Centrifuge CR 20B2, HIACHI);用高滲液(山梨醇O. 2M，甘露醇O. 2M)冰上處理l-3h ；50g離心IOmin,去上清，沉淀用5ml電擊緩沖液(山梨醇O. 2M，甘露醇O. 2M, KCL O. 08M, CaCL2O. 005M, HEPES O. 01M)懸浮，并用電擊緩沖液調(diào)細(xì)胞密度到I X IO6個(gè)/mL ;加入終濃度為10 μ g/mL的質(zhì)粒pGreen-NR-Ubi_mNPl和 25 μ g/mL的鮭精DNA，混勻，冰上放置5_10min后電擊，取400 μ I混合好的小球藻細(xì)胞放入電擊杯中，電擊。脈沖電壓為6-10. 5KV，脈沖持續(xù)時(shí)間分別為O. 001-0. 2s，脈沖次數(shù)為21CI， 脈沖距離為2mm,循環(huán)周期為100。電擊后將小球藻轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)(圖8)。實(shí)施例5.轉(zhuǎn)基因小球藻的分子檢測(cè)a.轉(zhuǎn)基因小球藻總DNA的提取挑取平板上的單藻落細(xì)胞接種于15mg/L G418液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，(25°C，光照 25001ux，120rpm)。2周后(濃度達(dá)到約為I X IO8個(gè)/mL)，1600g離心IOmin收集藻細(xì)胞， 在液氮中將細(xì)胞磨碎，參照文獻(xiàn)Chen et al.，(2001)的方法提取小球藻總DNA，提取的DNA存于-20°C備用。b.轉(zhuǎn)基因小球藻的PCR檢測(cè)以轉(zhuǎn)基因藻基因組DNA為模板，分別進(jìn)行NPTII基因(載體質(zhì)粒pGreen0029中的卡那抗性基因，序列為SEQ ID NO 14)和Ubiquitin啟動(dòng)子mNP-1-Nos終止子的PCR擴(kuò)增。檢測(cè) NPTII 基因的 PCR 引物為:正向引物 NPTII-f，5’GTCCTGATAGCGGTCCGCCAC3’ (SEQ ID NO 9);反向引物 NPTn-r，5' TCCGGTGCCCTGAATGAACT3，(SEQ ID NO :10)。PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，57°C退火40s，72°C延伸Imin 30s，30個(gè)循環(huán)結(jié)束后，72°C延伸IOmin0可以擴(kuò)增出約501bp的片段。Ubiquitin-mNPl-Nos的基因序列的 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增的引物分別為Ubi-852-L :5’-GCTCCTTCGCTTTCCCTTCC-3’ (SEQ ID NO: 11) ;Nos-2429-R :5’-GCGCTATATTTTGTTTTCTATCGCG-3’ (SEQ ID NO :12)。PCR 反應(yīng)條件為 94°〇預(yù)變性311^11，941變性30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，30個(gè)循環(huán)結(jié)束后，72°C延伸 IOmin0可以擴(kuò)增出約1578bp的DNA片段，即Ubiquitin-mNPl-Nos片段。共對(duì)9個(gè)藻株進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖9，10。轉(zhuǎn)化藻株1-9，能夠擴(kuò)增出外源 NPTII基因，在轉(zhuǎn)化藻株1-4和6-9中能夠擴(kuò)增出外源Ubiquitin-mNPl-Nos片段，在轉(zhuǎn)化藻株1-4和6-9中NPTII和Ubiquitin-mNPl-Nos片段都能夠擴(kuò)增出來(lái)。證明NPTII和 Ubiquitin-mNPl-Nos片段PCR均為陽(yáng)性的藻株為轉(zhuǎn)基因藻株，選取這些藻株進(jìn)行液體擴(kuò)繁培養(yǎng)，用以進(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)基因藻株的mNPl活性。實(shí)施例6.轉(zhuǎn)基因小球藻可溶性蛋白的提取用E4培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分見(jiàn)表4)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因藻，離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(濃度約為I X IO8個(gè)/mL)的細(xì)胞，約3g濕藻重，然后按濕藻重?zé)o菌水=I : I進(jìn)行混合。超聲破碎9s，間隔4s，破碎次數(shù)90次(JY92-II超聲細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波)，沸水煮IOmin使大分子量蛋白質(zhì)變性沉淀。4°C過(guò)夜后7500g離心lOmin，取上清液。表4培養(yǎng)基組成
權(quán)利要求
1.一種短肽mNP-1，其氨基酸序列為SEQ ID N0:16所示的序列。
2.編碼權(quán)利要求I所述短肽mNP-1的核酸，優(yōu)選地，其序列為SEQID NO: 15所示的序列。
3.表達(dá)載體或宿主細(xì)胞,其包含權(quán)利要求2所述的核酸。
4.藥物組合物，其包含權(quán)利要求I所述的短肽mNP-1或權(quán)利要求2所述的核酸和任選地藥用載體，優(yōu)選地，其為溶液、片劑、膠囊、霧劑、膏劑、粉劑、或注射劑的形式。
5.權(quán)利要求I所述的短肽mNP-1或權(quán)利要求2所述的核酸在制備抗細(xì)菌的藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中所述的細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和/或革蘭氏陰性細(xì)菌。
7.權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中所述的細(xì)菌為奈瑟氏菌屬(Neisseria)，葡萄球菌屬(Staphylococcus),李斯特菌屬(Listeria),假單胞菌屬(Psdeuomnoda),埃希氏菌屬(Escherichia),克雷伯氏菌屬(Klebsiella),沙雷氏菌屬(Serratia),嗜血桿菌屬 (Haemophilus),博德特氏菌屬(Bordetella),螺旋桿菌屬(Heliobacterium),鏈球菌屬 (Streptococcus),不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter),沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)。
8.權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中所述細(xì)菌為上述屬中的具體的細(xì)菌。
9.權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中所述細(xì)菌為淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae), 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),耐甲氧西林的金黃色葡萄菌(MRSA),銅綠假單胞菌(Pseudomonas Aeruginosa),泛耐藥銅綠假單胞菌,大腸桿菌(Escherichia coli),幽門(mén)螺旋桿菌(Heliobacterium chlorum),肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae),沙門(mén)氏菌(Salmonella)，大腸桿菌(Escherichia coli)。
10.生產(chǎn)權(quán)利要求I所述短肽mNP-1的方法，其特征在于在小球藻中表達(dá)序列為SEQID NO 15所示的核酸。
全文摘要
本發(fā)明利用小球藻表達(dá)了改造的兔防御素NP-1(mNP-1)，在小球藻中表達(dá)的防御素對(duì)革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌等具有很強(qiáng)的抑制或殺滅作用，也可殺滅耐藥菌。本發(fā)明的結(jié)果可應(yīng)用于制備抗革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌藥物，也可用于制備抗耐藥的超級(jí)細(xì)菌的藥物。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102603885SQ20111044506
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者儲(chǔ)成才, 孫勇如, 孫永華, 宋麗英, 尹維波, 張建中, 張英濤, 彭宜紅, 楊鶴鳴, 白麗莉, 胡贊民, 趙世民, 陳凡, 陳宇紅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所