專利名稱：：一種手足口病單、雙價(jià)滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域,涉及-一種疫兩及其制備方法，特別涉及-一種手足U病單、雙價(jià)滅活疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
：手足口病是由小RNA病毒科，腸道病毒屬病毒引起的，現(xiàn)己成為危害嬰幼兒健康和公共衛(wèi)生安全的重要傳染病。手足口病由柯薩奇病毒A4，A5，A9，Al.O，A16'B2，:B5和腸道病毒71等型別的腸道病毒引起，但主要由腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒16型(Cox.A1.6)引起。本病最普遍的特征是先頰粘膜出瘆，然后很快在手和足部出現(xiàn)。感染EV71和Cox.A16所引起的臨床癥狀，如手足U病、皰疹性咽峽炎，在臨床上難于區(qū)別。感染EV71常常并發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)炎癥，包括病毒性腦膜炎，腦炎，以及類似小兒麻痹的癱瘓，引起的肺水腫、腫出血經(jīng)常導(dǎo)致嬰幼兒的快速死亡。Cox.Ai6是引起心肌炎、心包炎、心肌病及其它嚴(yán)重疾病的重要病原。EV71病毒是1969年首次從美國加利福尼亞州患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒患者的糞便標(biāo)木巾分離出來的。自1974年Schmidt，Lennette，Ho首次報(bào)道以來，EV71已在世界范圍內(nèi)引起十多次爆發(fā)與流行。近年來，EV71病毒的流行在亞太地區(qū)猖獗，R本、新加坡、馬來西亞均有大規(guī)模爆發(fā)的報(bào)道,不僅發(fā)病人數(shù)多，而且死亡病例多。1.998年屮國臺(tái)灣地區(qū)EV71大爆發(fā)，發(fā)病129106例，旦:中，405例為嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，死T、-:78人。2000年，2001年臺(tái)灣地區(qū)又接連爆發(fā)手足口病，其中2000年，發(fā)病80677例，死亡'11人。中國大陸地區(qū)于i98i年由上海首次報(bào)道手足口病，此后，北京、山東、廣東等十幾個(gè)省份均有本病暴發(fā)流行的報(bào)道。2()()7年山東臨沂等地區(qū)發(fā)生手足口病流行，發(fā)病39606例，死亡14例。2007年，中國內(nèi)地共報(bào)告手足口病病例83344例，死亡17例。2008年3月安徽阜陽等地區(qū)開始爆發(fā)手足口病，至5月已發(fā)病6049例，353例重癥病例，死亡22例，同時(shí)，自2008年5月2R起，衛(wèi)生部將手足口病納入丙類法定傳染病管理。2008年全年，中國內(nèi)地共報(bào)告手足n病病例4.88955例，死亡126例。2009年手足n病疫情仍在屮國大陸不斷蔓延。流行病學(xué)資料顯示，Cox,A16—般和EV71相伴流行，在流行過程中，考慮到Cox,M6多導(dǎo)致無癥狀感染，nj能在流行中所占實(shí)際比例更高。臺(tái)灣地區(qū)1998，1999，2000年腸道病毒感染中EV7丄所占的比例分別為44.4%，2,0%，20,5%，Cox,Ai6所占的比例分別為18.2%，1.7%，18%。2()()8年安徽阜陽手足口病疫情發(fā)生后，中閨疾病預(yù)防控制中心在全國范圍內(nèi)病例標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果顯示，在582個(gè)手足口病病例陽性標(biāo)本中，EV71占54,5%,Cox,A16占17,4%。監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，EV71和Cox,A16傳播流行模式均是人規(guī)模爆發(fā)后隨之幾年靜止期。由EV71或Cox.A16引起的手足n病反復(fù)爆發(fā)可能是新的某因型在世界范圍內(nèi)傳播所致。對(duì)1970-2004年全球EV71分離株的分子流行病學(xué)分析顯示，EV71病毒分為3個(gè)基因型，即A，B，C型，8個(gè)基因亞型，即B1-B'l和C1-01亞型。EV71的基因亞型與分離地區(qū)和分離時(shí)間有---------定的關(guān)聯(lián)。對(duì)1983-2003年福島地區(qū)(Fukush丄ma，Japan)EV7丄和Cox,A丄6分4離株的系統(tǒng)發(fā)生重建證實(shí)，EV71分離株在基因特征上可分為8個(gè)不同組群(Bl'B2-3,B4，Cl，C2，C3，B5,C4)，B1、C-U1、C-U2、C-2、:B-'1、C-'1、B-5分別與1984、1987、1990、1993、1997、2000、2003年與EV7i相關(guān)手足口病爆發(fā)有關(guān)；對(duì)Cox,Ai6分離株進(jìn)行遺傳重建顯示，Cox,A16分離株形成了3個(gè)不同的遺傳簇(A，B，C)，A、B、C組群分別和1984-1994年(1985和1991年爆發(fā))，1987-1998(1988和1998年爆發(fā))，1995-2003(1995和2002年爆發(fā))流行相關(guān)，且在福島地區(qū)每次手足口病爆發(fā)中分離到的EV71和Cox.A1.6病毒株與日木其它地區(qū)和其它國家同期分離到的EV71病毒株屬于同--個(gè)組群。在中國臺(tái)灣地區(qū)，1998年之前EV71主要流行Bl亞型，1998年大爆發(fā)期流行的主要亞型是C2亞型，1999-2003年主要流行B4亞型，2004年以后主要流行C'4亞型。對(duì)1999-2004年中國深圳地區(qū)EV71和Cox.A16分離株進(jìn)行遺傳重建分析，表明EV71病辨主要流行C4亞型，Cox,M6病辨主要流行C型。2008年從安徽阜陽輕癥病例和重癥病例標(biāo)本中均分離到EV7i病毒C4亞型。從BV71感染到出現(xiàn)癥狀約為3-6天。第一個(gè)常見的癥狀為發(fā)燒。在發(fā)燒出現(xiàn)后的-^到兩天，病人常在口中出現(xiàn)瘡，手掌、腳底出現(xiàn)皮膚紅疹。有些病例，1貨是小T3歲的嬰幼兒，會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥，短期(2-4天)發(fā)燒后突然惡化，并在第12到24小時(shí)內(nèi)死亡。有報(bào)告指出猴子可在被EV71感染后14到20天內(nèi)產(chǎn)生IgM抗體。報(bào)告指出病童的快速死亡,通常發(fā)生在第7天，是由于他們無法及時(shí)產(chǎn)生足夠的屮和抗體。目前尚無有效的疫苗或藥物可防治EV71感染。EV71和Cox,A16病毒同脊髓灰質(zhì)炎病毒一樣屬f小RNA病辨科，腸道病T^J^。腸道病毒普遍具有很強(qiáng)的免疫原性，疫苗預(yù)防效果好。i954年和i956年脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活疫苗(Salk)和減毒活疫苗(Sabin)相繼研究成功，在預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎方面取得巨大成就，是全球繼消滅天花以后第2種被耍求消滅的病種。受到脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗的啟發(fā)和鼓舞，研制一種安全、有效的預(yù)防手足口病的疫苗是可行的。至今尚未闡明EV71和Cox.A16病毒的分子致病機(jī)制，使弱毒活疫苗的研制面臨巨人挑戰(zhàn)，人們寄希望于火活疫苗和基因工程疫苗的研制成功。綜觀國際上預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎的成功經(jīng)驗(yàn)，用安全、高效、優(yōu)質(zhì)的—價(jià)(1、II、III型)滅活疫苗對(duì)易感人群進(jìn)行預(yù)防接種是多血清型脊髓灰質(zhì)炎綜合防治中最有效的措施之--。在滅活疫苗的研制方面，國際上具有代表性的滅活疫苗標(biāo)準(zhǔn)制造技術(shù)己經(jīng)被建立。我閨冃前還沒有預(yù)防KV71和Cox.A16兩種病毒的手足口病滅活疫苗。由于近年來亞太地區(qū)EV71和Cox,A16引起的手足口病大肆流行，研制出預(yù)防EV71和Cox,A16的安全、高效的手足口病疫苗是預(yù)防手足口病急需解決的問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于公開一種可預(yù)防手足U病的腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病fTA16型(Cox.A16)的手足口病單、雙價(jià)滅活疫苗；本發(fā)明的目的還在f公開上述疫苗的制備力法。本發(fā)明冃的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明單價(jià)滅活疫苗由EV71抗原或Cox.A16抗原與Al(OH)3佐劑按下述重量百分比含^配制而成EV71抗原或Cox,A16抗原0,0015-0,002重量份Al(OH)3佐劑0.25-0.5重量份。本發(fā)明雙價(jià)滅活疫苗山EV71抗原和Cox,M6抗原與Al(0H)3佐劑按K述重量百分比含量配制而成-KV71抗原和Cox.A16抗原().()()l5-().()()2重量份Al(OH)3佐劑0,25-0,5重量份；其巾EV71抗原和Cox.A16抗原的比例為1.:1。本發(fā)明單、雙價(jià)疫苗的制備方法包括如下步驟a，選育手足n病疫苗株；b,建立并檢定疫尚'株-:級(jí)種子批庫；C,培養(yǎng)細(xì)胞；d，在細(xì)胞長成致密單層或微載休培養(yǎng)細(xì)胞成合適密度時(shí)，接種病毒；e,在細(xì)胞中增殖病毒；f,收集細(xì)胞所產(chǎn)生的病毒懸液，澄清過濾，去除細(xì)胞殘?jiān)籫，用滅活劑滅活病毒；h，超濾濃縮后的病毒懸液，通過凝膠過濾層析和離子交換層析純化病毒液，或者通過蔗糖密度梯度離心純化病毒液,得純化的病毒原液，即抗原；i,配制及檢定單、雙價(jià)滅活疫辨半成品及成品，測(cè)量疫兩的安全性、心效性及穩(wěn)定性。其中，b歩驟建立并檢定疫苗株三級(jí)種子批庫的方法為經(jīng)過噬斑純化的Vero細(xì)胞上的4代毒種原始種子批；驗(yàn)明原始種子批的記錄、歷史、來源和生物學(xué)特性；從原始種子批在Vcro細(xì)胞上傳至第5代為主種子批；主種子批在Vcro細(xì)胞上繼續(xù)傳代總次數(shù)不超過12代制備工作種子批。c步驟中所用的細(xì)胞可以是從ATCC引進(jìn)獲得常規(guī)用于增殖腸道病毒的任何細(xì)胞，優(yōu)選Vero細(xì)胞系的細(xì)胞，由工作Vero細(xì)胞庫復(fù)蘇，經(jīng)傳代擴(kuò)增得到；細(xì)胞的培養(yǎng)方法為將用于疫兩生產(chǎn)的Vero細(xì)胞系細(xì)胞在15L轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)以1:6比例分種,培養(yǎng)3天后接種腸道病毒；或者在發(fā)酵罐內(nèi)或在WAVE生物反應(yīng)器中進(jìn)行，其中，在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行時(shí)要使用微載休，使用濃度為卜i0g/L，優(yōu)選3g/L。d步驟中微載體培養(yǎng)細(xì)胞成合適密度是指細(xì)胞密度達(dá)到3Xl()7mi時(shí)接種病毒；以任何合適的感染復(fù)數(shù)接種病毒，優(yōu)選感染復(fù)數(shù)(M0I)為0.001-0,01。e步驟巾增值病毒的用于細(xì)胞生長的培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基，如1.99，MEM:，可以購買；或者按照己公開的配方配制；優(yōu)選無血清培養(yǎng)基或者培養(yǎng)基中應(yīng)盡可能少地加入蛋白，例如血清濃度低于2%,人血清白蛋白濃度低于0.1%;接種病毒后，按照常規(guī)方式培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選在含5%C02的培養(yǎng)箱中于34-351:培養(yǎng)細(xì)胞48-72小時(shí)。f步驟的具體方法為將細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到預(yù)定的時(shí)間后，通過常規(guī)方法收集，凍融3次，離心去除細(xì)胞沉渣，收獲病毒，通過濾器澄淸過濾，優(yōu)選濾器孔徑為0.45um。g步驟中滅活病毒可使用WHO規(guī)定的滅活劑和滅活條件采用甲醛作為滅活劑，優(yōu)選使用濃度l:4000，滅活溫度37"C，滅活時(shí)間為3天；或采用13-內(nèi)內(nèi)酯作為滅活劑，按1:4000在28。C滅活2天。h步驟中超濾濃縮時(shí)使用的超濾膜的截留分子量?jī)?yōu)選200-300KD，濃縮倍數(shù)優(yōu)選50-100倍。h步驟中病毒液純化的具體步驟為凝膠過濾層析和離子交換層析純化進(jìn)行凝膠過濾層析，介質(zhì)采用合適的凝膠過濾介質(zhì)，如德閨Merk公司生產(chǎn)的Hractolgel，T'衡液優(yōu)選pH6.5-7.5的PBS;再進(jìn)行離子交換S析，優(yōu)選使用弱陰離子交換介質(zhì)，例如Mcrck公司生產(chǎn)的FractogolEMDDEAE,緩沖鹽溶液優(yōu)選磷酸鹽緩沖系統(tǒng)，平衡緩沖液優(yōu)選鹽濃度范闈0.05-0.l.M，p朋.5-7.5，含0,06-0,12M的氯化鈉；洗脫緩沖液優(yōu)選鹽濃度0,05-0,1M,pII6,5-7,5，含0,2-0,4M的氯化鈉；或蔗糖密度梯度離心純化優(yōu)選使用不連續(xù)蔗糖密度梯度為15%、30%和65%,30(K)0g超速離心3小時(shí)后，收集15-35%蔗糖界面上的乳白色條帶；經(jīng)過上述純化后，細(xì)胞殘余DM含量低于丄00pg/ml，殘氽牛血淸含量低于50ng/'ml，得純化的BV71滅活病毒原液或Cox.A16滅活病毒原液，即卜:V71抗原或Cox.A16抗原。i步驟中的疫苗半成品和成品是指將上述滅活病毒原液配制成藥學(xué)接受的載體標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液，穩(wěn)定劑，稀釋劑，防腐劑，增溶劑；或配制成便于緩釋的劑型，或添加鋁鹽吸附佐劑，或注射劑型；優(yōu)選將上述純化的EV71火活病毒原液或Cox.A16火活病毒原液，按常規(guī)比例混合制備成單價(jià)或雙價(jià)的形式；或?qū)⒂杀景l(fā)明制得的疫苗與本領(lǐng)域屮的一種或多種疫苗制成聯(lián)合疫苗。其中，本發(fā)明疫苗的使llj劑t^為單價(jià):-一人份為0,5ml，含已滅活的EV7丄抗原或Cox,A丄6抗原丄，5-2ug，Al(OH)3佐劑().25-0.5mg;雙價(jià):.'人份為0,5ml，含已滅活的EV71抗原和Cox,A16抗原共1,5-2ug,其中EV71抗原禾nCox,A1.6抗原的比例為1:1，M—卿3佐齊IJ0,25-0,5mg。圖1:病毒EV71以MOI=0.1感染vero細(xì)胞的生長動(dòng)力學(xué)；圖2:病毒Cox,A16以■=0,1感染vero細(xì)胞的生K動(dòng)力學(xué);圖3:病毒EV7i以MOI=0.i感染Vero細(xì)胞的牛長穩(wěn)定性分析；圖4:病毒Cox.A16以M()i=().1感染VeTO細(xì)胞的生長穩(wěn)定性分析;圖5:手足口病病毒噬斑形態(tài)，左圖為中性紅，右圖為結(jié)晶紫染色結(jié)果(400X)。下述實(shí)驗(yàn)例或?qū)嵤├M(jìn)一步說明但不限于木發(fā)明。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:制備本發(fā)明手足U病滅活疫尚'1、腸道病毒EV71和Cox,A16錄株檢定(丄)病毒效價(jià)(V丄ralt丄traL丄on)測(cè)定采用Reed&Muench方法進(jìn)行測(cè)定，以能造成超過5()%的Vero細(xì)胞株呈現(xiàn)典型腸道病毒細(xì)胞病變現(xiàn)象的最高病毒稀釋倍數(shù)作為病毒效價(jià)值(TCID5。)以不含胎牛血清之199培養(yǎng)基為稀釋液，對(duì)待測(cè)病毒株作-----卜倍連續(xù)稀釋，所得不同稀釋倍數(shù)a-101(>)的病毒株每種稀釋倍數(shù)接種96孔組織培養(yǎng)板中單層Vero細(xì)胞株7(2X1(^細(xì)胞/孔)8個(gè)復(fù)L并接種同樣體積的199培養(yǎng)基為陰性對(duì)照。于含:"2%胎牛血清的199培養(yǎng)基、5%C()2及37E培養(yǎng)環(huán)境K共同培養(yǎng)。培養(yǎng)后，以顯微鏡觀察Vero細(xì)胞株于感染病毒株后所呈現(xiàn)典型腸道病毒細(xì)胞病變現(xiàn)象的結(jié)果，培養(yǎng)至細(xì)胞培養(yǎng)板中Vero細(xì)胞株產(chǎn)生之典型腸道病毒細(xì)胞病變現(xiàn)象不再增加時(shí)，采用Reed&Muetich方法，計(jì)算病毒效價(jià)值。.'般共M培養(yǎng)到第7天，判定EV71的TCIDs。效價(jià)二10"，Cox,A16效價(jià)二107'5。(2)病毒生長分析將單層Vero細(xì)胞株培養(yǎng)于含有2%胎牛血清的199培養(yǎng)基的24孔組織培養(yǎng)板中(l()5細(xì)胞/孔)，分別以().1M()I:之病毒株在37ITF共同培養(yǎng)1小時(shí)。以500uL含仃2%胎牛血清的新鮮199培養(yǎng)基替換培養(yǎng)板中原培養(yǎng)基，之后在5%C()2、37°CK共同培養(yǎng)。在生K曲線中每個(gè)測(cè)定的時(shí)間點(diǎn)，收集孔中所有內(nèi)含物。2000g離心6分鐘，收集上淸中病毒，存放于-7(TC，測(cè)定病毒效價(jià)，為胞外病毒效價(jià)。將沉淀加入原始培養(yǎng)基相M體積的培養(yǎng)基懸浮，凍結(jié)-融化三次，2000g離心6分鐘，收集k清中病毒，存放于-70°C，測(cè)定病毒效價(jià)，為胞內(nèi)病毒效價(jià)。所冇的病毒效價(jià)測(cè)定均在同--批次中測(cè)定，結(jié)果見附圖1和附圖2。(3)病毒傳代穩(wěn)定性分析選用病毒株在Vero細(xì)胞上第10代，第2r'"A—'A—'—'《病毒，分析其在Vero細(xì)胞上生K時(shí)的基因穩(wěn)定性(V:P1)和表現(xiàn)型的穩(wěn)定性(i力學(xué)分析)，見附圖3和附圖4。EV7i和Cox,A丄6疫苗株第i0代，第20代，第30代病毒的VP丄基因同源性與原代病毒比較均超過99.9%，基因比較穩(wěn)定。通過附圖3和附圖4可以看出，病毒生長比較穩(wěn)定，BV71的病毒效價(jià)峰值穩(wěn)定在TCID5。效價(jià)10"左右，Cox.A16的病毒效價(jià)峰值穩(wěn)定在TCID5。效價(jià)1(f'5左右。(4)病毒噬斑純化采用單伝法對(duì)已經(jīng)進(jìn)行病毒分離和初步鑒定的病毒進(jìn)行純化，將已經(jīng)長成Vero細(xì)胞單層的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板用不含血清的細(xì)胞維持液37。C浸泡1小時(shí)后傾棄，接種10倍倍比稀釋的病毒f細(xì)胞培養(yǎng)板中，感作1小時(shí)后用不含血清的細(xì)胞維持液洗滌1次，加40-42°C的含中性紅的營養(yǎng)瓊脂糖，厚度約2mm，凝固后f隊(duì)斑出現(xiàn)，或者約3-5天用結(jié)晶紫染色。挑斑后增殖病毒再作2輪純化，為純化的病iij.見圖5。2、手足口病滅活疫苗病毒株的選育分離手足口病病人臨床病料獲得手足口病病毒株，候選病毒株具有完整的記錄、歷史、來源。測(cè)定候選病毒的生物學(xué)特性，火活疫苗候選病毒株應(yīng)該具備病毒產(chǎn)量高、誘導(dǎo)免疫保護(hù)的能力強(qiáng)、交叉保護(hù)譜廣、穩(wěn)定的生物學(xué)特性，并依據(jù)流行病學(xué)和分子流行病學(xué)調(diào)査資料選擇的、當(dāng)前和今后fl.仃;''泛流行潛力的野生株。噬斑純化經(jīng)過篩選的候選病毒株，制備三級(jí)種了批庫，獲得工作種了批ft力。湖淀臨床感染康復(fù)病人血清的中和工作種了批病毒的能力。將工作種子批病毒免疫動(dòng)物，分離血淸后，測(cè)定血淸中和其他手足口病病毒毒株的能力，篩選保護(hù)譜廣、誘導(dǎo)保護(hù)能力強(qiáng)的病毒作為滅活疫苗病毒株。3、病毒種子批的建立和檢定疫苗生產(chǎn)用毒種應(yīng)以病毒種子批系統(tǒng)為基礎(chǔ)進(jìn)行三級(jí)管理，即原始種子批、主種子批和工作種子批。原始種子批為Vero上的4代毒種。原始種子批應(yīng)驗(yàn)明其記錄、歷史、來源和生物學(xué)特性。從原始種子批在Vero細(xì)胞上傳至第5代為主種子批,進(jìn)行全面檢定,主種了批在Vero細(xì)胞....匕繼續(xù)傳代制備工作種了批，在Vero細(xì)胞....匕傳代總次數(shù)不得超過12代。毒種保存在60°C以下。種子批檢定包括鑒別試驗(yàn)、無菌試驗(yàn)、病毒滴定、病毒外源因子檢査、免疫原性檢査等項(xiàng)目，檢定合格后方可使用。4、疫苗生產(chǎn)工藝流程細(xì)胞凍用非洲綠猴腎傳代細(xì)胞系(Vero細(xì)胞系)。該細(xì)胞由日木學(xué)者于1963年從非洲綠猴腎分離得到。第112代被送至美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院于1.998年10月從美國ATCC獲得1.20代Vero細(xì)胞,貯存和制備了原始種子庫、主細(xì)胞庫、丁作細(xì)胞庫，經(jīng)檢定，均符合《中國藥典(第3版)》及《中國生物制品規(guī)程》關(guān)于動(dòng)物細(xì)胞制備生物制品規(guī)程的要求。病毒制各EV7i和Cox,Ai6原始種子批、主種子批和工作種子批三級(jí)庫，。細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇工作庫細(xì)胞，將一只安瓶的細(xì)胞復(fù)蘇到一個(gè)151..轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)4-6天后，按照l:6的分種比例傳出6個(gè)轉(zhuǎn)瓶，如此傳代擴(kuò)增至50至200個(gè)15L轉(zhuǎn)瓶。細(xì)胞培養(yǎng)也可以在發(fā)酵罐內(nèi)或者在WAVE生物反應(yīng)器中進(jìn)行。在發(fā)酵罐內(nèi)可以使用微載體，例如，Pharmacia公司的Cytodexl11，使用濃度為優(yōu)選3g/L。該微載體適合于Vero細(xì)胞牛長，維持時(shí)間可達(dá)28天。在細(xì)胞密度達(dá)到3X1()7m]時(shí)摶種病毒，例如對(duì)培養(yǎng)3天的細(xì)胞ftiY病毒接種細(xì)胞培養(yǎng)3天后，棄去細(xì)胞踏)F上清，接種工作種子批病毒。病毒接種量為0,1M()I:，培養(yǎng)溫度37t:，培養(yǎng)時(shí)間30-'l()小時(shí)，病毒維持液為無血清或含0,1%人血清白蛋白的i99培養(yǎng)基。收獲病毒當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí),通過常規(guī)方法收集，凍融3次，離心去除細(xì)胞沉渣，由此收獲病毒。澄清過濾用0,45Pm的濾器過濾所有收獲i:清?；鸹畈《静《疽横娪肞-丙內(nèi)酯作為火活劑，按1:4000在28°C火活2天，然后37"C水解2h。超濾濃縮病毒用截留分子量200KD超濾膜，濃縮倍數(shù)100倍。凝膠過濾層析用p:H6,5-7,5的P:BS平衡S印harose6FpTM介質(zhì)進(jìn)行病毒純化，收集外水休積流穿峰。雜蛋白去除可達(dá)95%以上。離子交換層析采用S印harose卜十'TM介質(zhì)，平衡液為pH6.5-7.5、含有0,05-0,15M氯化鈉的PBS，洗脫液為含0.2-0.5M氯化鈉、p朋.5-7.5的PBS。未進(jìn)行病毒滅活步驟的疫苗生產(chǎn)過程中純化及除茼過濾結(jié)果見表l。表1未進(jìn)行病毒火活步驟的EV71和Cox,A16規(guī)模純化及除菌過濾結(jié)果批號(hào)B1T20081M51EV2O0810201CA加0810251病毒收獲液糊(L)350300380*度(1gCCIDb)8,07,77,8澄清體積(L)3402恥360滴度(lgCCID-)8,257,88,13.濃縮體積(L)1』l.胡0,9滴度(lgCCID-)10,49,肪10,59凝膠過濾體積(L)0,620.610,62滴魔(lgCCIDa》'9,259,6259,625離子交換體積a)0,820,830,83滴魔(igccin)9,259,6259,5除菌過濾體積化)0,90,9O,袋滴度agcan)9,1259,59,5配制純化后的EV71和Cox,A16火活病毒原液混合，配制注射劑，兩種火活病毒原液的配制比例為l:l(配制注射劑時(shí)是否需要加入佐劑？)。5、疫^純度分析根據(jù)《中國藥典(第3版)》及《中國生物制品規(guī)程》關(guān)f《傳代細(xì)胞作為生物制品細(xì)胞基質(zhì)規(guī)程》的要求，測(cè)定疫苗的外觀、無菌試驗(yàn)、DNA含量、蛋白質(zhì)含量、牛血淸蛋白殘留量、pH值、支原體檢査、病毒外源因子檢査等。結(jié)果見表2。表2疫苗成品檢定結(jié)果項(xiàng)目EVCA20瞧腿01EVCA幼081i20(M外觀遭明液#邇明液體無菌試驗(yàn)陰性H性鑒變』試驗(yàn)抓1CcmlA16EWl+Cox,A16鵬含s<卿溪/劑"00pg/翻內(nèi)毒蕭含量《咖HJ/劑<咖,』效力試鼈艦艦異常毒性試驗(yàn)通過邇過總s白含量《120g/#』《l加wg/湘牛血清蛋白殘留量《50ng/割'《50n接/擁支尿體檢査Ji過邇過病毒外澳因子檢査邇過通過PH7,137,136、疫苗效力分析采用:Reed&Muench法測(cè)定血清屮和效價(jià)。將待測(cè)抗血清56°C30分鐘滅活，以不含牛血清的199踏)'「基稀釋1-2n倍。將稀釋后樣品加入含有IOOTC:[Dm病毒(64-16()TCI:D5。/(),lm:l:,)，2%胎牛血清，相同體積的199培養(yǎng)基中4T孵育i2小時(shí)。將孵育后的混合液加入單層Verx)細(xì)胞的96孔組織培養(yǎng)板中(2Xl()4細(xì)胞/孔)，37"C孵育1小時(shí)。移除培養(yǎng)板巾培養(yǎng)基，加入100U1」2%胎牛血清的新鮮1.99培養(yǎng)基，5%C()2，37"C培養(yǎng)。以顯微鏡觀察，當(dāng)培養(yǎng)至板屮Vero細(xì)胞病變不增加時(shí)(第7天)，采)1JReed&Muench法計(jì)算抗血清中和效價(jià)。將本發(fā)明以上述方法制備的疫^免疫SPF小鼠和猴體，每只小鼠每次0,1mL，每只猴了每次0,5mL,間隔1'1天，免疫3次，末次免疫后15大采血，分離血清。免疫恒河猴后血淸于56°C30分鐘滅活進(jìn)行中和試驗(yàn)，測(cè)定血淸中和效價(jià)，結(jié)果見表3。表3疫苗成品免疫恒河猴產(chǎn)生的血清對(duì)腸道病毒臨床分離株的中和抗體效價(jià)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>7、安全性分析按照中國生物制品規(guī)程，使用清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的小鼠和豚鼠對(duì)制備的滅活疫苗進(jìn)行異常毒性試驗(yàn)，結(jié)果見表4。表4疫苗成品異常毒性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>取體軍:18-22g小鼠，注射前稱取每只小鼠體軍:。每批樣品用5只小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL測(cè)試疫W，觀察14天。取體重250-350g豚鼠,注射前稱取每只豚鼠體重。每批樣品用5只豚鼠，每只豚鼠腹腔汴射5.OmL測(cè)試疫苗，觀察i4天。進(jìn)行過敏原性試驗(yàn)，以牛血清為過敏試驗(yàn)的陽性對(duì)照，生理鹽水為陰性對(duì)照。每組5只豚鼠，分別T腹部皮下注射0.5mL。隔|.....I-^次，共3次，第3次注射后24天，耳靜脈給予相同物質(zhì)0.5mL,立即觀察注射后反應(yīng)，結(jié)果見表5。表5疫苗成品過敏原性試驗(yàn)結(jié)果錄論g苗合格，無致敏黡8、疫苗穩(wěn)定性分析將疫W成品放于41:，室溫(20-25°C),37°C6個(gè)月，觀察效力穩(wěn)定性、抗原穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、外觀穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果表明疫苗在4。CK存放穩(wěn)定。手足口病滅活疫苗4。C的效力穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果見表6。表6手足口病滅活疫苗4"C的效力穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果疫苗批號(hào)存放時(shí)間(月)調(diào)定中靡效價(jià)的病毒123458株W711:10241:20481:20481:;加481:10241:1024《Beijin驟08-1)EWA2加8110501Cox,A16(Shandong08-1》1:20481:M241:20481::1024l:加481:1024EVCA2008112001.EV71(Be復(fù)jin富08-1)l:20幼l:幼幼1:2048:10241:20481:1024C饑A161:20幼l:加48l':加幼1:'10241:20481:2048(Shand加g08-1》試驗(yàn)分組露鼠號(hào)加分鐘內(nèi)表現(xiàn)3天結(jié)果噱醺抓耳抽癱休寬死亡s蹄蹄蹄蹄蹄蹄權(quán)利要求一種預(yù)防手足口病的單、雙價(jià)滅活疫苗，其特征在于該單價(jià)滅活疫苗由EV71抗原或Cox.A16抗原與Al(OH)3佐劑按下述重量百分比含量配制而成EV71抗原或Cox.A16抗原0.0015-0.002重量份Al(OH)3佐劑0.25-0.5重量份；該雙價(jià)滅活疫苗由EV71抗原和Cox.A16抗原與Al(OH)3佐劑按下述重量百分比含量配制而成EV71抗原和Cox.A16抗原0.0015-0.002重量份Al(OH)3佐劑0.25-0.5重量份；其中EV71抗原和Cox.A16抗原的比例為1∶1。2.如權(quán)利要求1所述的申.、雙價(jià)滅活疫苗的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟a，選育手足n病疫苗株；b,建立并檢定疫^株—級(jí)種子批庫；C，培養(yǎng)細(xì)胞；d，在細(xì)胞長成致密單層或微載休培養(yǎng)細(xì)胞成合適密度時(shí)，接種病毒；e,在細(xì)胞中增殖病毒；f，收集細(xì)胞所產(chǎn)生的病毒懸液，澄清過濾，去除細(xì)胞殘?jiān)籫，用滅活劑滅活病毒；h，超濾濃縮后的病毒懸液，通過凝膠過濾層析和離子交換層析純化病毒液，或者通過蔗糖密度梯度離心純化病毒液，得純化的病毒原液，即抗原；i，配制及檢定單、雙價(jià)滅活疫W半成品及成品，測(cè)量疫兩的安全性、W效性及穩(wěn)定性。3.如權(quán)利要求2所述的單、雙價(jià)滅活疫苗的制備方法，其特征在f:其中b歩驟建立并檢定疫苗株三級(jí)種子批庫的方法為經(jīng)過噬斑純化的Vero細(xì)胞上的4代毒種原始種子批；驗(yàn)明原始種子批的記錄、歷史、來源和生物學(xué)特性；從原始種子批在VGro細(xì)胞上傳至第5代為主種子批；主種子批在Vcro細(xì)胞上繼續(xù)傳代總次數(shù)不超過12代制備工作種子批。4.如權(quán)利要求2或3所述的單、雙價(jià)火活疫苗的制備方法，其特征在于其屮c步驟屮所用的細(xì)胞是從ATCC引進(jìn)獲得常規(guī)JI:j于增殖腸道病毒的任何細(xì)胞，主要指Vero細(xì)胞系的細(xì)胞，由丁作Vero細(xì)胞庫復(fù)蘇，經(jīng)傳代擴(kuò)增得到；細(xì)胞的培養(yǎng)方法為將用f疫苗生產(chǎn)的Vero細(xì)胞系細(xì)胞在15L轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)以1:6比例分種，培養(yǎng)3大后接種腸道病毒；或者在發(fā)酵罐內(nèi)或在WAVE牛物反應(yīng)器中進(jìn)行，其中，在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行時(shí)要使用微載休，使用濃度為卜l()g/L，主要指3g/L。5.如權(quán)利嬰求2-4任--所述的單、雙價(jià)滅活疫苗的制備方法,其特征在孓其中d步驟巾微載體培養(yǎng)細(xì)胞成合適密度是指細(xì)胞密度達(dá)到3X1.06/ml時(shí)接種病毒；以任何合適的感染復(fù)數(shù)接種病毒，主要指感染復(fù)數(shù)(M0I)為0,001-0,01。6.如權(quán)利要求2-5任一所述的單、雙價(jià)滅活疫苗的制備方法，其特征在于其中e歩驟中增值病毒的用于細(xì)胞生長的培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基；或者按照己公開的配方配制；或者無血清培養(yǎng)基或者培養(yǎng)基中應(yīng)盡可能少地加入蛋白，例如血清濃度低f2%，人血清0蛋0濃度低于0.1%;接種病毒后，按照常規(guī)方式培養(yǎng)細(xì)胞，在含5%C02的培養(yǎng)箱中f34-35。C培養(yǎng)細(xì)胞48-72小時(shí)。7.如權(quán)利要求2-6仟--所述的單、雙價(jià)滅活疫苗的制備方法，其特征在于其中f步驟的具體方法為將細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到預(yù)定的時(shí)間后，通過常規(guī)方法收集,凍融3次,離心去除細(xì)胞沉渣，收獲病毒，通過濾器澄淸過濾,濾器孔徑為0,45um。8.如權(quán)利要求2-7任一所述的申.、雙價(jià)滅活疫苗的制備方法，其特征在于其中g(shù)步驟中火活病毒可使用WIIO規(guī)定的火活劑和火活條件釆用甲醛作為火活劑，使用濃度l:4000，滅活溫度37t:，滅活時(shí)間為3天；或采用丙內(nèi)酯作為滅活劑，按1:4000在28。C滅活2天。9.如權(quán)利要求2-8任一所述的單、雙價(jià)滅活疫苗的制備方法，其特征在f:其中h歩驟中超濾濃縮時(shí)使用的超濾膜的截留分子量為200-300KD，濃縮倍數(shù)為50-1()()倍。10.如權(quán)利耍求2-9任--所述的單、雙價(jià)滅活疫苗的制備方法,其特征在孓其巾h步驟巾病毒液純化的具體步驟為凝膠過濾層析和離子交換層析純化進(jìn)行凝膠過濾層析，介質(zhì)釆用合適的凝膠過濾介質(zhì)，平衡液為pH:6.5-7.5的PBS;再進(jìn)行離子交換S析，使用弱陰離子交換介質(zhì)，緩沖鹽溶液為磷酸鹽緩沖系統(tǒng)，平衡緩沖液為鹽濃度范圍0.05-0.1M，p朋.5-7.5，含0.06-0.12M的氯化鈉；洗脫緩沖液為鹽濃度().05-0,1M，pH:6,5-7,5，含0,2-0,'1M的氯化鈉;或蔗糖密度梯度離心純化使用不連續(xù)蔗糖密度梯度為15%、30%和65X，30000g超速離心3小時(shí)后，收集15-35%蔗糖界面上的乳白色條帶；經(jīng)過上述純化后，細(xì)胞殘余DNA含量低丁'100pgZml，殘余牛血淸含量低丁'50ng/ml，得純化的EV71滅活病毒原液或Cox.A16滅活病毒原液，即EV71.抗原或Cox,A16抗原。11.如權(quán)利要求2-10任--所述的單、雙價(jià)火活疫苗的制備方法，其特征在于其屮i步驟屮的疫苗半成品和成品是指將將純化病毒原液配制成包括藥學(xué)可接受的載體標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液，穩(wěn)定劑，稀釋劑，防腐劑，增溶劑；或配制成便于緩釋的劑型，或添加鋁鹽吸附佐劑，或注射劑型；將上述純化的EV7i滅活病毒原液和Cox.Ai6滅活病毒原液，按常規(guī)比例混合制各成單價(jià)或雙價(jià)的形式；或?qū)⒂杀景l(fā)明制得的疫苗與本領(lǐng)域中的一種或多種疫苗制成聯(lián)合疫苗。12.如權(quán)利耍求卜11任-'所述的單、雙價(jià)滅活疫苗在制備預(yù)防手足口病的藥物中的應(yīng)用。13.如權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征在于該疫苗的使用劑量為單價(jià)一人份為0.5ml，含已滅活的EV71抗原或Cox,A16抗原1.5-2ug'，Al線佐劑0.25-0.5mg;雙價(jià)一人份為0,5ml，含已滅活的EV71抗原和Cox,A16抗原共1,5-2ug,其中EV71抗原禾口Cox.A丄6抗原的比例為i:丄，Al(OH)3佐劑0.25-0,5mg。全文摘要本發(fā)明公開了一種可預(yù)防手足口病的腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A16型(Cox.A16)的手足口病單、雙價(jià)滅活疫苗及其制備方法，該疫苗首先選育了手足口病疫苗株；建立并檢定疫苗株三級(jí)種子批庫；培養(yǎng)細(xì)胞；接種并增殖病毒；收集病毒懸液；滅活病毒；超濾濃縮并純化病毒懸液，得疫苗原液；最終配制成單、雙價(jià)滅活疫苗。本發(fā)明單、雙價(jià)滅活疫苗在預(yù)防手足口病方面具有較好的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C12N7/04GK101695570SQ20091023659公開日2010年4月21日申請(qǐng)日期2009年11月3日優(yōu)先權(quán)日2009年11月3日發(fā)明者劉鑫,李敏,李曉楠,楊鵬輝,段越強(qiáng),王希良,羅德炎,趙忠鵬,邢麗,高嘯申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所;